宋文靜，白仁奧，何傳波，魏好程，馬 英，熊何健

(1.集美大學(xué) 生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；2.集美大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021)

生物活性肽是介于氨基酸與蛋白質(zhì)之間的分子聚合物，由天然氨基酸以不同的組成和排列方式構(gòu)成，分子質(zhì)量一般小于 6 000 u，在空間構(gòu)象上比較松散，是一類對(duì)生物機(jī)體的生命活動(dòng)有益或具有特定生理作用的多功能化合物[1].許多生物活性肽具有良好的理化性質(zhì)，使得它們?cè)谝恍?yīng)用上比氨基酸和蛋白質(zhì)更加廣泛.作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，一些小肽的吸收速率比同一組成的氨基酸快，而且多肽溶液與相對(duì)應(yīng)的氨基酸溶液相比較，具有較低的滲透壓，口服時(shí)不易引起腹瀉.多肽良好的水溶性和易吸水的特性，可以作為食品添加劑中優(yōu)良的保濕劑.另外，生物活性肽具有多方面的生物活性功能，如抗微生物、降血壓(ACE抑制)、抗氧化、細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)和腫瘤抑制活性[2-6].

文蛤是我國(guó)主要的灘涂經(jīng)濟(jì)貝類之一，富含蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物以及鈣、鉀、鎂、磷、鐵等多種人體所需的礦物質(zhì)[7].近年來(lái)的研究表明，文蛤含有多種天然活性物質(zhì)，具有多方面的生理調(diào)節(jié)功能.文蛤中多糖類物質(zhì)具有增強(qiáng)免疫和調(diào)節(jié)血糖的功效，文蛤中天然多肽和蛋白質(zhì)也表現(xiàn)出較強(qiáng)的腫瘤抑制活性、抗氧化活性、ACE酶抑制活性等[8-11].

本研究通過(guò)用蛋白酶對(duì)文蛤蛋白進(jìn)行水解，制備抗氧化活性肽，提高文蛤的資源利用率和經(jīng)濟(jì)附加值，有利于促進(jìn)文蛤養(yǎng)殖、加工產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮活文蛤，購(gòu)于廈門市集美區(qū)，-18 ℃冷凍4 h后取肉、去內(nèi)臟，絞成肉糜，分裝后于-18 ℃凍存.

復(fù)合蛋白酶(Protamex)、中性蛋白酶(Neutrase)和堿性蛋白酶(Alcalase 2.4 L)購(gòu)于諾維信(中國(guó))生物技術(shù)有限公司；風(fēng)味蛋白酶(Flavourzyme)和木瓜蛋白酶(Papain)，購(gòu)于廣西龐博生物工程有限公司.福林酚試劑，甲醛，乙酸乙酯，TFA等所用化學(xué)試劑無(wú)特殊說(shuō)明，都為分析純(AR).

UDK132自動(dòng)凱氏定氮儀：意大利VELP公司；Lab Scale Millipore超濾系統(tǒng): Millipore；Ultimate 3000 高效液相色譜儀：DIONEX；4800 型質(zhì)譜儀：Applied Biosystem.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 水解液多肽粉的制備

文蛤肉用復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和木瓜蛋白酶在其最佳水解條件下分別水解1～5 h，85 ℃滅酶15 min，冷卻后 5 000 r·min-1離心20 min，取上清液冷凍干燥，收集多肽粉凍存于-20 ℃冰箱.

1.2.2 多肽粉分子量分布的測(cè)定

HPLC分析條件：DIONEX Ultimate 3 000 HPLC，TSK gel G 2 000 SWXL( 7.8 mm×300 mm)凝膠柱，流動(dòng)相為V(乙腈)∶V(超純水)∶V(TFA)=45∶55∶0.1，流速為0.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm.

