張冕

(荊楚理工學(xué)院化工與藥學(xué)院，湖北荊門(mén) 448000)

丹皮酚(paeonolum，PAE)是毛茛科植物牡丹的根皮和蘿摩科植物徐長(zhǎng)卿全草的主要活性成分，具有鎮(zhèn)靜催眠、解熱鎮(zhèn)痛、抗菌、抗氧化、降血壓等多種藥理活性，臨床上用于治療風(fēng)濕痛、胃痛、濕疹、過(guò)敏性皮炎等，在牙膏、護(hù)膚品等日化方面也有應(yīng)用。PAE為酚類化合物，具有易揮發(fā)、水溶性差、見(jiàn)光易分解的特點(diǎn)［1］。羥丙基－β－環(huán)糊精(HP－β－CD)是一種良好的藥物載體，較β－環(huán)糊精(β－CD)具有水溶性好、毒副作用小、增溶效果顯著的優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)，環(huán)糊精包合技術(shù)在藥物增溶方面應(yīng)用廣泛，藥物經(jīng)包合后，通過(guò)改善溶解性能進(jìn)而提高生物利用度［2］。

Box－Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法可以提供3到10個(gè)因素，進(jìn)行低、中、高三水平的的二階實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，評(píng)價(jià)因素和指標(biāo)間的非線性關(guān)系，與國(guó)內(nèi)常采用的正交設(shè)計(jì)、均勻設(shè)計(jì)相比，具有精度高、預(yù)測(cè)性好、簡(jiǎn)單、直觀的優(yōu)點(diǎn)，目前已較多地用于藥物處方篩選、劑型制備過(guò)程、生物過(guò)程以及化學(xué)合成過(guò)程的優(yōu)化［3－5］。

本實(shí)驗(yàn)選取Box－Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法來(lái)進(jìn)行PAE－HP－β－CD包合物制備工藝的優(yōu)化設(shè)計(jì)，以提高PAE的溶解度，并采用相溶解度法、紅外光譜、薄層色譜對(duì)包合物進(jìn)行表征。

1 儀器與材料

梅特勒－托利多電子天平(上海梅特勒－托利多儀器有限公司);FD－101S集熱式磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司);Alpha2－4冷凍干燥機(jī)(德國(guó)Christ公司);SHZ－82水浴恒溫振蕩器(金壇市國(guó)旺實(shí)驗(yàn)儀器廠);Agilent1100高效液相儀(美國(guó)Agilent公司);Thermofisher傅立葉紅外光譜儀(賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司);ZF－1型三用紫外線分析儀(上海顧村電光儀器廠)。

PAE(江西吉安華美香料提煉廠，純度＞99%);PAE對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào): 110708－200506);HP－β－CD(進(jìn)口分裝，廣州羅蓋特中國(guó)有限公司贈(zèng)送);KBr(光譜純，北京博德恒悅科貿(mào)有限公司);甲醇為色譜純;其余試劑及試藥均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 包合物的制備［2－6］

按一定質(zhì)量比準(zhǔn)確稱取HP－β－CD和PAE，將PAE用適量無(wú)水乙醇溶解，將HP－β－CD置于燒杯中，加入適量蒸餾水，30℃水浴加熱攪拌(450 r·min－1)，使其形成飽和溶液。將PAE醇溶液緩慢滴加到包合材料水溶液中，滴加完畢后繼續(xù)在同條件反應(yīng)適當(dāng)時(shí)間。反應(yīng)完畢，反應(yīng)液減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醇，將剩余的水溶液冷凍干燥24 h，即得PAE－HP－β－CD包合物。

2.2 分析方法的建立

2.2.1 色譜條件

色譜柱:ZORBA×SB－C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm);流動(dòng)相:甲醇－水=45∶55;流速:1.0 mL ·min－1;進(jìn)樣量:20 μL;紫外檢測(cè)波長(zhǎng):275 nm;柱溫:室溫。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱定PAE對(duì)照品25 mg，加甲醇配制成濃度為1.0 mg·mL－1的儲(chǔ)備液。精密移取上述溶液適量，分別稀釋至10.0、25.0、50.0、75.0、100.0 μg·mL－1，照“2.2.1”項(xiàng)下條件測(cè)定，記錄色譜圖，以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=14698x+7091(r2=0.999 9)，可見(jiàn)PAE在10.0～100.0 μg·mL－1范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.2.3 方法專屬性考察

照上述色譜條件，分別注入HP－β－CD溶液、PAE對(duì)照品溶液和包合物溶液各20 μL進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明雜質(zhì)峰與藥物峰的分離良好，輔料及試劑不干擾主藥的含量測(cè)定，PAE的保留時(shí)間約為8.0 min。

