朱萬龍, 賈 婷, 蔡金紅, 王政昆

(云南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 昆明 650500)

中緬樹鼩(Tupaiabelangeri)是東洋界小型哺乳動物，分布在熱帶和亞熱帶，是樹鼩屬中分布最北的一個種，中國南部及西南部可能是該種分布的北限[1]。在中國，中緬樹鼩主要分布于廣西、海南、貴州、云南、四川、西藏等地，主要生活于熱帶和亞熱帶森林、灌叢、村落附近。先前的研究表明橫斷山區(qū)的中緬樹鼩在形態(tài)及生理適應(yīng)特征上表現(xiàn)出某些過渡特征[2-5]。

遺傳多樣性的高低和氣候變化、環(huán)境改變密切相關(guān)，其受到很多因素的影響，如經(jīng)緯度、分布區(qū)域等[6]。線粒體DNA(mtDNA)是核外遺傳物質(zhì)，具有進(jìn)化速度快、非重組變異和母系遺傳等特點，是一種廣泛使用的分子標(biāo)記[7]。mtDNA多態(tài)性的研究主要解決種群的遺傳多樣性和探討形成該遺傳結(jié)構(gòu)的原因[8]。目前，樹鼩屬的遺傳多樣性研究在國內(nèi)研究較少[9]。本文通過測定中緬樹鼩線粒體Cytb基因全序列和線粒體控制區(qū)D-loop基因部分序列，對其遺傳多樣性進(jìn)行分析研究，為樹鼩的保護(hù)提供實驗依據(jù)。

1 研究方法

1.1 實驗動物

中緬樹鼩樣本捕自云南省昆明市祿勸縣屏山鎮(zhèn)(海拔1679 m，N25°25′～26°22′，E102°13′～102°57′)灌叢、劍川縣石龍村(海拔2500 m，N26°15′～26°45′，E99°40′～99°55′)果園、麗江地區(qū)(海拔2750 m，N26°40′23.5″，E99°48′41.3″)灌叢中。其中cytb基因的樣本數(shù)為49個，分別為祿勸31只(12♀∶19♂)，石龍村10只(3♀∶7♂)和麗江8只(4♀∶4♂)；D-loop基因的樣本數(shù)為33個，分別為祿勸21只(9♀∶12♂)，石龍村4只(1♀∶3♂)和麗江8只(4♀∶4♂)。

1.2 基因組DNA的提取

中緬樹鼩基因組DNA采用基因組DNA小量快速提取試劑盒 (博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司)提取。

1.3 細(xì)胞色素b基因的獲取

Cytb基因根據(jù)已報道中緬樹鼩Cytb基因的擴(kuò)增方法獲取[9]。

1.4 D-loop基因的獲取

D-loop基因的引物利用Primer Premier 5.0軟件來完成。引物覆蓋長度為1250 bp。引物序列為：XK_F：5′-acagtcaacacccaaagctgacatgc-3′；XK _R：5′-gtgctatgtcattatcgtggtctca-3′。擴(kuò)增體系為50 μL，含有5 μL的10×Buffer、1 μL的10 mmol/L dNTPs、20 μmol/ L引物各1 μL、25 mmol/ L MgCl22 μL、2 U Taq酶和50 ng左右的DNA模板。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃終止反應(yīng)。

1.5 PCR產(chǎn)物純化和測序

擴(kuò)增產(chǎn)物采用2%瓊脂糖電泳檢測，用Glassmilk DNA 純化回收試劑盒(博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司)進(jìn)行割膠回收、純化，回收產(chǎn)物送大連寶生物工程有限公司測序。

1.6 序列分析

所用序列均以Clustal X軟件[10]進(jìn)行排序。采用MEGA 4[11]計算堿基變異位點、簡約信息位點?；贙imura兩參數(shù)[12]，采用鄰接法(neighbor-joining method，NJ)[13]構(gòu)建鄰接樹，在MEGA 4軟件中完成。系統(tǒng)樹各分支的自舉檢驗值(Bootstrap)由1 000次重復(fù)檢驗所得。采用DnaSP5.0完成多樣性分析，采用TCS軟件完成單倍型間的進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞色素b序列分析