1.2.3 DPPH自由基(DPPH·)清除活性的測(cè)定

用95%乙醇配制濃度為0.2 mmol/L的DPPH溶液，取2 mL一定濃度的樣品溶液，加入2 mL上述濃度的DPPH溶液，震蕩混勻，避光室溫放置30 min，在517 nm測(cè)定吸光值，記為Ai；對(duì)照組取2 mL 95%乙醇加入2 mL DPPH溶液，吸光值記為Ac；2 mL一定濃度的樣品溶液加入2 mL 95%乙醇混勻后測(cè)定的吸光值記為Aj；以2 mL蒸餾水加2 mL 95%乙醇調(diào)零.

建議給涉農(nóng)企業(yè)和人員建立單獨(dú)的“數(shù)據(jù)采集平臺(tái)”，將所有涉稅信息進(jìn)行上傳，有關(guān)部門信息共享，工作人員會(huì)比較迅速和準(zhǔn)確地進(jìn)行處理，及時(shí)做出反應(yīng)和判斷，做好稅收管理各項(xiàng)工作，提升執(zhí)行力度和速度。涉農(nóng)企業(yè)及人員也應(yīng)盡量配合“平臺(tái)”運(yùn)轉(zhuǎn)，按照要求及時(shí)登錄“平臺(tái)”，必要時(shí)機(jī)關(guān)指派專人協(xié)助完成此項(xiàng)工作，將票據(jù)和數(shù)據(jù)等整理后上傳平臺(tái)并做好相關(guān)信息登統(tǒng)工作。合理、科學(xué)地運(yùn)用現(xiàn)代化技術(shù)進(jìn)行稅收管理，既能更加快速地通知企業(yè)、人員享受最新的稅收優(yōu)惠政策，也強(qiáng)化了稅收管理力度，打擊非法偷逃稅行為，共同營(yíng)造公平公正的納稅環(huán)境，保護(hù)涉農(nóng)企業(yè)和人員的合法權(quán)益。

1.2.4 超濾膜分離抗氧化多肽組分

將制備的文蛤多肽粉用超純水溶解，配制多肽溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾.然后依次過(guò)截留分子質(zhì)量(MWCO)為8 ku和截留分子質(zhì)量為5 ku的超濾膜，將木瓜蛋白酶分成分子質(zhì)量大于8 ku，5 ku至8 ku和小于5 ku 3部分，并將其分別凍干，測(cè)定各個(gè)組分在1 mg·mL-1質(zhì)量濃度下對(duì)DPPH自由基的清除率.

1.2.5 Sephadex G-25凝膠色譜柱分離抗氧化多肽組分

將處理過(guò)的葡聚糖凝膠Sephadex G-25裝入2.5 cm×60 cm玻璃柱，用蒸餾水過(guò)夜平衡，將DPPH清除活性最高的活性肽超濾組分用超純水溶解，配制多肽溶液，并經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾、上柱，用蒸餾水以60 mL/h流速洗脫，每管收集4 mL洗脫溶液，將收集的組分用紫外可見光分光光度計(jì)測(cè)定其280 nm處吸光度，并繪制吸光度曲線，按照先后順序收集洗脫峰，冷凍干燥，并測(cè)定其DPPH·清除率.

1.2.6 RP-HPLC分離抗氧化多肽

將DPPH·清除率最高的Sephadex G-25凝膠分離組分用超純水溶解，配制多肽溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，用高效液相色譜儀DIONEX-Ultimate 3000(VWD-3400RS檢測(cè)器)進(jìn)行進(jìn)一步地分離純化[16].分離純化條件如下：色譜柱Waters SunFire C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，上樣量100 μL，流速0.6 mL/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm，線性梯度洗脫為乙腈(含0.1%TFA)5%至35%，洗脫54 min.收集各個(gè)組分峰，冷凍干燥，并測(cè)定各個(gè)組分峰的DPPH自由基清除率.

1.2.7 文蛤抗氧化多肽相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定、結(jié)構(gòu)鑒定

完成一級(jí)MS后，直接選擇與對(duì)照基質(zhì)有差異的肽段進(jìn)行MS/MS分析，采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS,Applied Biosystem 4800，USA)對(duì)抗氧化肽一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析鑒定[13].