2.3 包合率的計(jì)算

對(duì)包合物的評(píng)價(jià)一般以包合率為主要指標(biāo)。將所制備的包合物以蒸餾水溶解后定容，照上述分析方法進(jìn)行含量測(cè)定，按下式計(jì)算包合物的包合率:

2.4 包合物制備工藝的優(yōu)化［3－5］

2.4.1 Box－Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用Box－Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以包合率為響應(yīng)值，選取對(duì)包合物影響較為顯著的3個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化研究，并建立數(shù)學(xué)模型。實(shí)驗(yàn)中的3個(gè)因素分別記作X1，X2和X3，每個(gè)因素的低、中、高三水平分別記作－1、0、+1，試驗(yàn)的各因素水平見(jiàn)表1;利用Design Expert軟件建立的Box－Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。第13～17次試驗(yàn)為5次重復(fù)的中心點(diǎn)試驗(yàn)，用于考察模型的誤差。

表1 Box－Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素和水平

表2 Box－Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值(n=3)

續(xù)表2

2.4.2 二次回歸模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

分別采用多元線性和多元二項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型回歸分析因素X1、X2、X3對(duì)響應(yīng)值Y的影響。多元線性模型回歸結(jié)果:Y=78.99+3.05X1+1.39X2－1.71X3(R2=0.197 8=0.197 8);多元二項(xiàng)式模型回歸結(jié)果:Y=85.36+3.05X1+1.39X2－1.71X3+1.68X1X2－1.98X1X3+4.55X2X3－4.68－6.

對(duì)該二項(xiàng)式回歸模型進(jìn)行方差分析，見(jiàn)表3。由上述方程可知，對(duì)于包合物的包合率，二次多項(xiàng)式的擬合度要好于多元線性模型。該模型方程具有極顯著性(P＜0.000 1);校正決定系數(shù)0.940 4)，表明大約有94%的包合率變異分布在所研究的3個(gè)相關(guān)因素中，其總變異度僅有6%不能該模型來(lái)解釋;相關(guān)系數(shù)R為0.986 9(R2=0.973 9)，表明包合率的預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值之間有很好的擬合度;失擬差不顯著(P＞0.05)，表明方程的擬合不足實(shí)驗(yàn)不顯著，無(wú)明顯失擬因素存在，對(duì)模型是有利的。因此，該模型可用于對(duì)丹皮酚包合物的包合率進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

因素X1、X2、X3對(duì)包合效果的線性效應(yīng)顯著;因素、對(duì)包合效果的曲面效應(yīng)顯著，對(duì)包合效果的曲面效應(yīng)極其顯著;X1X3、X2X3對(duì)包合效果的交互影響顯著，X1X2對(duì)包合效果的交互影響不顯著。

表3 包合率回歸模型方差分析

續(xù)表3

2.4.3 響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化條件的確定

根據(jù)Design－Expert軟件繪制不同影響因素對(duì)于響應(yīng)值的三維曲線圖，見(jiàn)圖1。圖1為分別固定三個(gè)影響因素其中之一，考察其他兩個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值影響的曲面圖，該圖底部平面為等高線圖，等高線圖的重合區(qū)域用來(lái)進(jìn)行各影響因素的優(yōu)化。

根據(jù)Box－Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果，得到優(yōu)化條件為:包合時(shí)間為67 min，包合溫度為39℃，HP－β－CD與PAE的投料比為3.23∶1(質(zhì)量比)。為檢驗(yàn)Box－Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)所得結(jié)果的可靠性，根據(jù)上述優(yōu)化條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，制備3批樣品分別測(cè)定其包合率，理論值為86.7%，實(shí)測(cè)包合率的平均值為85.3%，相對(duì)偏差約0.58%，說(shuō)明此模型是可靠的。

圖1 各因素對(duì)包合率的響應(yīng)曲面圖

2.5 PAE－HP－β－CD包合物的驗(yàn)證

按最優(yōu)包合條件制備PAE－HP－β－CD包合物，對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。

2.5.1 相溶解度

相溶解度法可以確證包合物的形成，也是評(píng)價(jià)包合物溶解性能的最常用的方法。難溶性藥物包合后溶解度增大，通過(guò)測(cè)定藥物在不同濃度的HP－β－CD溶液中的溶解度，繪制溶解度曲線?？蓮那€判斷包合物是否形成，通過(guò)計(jì)算平衡常數(shù)