圖1 基于線粒體Cyt b基因全序列構(gòu)建的單倍型NJ樹

3個地方中緬樹鼩樣本中擴(kuò)增出cyt b全序列為1140 bp(n=49)。分析表明：多態(tài)性位點有47個，其中單變異位點23個，簡約信息位點24個；祿勸種群內(nèi)中緬樹鼩的遺傳距離為0%～1.7%，麗江種群內(nèi)遺傳距離為0%～1.1%，劍川種群內(nèi)遺傳距離為0%～1.2%，祿勸-麗江種群間的遺傳距離為0.1%～1.9%，劍川-麗江種群間的遺傳距離為0%～1.2%，祿勸-劍川種群間的遺傳距離為0.1%～1.9%，種間的遺傳距離略大于種內(nèi)的遺傳距離，且劍川與麗江種群間的遺傳距離更近。本研究共定義了24個單倍型(占總樣本數(shù)的48.98%)，其中種群間的共享單倍型有2個(8.33%)，為麗江-劍川種群所共享， 其余均為某個種群所特有單倍型多樣度范圍為0.80952 (劍川種群)～0.91532(祿勸種群)，核苷酸多樣度指數(shù)介于0.00326(祿勸種群)～0.00635(劍川種群)之間。利用24個單倍型構(gòu)建系統(tǒng)樹(圖1)，結(jié)果顯示3個地區(qū)的中緬樹鼩之間沒有明顯的分支，看不出3個地方種群之間的差異。

利用TCS軟件構(gòu)建單倍型間的進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)關(guān)系(圖2)，結(jié)果顯示：除LQ6和LQA1經(jīng)過的突變步驟較多以外，大多數(shù)祿勸種群的單倍型之間僅有一到兩步突變，而橫斷山種群(劍川、麗江種群)位于分支的末端，其需要更多地突變步驟才得以出現(xiàn)，說明這一突變方向可能是由祿勸種群到橫斷山種群，祿勸種群可能更接近祖先種。

圖2 基于Cyt b基因全序列構(gòu)建單倍型間的進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

2.2 D-loop區(qū)序列分析

3個地方中緬樹鼩樣本中擴(kuò)增的D-loop部分序列為745 bp(n=33)，分析表明：多態(tài)性位點有21個，其中單變異位點10個，簡約信息位點11個；祿勸種群內(nèi)的遺傳距離為0%～1.1%，麗江種群內(nèi)的遺傳距離為0%～1.1%，祿勸-麗江種群間的遺傳距離為0.3%～1.4%，劍川-麗江種群間的遺傳距離為0.1%～1.1%，祿勸-劍川種群間的遺傳距離為0.5%～1.2%，種間的遺傳距離略大于種內(nèi)的遺傳距離，且劍川與麗江種群間的遺傳距離更近。

本研究共定義了16個單倍型(占總樣本數(shù)的48.48%)，無種群間的共享單倍型，單倍型多樣度范圍為0.76615(祿勸種群)～0.93333(麗江種群)，核苷酸多樣度指數(shù)介于0.00269(祿勸種群)～0.00583(麗江種群)之間。利用16個單倍型構(gòu)建系統(tǒng)樹(圖3)，結(jié)果顯示3個地區(qū)的中緬樹鼩明顯分為兩支，一支全為祿勸種群，另一支除有1個祿勸單倍型(LQL0D5)外，全為劍川-麗江種群。

利用TCS軟件構(gòu)建單倍型間的進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)關(guān)系(圖4)結(jié)果顯示：除LQ L0D2經(jīng)過的突變步驟較多以外，大多數(shù)祿勸種群的單倍型之間僅有一到兩步突變，而橫斷山種群(劍川、麗江種群)位于分支的末端，其需要更多地突變步驟才得以出現(xiàn)，說明這一突變方向可能是由祿勸種群到橫斷山種群，祿勸種群可能更接近祖先種。