1.2.8 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)都以平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表示，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果采用 SPSS 軟件進(jìn)行方差分析(ANOVA)，P<0.05的顯著水平結(jié)果被采用.

表1 5種蛋白酶不同酶解時(shí)間水解產(chǎn)物的DPPH·清除率

2 結(jié)果與分析

2.1 5種蛋白酶水解產(chǎn)物的DPPH·清除活性

表1比較了5種蛋白酶不同酶解時(shí)間水解產(chǎn)物的DPPH·清除率(%)，樣品測(cè)定質(zhì)量濃度為1 mg/mL.結(jié)果顯示，5種蛋白酶水解產(chǎn)物清除DPPH自由基強(qiáng)弱順序依次是：木瓜蛋白酶(Papain)>堿性蛋白酶(Alacalase 2.4 L)>風(fēng)味蛋白酶(Flavourzyme)>中性蛋白酶(Neutrase)>復(fù)合蛋白酶(Protamex)，其中，木瓜蛋白酶4 h水解產(chǎn)物的DPPH·清除率最高，達(dá)55.74%，故選用該水解產(chǎn)物進(jìn)行后續(xù)抗氧化活性肽的篩選.

2.2 水解產(chǎn)物分子量分布

以細(xì)胞色素C、aprotinin、GSSG、GSH為標(biāo)準(zhǔn)品，洗脫體積為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖1所示，線性良好.

木瓜蛋白酶在其最佳水解條件下水解文蛤蛋白4 h，測(cè)定其水解產(chǎn)物中肽的分子質(zhì)量分布(見表2).結(jié)果表明，分子質(zhì)量低于 5 000 u的肽占95%以上.

2.3 抗氧化活性組分的分離純化

2.3.1 超濾法分離純化抗氧化多肽

木瓜蛋白酶水解產(chǎn)物依次過(guò)截留分子質(zhì)量(MWCO)為8 ku和5 ku的超濾膜，獲得分子質(zhì)量大于8 ku(Ⅰ)、5 ku至8 ku(Ⅱ)、小于5 ku(Ⅲ)3個(gè)組分，表3顯示的是3組分的DPPH·清除率.結(jié)果表明，水解產(chǎn)物中分子質(zhì)量小于5 ku的產(chǎn)物具有較好的DPPH自由基的清除率，且該組分水溶性好，樣品較均一，有利于后續(xù)的分離純化，因此，選用該組分進(jìn)行后續(xù)的組分分離操作.

表2 木瓜蛋白酶4 h水解產(chǎn)物分子質(zhì)量分布

表3 木瓜蛋白酶水解產(chǎn)物超濾組分的DPPH·清除率

2.3.2 凝膠層析法分離純化抗氧化多肽

將超濾后分子質(zhì)量小于5 ku的樣品用Sephadex G-25凝膠色譜柱進(jìn)行層析分離，得到4個(gè)主要組分PA、PB、PC和PD(如圖2).它們對(duì)DPPH·的清除率依次為：(45.74±1.38)%、(61.53±1.68)%、(11.65±0.86)%和(16.3±1.12)%(見圖3).峰PB清除DPPH·的活性最強(qiáng)，將此組分利用RP-HPLC進(jìn)行進(jìn)一步的分離.

2.4 RP-HPLC分離抗氧化多肽

圖4顯示的是組分PB進(jìn)行RP-HPLC純化分離的色譜圖，按照出峰的先后順序收集了12個(gè)組分，收集并凍干樣品，測(cè)定不同組分對(duì)DPPH·清除率得到如圖5所示結(jié)果，結(jié)果顯示，PB4對(duì)DPPH自由基的清除率最高，為(71.41±1.1)%，對(duì)應(yīng)的樣品為圖4所示的4號(hào)峰.