判斷包合物的穩(wěn)定性［1，2，6］。

將HP－β－CD加蒸餾水配成濃度分別為0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 mmol·L－1的溶液。取上述不同濃度溶液1 mL加入盛有過(guò)量PAE的5 mL容量瓶中，25℃條件下于超級(jí)恒溫水浴振蕩器中振蕩48 h，使溶液達(dá)到平衡后，靜置。取上清液濾過(guò)，棄去初濾液，取續(xù)濾液經(jīng)稀釋適當(dāng)倍數(shù)后進(jìn)行含量測(cè)定。參考Higuchi和Connors的方法，以PAE溶解度為縱坐標(biāo)，HP－β－CD濃度為橫坐標(biāo)做相溶解度圖，進(jìn)行線性回歸后計(jì)算穩(wěn)定常數(shù)K。

結(jié)果表明，隨著HP－β－CD濃度的增加，PAE溶解度呈線性增加，相溶解度曲線為AL型?；貧w方程為y=0.4696x+2.7982(R2=0.991 6)，穩(wěn)定常數(shù)K=315.6 L·mol－1，表明二者結(jié)合牢固。

2.5.2 紅外光譜分析［6］

取PAE、HP－β－CD、二者的物理混合物(按包合物比例制備)、包合物為樣品，以KBr壓片，在相同的條件下進(jìn)行紅外光譜掃描，掃描范圍為400～4 000 cm－1，如圖2。

紅外圖譜顯示，物理混合物圖譜表現(xiàn)為PAE圖譜和HP－β－CD圖譜的疊加，包合物圖譜與物理混合物的圖譜、PAE的圖譜相比較有很大區(qū)別，與HP－β－CD的圖譜比較類似，其中PAE的特征峰已基本消失，表明PAE已嵌入HP－β－CD的空腔內(nèi)部形成了包合物。

圖2 紅外光譜圖

2.5.3 薄層色譜分析［7－9］

取包合物100 mg適量于具塞試管中，加石油醚10 mL，超聲處理10 min，靜置，傾出上清液，為石油醚提取液(a)。殘?jiān)尤霟o(wú)水乙醇10 mL，超聲處理10 min，靜置，傾出上清液，此為無(wú)水乙醇提取液(b)。再取PAE對(duì)照品10 mg，加入無(wú)水乙醇溶解10 mL，作為對(duì)照品溶液(c)。二者的物理混合物(按包合物比例制備)100 mg加入無(wú)水乙醇10 mL，超聲處理10 min，靜置，傾出上清液，為物理混合物樣品(d)。

分別取上述四種溶液10 μL于同一塊硅膠G薄板上點(diǎn)樣，以甲苯－乙酸乙酯－冰醋酸(12∶4∶0.5)為展開(kāi)劑，在紫外線分析儀下觀察展開(kāi)結(jié)果，見(jiàn)圖3。樣品a無(wú)斑點(diǎn)，樣品b、c、d的斑點(diǎn)清晰可見(jiàn)。PAE易溶于石油醚，而其包合物不溶于石油醚，先用石油醚溶解游離的PAE，再用乙醇破壞包合物提取PAE，結(jié)果在石油醚中未見(jiàn)PAE的斑點(diǎn)，而乙醇提取液中有PAE的斑點(diǎn)。進(jìn)一步表明，PAE被HP－β－CD包合形成了新物相，PAE－HP－β－CD包合物已形成。

圖3 薄層色譜圖

3 討論

1)本實(shí)驗(yàn)采用飽和水溶液法制備PAE－HP－β－CD包合物，嘗試性采用Box－Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法對(duì)制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，這是一種采用多元二次回歸方程來(lái)擬合因素與響應(yīng)值之間函數(shù)關(guān)系的統(tǒng)計(jì)方法，可以評(píng)估因素的非線性影響。得到的最佳制備工藝條件為:包合時(shí)間67 min，包合溫度39℃，HP－β－CD、PAE投料比為3.23∶1(質(zhì)量比)。該方法合理、可靠、簡(jiǎn)便，能夠較好地預(yù)測(cè)PAE－HP－β－CD包合物的包合率，可用于制備工藝的優(yōu)化。

2)對(duì)所制得的包合物進(jìn)行了驗(yàn)證。包合物的溶解度達(dá)到了9.75 mmol·L－1，與純水中PAE的溶解度2.50 mmol·L－1相比提高了約4倍。同時(shí)，紅外光譜與薄層色譜的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明PAE嵌入了HP－β－CD的空腔內(nèi)部，被HP－β－CD包合形成了新物相，包合物已形成。

3)已有許多文獻(xiàn)報(bào)道包合物能改善藥物的溶解性與穩(wěn)定性，對(duì)于包合物的釋放性能及相關(guān)影響因素有待進(jìn)一步考察。

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