圖3 基于D-loop基因部分序列構(gòu)建的單倍型NJ樹

圖4 基于D-loop基因部分序列構(gòu)建單倍型間的進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

3 討論

物種遺傳多樣性的高低與其生存能力等密切相關(guān)。衡量一個種群mtDNA的遺傳變異有兩個重要指標(biāo)：單倍型間的平均遺傳距離(P)和核苷酸多態(tài)性(Pi)。由于Pi值考慮了各種mtDNA單倍型在群體中所占的比例，因此在反映一個群體的mtDNA的多態(tài)程度時比單純的遺傳距離平均值要精確，Pi值較高則說明群體的遺傳多樣性較高。遺傳多樣性越高，其生存能力等越大。相反，較低的遺傳多樣性可導(dǎo)致其生存能力等降低[14]。研究表明同種哺乳動物個體之間的平均核苷酸順序歧異值在0.3%到4%之間，最大時竟達(dá)10%以上[15]。在本研究中，無論利用Cytb基因還是利用D-loop基因均顯示橫斷山種群(劍川、麗江種群)擁有更高的遺傳多樣性，這可能與橫斷山地區(qū)擁有特殊的生態(tài)環(huán)境相對應(yīng)。在本研究中，無論利用Cytb基因全序列還是利用D-loop基因部分序列均顯示橫斷山種群(劍川、麗江種群)擁有更高地遺傳多樣性，這可能與橫斷山地區(qū)擁有特殊的生態(tài)環(huán)境相對應(yīng)。與其它保護(hù)物種相比，云南地區(qū)中緬樹鼩的遺傳多樣性較低(表1)，這種現(xiàn)象一方面可能與種類差異有關(guān)，另一方面可能與云南地區(qū)是中緬樹鼩分布的北限，使其適應(yīng)能力、生存能力降低，物種退化等有關(guān)。

表1 不同物種mtDNA核苷酸多樣性

Cytb基因的進(jìn)化速率適中，適合于種群水平差異的檢測，常常被用作為研究系統(tǒng)進(jìn)化和分類的分子標(biāo)記[24]。而D-loop基因，為不編碼基因，其DNA序列的進(jìn)化速度在線粒體基因組中最快，適合做種內(nèi)群體遺傳變異的研究。在本研究結(jié)果表明D-loop基因在分析種群的遺傳多樣性時更為有效。

關(guān)于現(xiàn)生樹鼩的起源假說有兩種：即“島嶼起源”假說和“大陸起源”假說。現(xiàn)生樹鼩中有6種樹鼩僅僅極限分布于婆羅洲及其附近島嶼，另外4種樹鼩也分布于該島嶼及其附近地區(qū)，而且值得注意的是與樹鼩(攀鼩目)為姐妹群的皮翼目也主要分布于婆羅洲等地區(qū)，這一分布特征強(qiáng)有力地支持“島嶼起源”假說[25-26]。然而，目前已經(jīng)在大陸發(fā)現(xiàn)幾種樹鼩的化石記錄，值得注意的是在中國元謀發(fā)現(xiàn)了Dendrogale和筆尾樹鼩的近親，遺憾的是僅僅發(fā)現(xiàn)牙齒，且沒有給出詳細(xì)的描述和圖片，如果這兩種樹鼩的近親確實存在于中國南部的中新世地層中，那么將強(qiáng)有力的支持“大陸起源”假說[27-29]。本研究結(jié)果顯示中緬樹鼩的變異方向很可能是從祿勸地區(qū)指向橫斷山地區(qū)，在一定程度上反應(yīng)了中緬樹鼩由南向北的擴(kuò)散模式，支持樹鼩“島嶼起源”這一假說。

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