2.5 抗氧化多肽的結(jié)構(gòu)鑒定

2.5.1 組分PB-4的質(zhì)量指紋圖譜

圖6為MAILDI-TOF/TOF MS測(cè)定的PB-4組分的一級(jí)質(zhì)譜圖，即分子量質(zhì)譜圖.圖譜顯示組分PB-4的分子質(zhì)量分布在(800～1 500)u之間.

實(shí)驗(yàn)采用MAILDI-TOF/TOF MS結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜儀(TOF-MS/MS)的方法分析PB-4組分的氨基酸序列.在組分PB-4一級(jí)質(zhì)譜的基礎(chǔ)上，我們選取所有可能的目的肽段，對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行進(jìn)一步的分析鑒定，得到4個(gè)符合要求的目的多肽，其TOF-MS/MS圖譜如圖7所示，它們的氨基酸序列分別是：LNFNLEKSR(1 120.3 u)、SWLRPR(814.4 u)、RIGNIISQY(1 063.3 u)和LNFNLEK(877.2 u).

3 討論

蛋白質(zhì)水解時(shí)，由于蛋白酶的酶切位點(diǎn)的差異和水解度的不同，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物的肽鏈長(zhǎng)度、暴露的氨基酸基團(tuán)、分子質(zhì)量分布等的不同，因而產(chǎn)物抗氧化活性也不同.Ajibola等[14]發(fā)現(xiàn)非洲涼薯種子蛋白水解產(chǎn)物中分子質(zhì)量小于 1 000 u的肽段抗氧化活性更強(qiáng).Li等[15]報(bào)道的鷹嘴豆蛋白水解產(chǎn)物抗氧化活性最強(qiáng)的組分，其分子質(zhì)量分布主要介于200～3 000 u；Zhong等[16]在水解白鰱內(nèi)臟蛋白的研究中，發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量小于1 ku的組分具有最佳的自由基清除能力.Ajibola等發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量小于 1 000 u的肽段抗氧化活性最強(qiáng)，其中疏水性氨基酸和芳香族氨基酸在抗氧化活性中起重要作用，可能是因?yàn)檫@些疏水性氨基酸提高了非極性環(huán)境下多肽的溶解性，促進(jìn)其與自由基的相互作用進(jìn)而清除自由基.本研究用復(fù)合蛋白酶(Protamex)、中性蛋白酶(Neutrase)、木瓜蛋白酶(Papain)、堿性蛋白酶(Alcalase2.4 L)和風(fēng)味蛋白酶(Flavorzyme)5種蛋白酶單酶水解文蛤蛋白，并測(cè)定其不同酶解時(shí)間水解產(chǎn)物的DPPH·清除率，結(jié)果表明木瓜蛋白酶4 h水解產(chǎn)物的DPPH清除率最高，該水解產(chǎn)物中分子質(zhì)量小于5 ku的肽組分占95.78%，DPPH清除率達(dá)到52.31%.進(jìn)一步地用超濾、凝膠色譜柱層析和RP-HPLC進(jìn)行分離，并進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，得到4個(gè)目的多肽：LNFNLEKSR( 1 120.3 u)、SWLRPR(814.4 u)、RIGNIISQY( 1 063.3 u)和LNFNLEK(877.2 u).這4段多肽中疏水性氨基酸(HAA)和芳香族氨基酸(AAA)占絕大部分，其中Leu、Phe，Ile等疏水性氨基酸最多.

4 結(jié)語(yǔ)

木瓜蛋白酶水解文蛤蛋白的水解產(chǎn)物具有較高的抗氧化活性，其中分子質(zhì)量小于 3 000 u的多肽具有更強(qiáng)的抗氧化活性，分離純化后得到的4種符合要求的目的多肽，它們的氨基酸序列如下：LNFNLEKSR( 1 120.3 u)、SWLRPR(814.4 u)、RIGNIISQY( 1 063.3 u)和LNFNLEK( 877.2 u).

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