陳 江，逯心敏，郭 渝，胡 偉

（四川省宜賓市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川宜賓 644000）

羊水ABH血型物質(zhì)測(cè)定與ABO血型基因分型＊

陳 江，逯心敏，郭 渝，胡 偉

（四川省宜賓市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川宜賓 644000）

目的通過(guò)檢測(cè)羊水ABH血型物質(zhì)和序列特異性引物-聚合酶鏈反應(yīng)（PCR-SSP）基因技術(shù)檢測(cè)胎兒羊水細(xì)胞ABO血型基因型，鑒定胎兒ABO血型。方法選取妊娠16～25周的孕婦53例，抽取羊水，利用間接凝集實(shí)驗(yàn)測(cè)定羊水ABH血型物質(zhì)；將羊水細(xì)胞進(jìn)行分離，提取羊水細(xì)胞DNA，運(yùn)用PCR-SSP技術(shù)分析其ABO血型基因型。結(jié)果16例羊水標(biāo)本為非分泌型，占30.2%，37例羊水標(biāo)本為分泌型，占69.8%；48例羊水標(biāo)本通過(guò)PCR-SSP方法檢測(cè)出了ABO血型的基因型。經(jīng)基因鑒定的胎兒羊水細(xì)胞ABO血型與羊水分泌型ABH血型物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果一致。結(jié)論P(yáng)CR-SSP技術(shù)可以準(zhǔn)確地檢測(cè)胎兒羊水細(xì)胞的ABO血型。

ABO血型系統(tǒng)；羊水；細(xì)胞；序列特異性引物-聚合酶鏈反應(yīng)；ABH血型物質(zhì)

母嬰血型不合，可引起胎兒或新生兒時(shí)期的免疫性溶血病。母體產(chǎn)生的免疫抗體，通過(guò)胎盤進(jìn)入胎兒體內(nèi)，可使胎兒紅細(xì)胞凝集，發(fā)生溶血，引起死胎、死產(chǎn)、出生缺陷及新生兒溶血病［1－2］。為了有效預(yù)防新生兒溶血病的發(fā)生，產(chǎn)前確定胎兒血型十分必要，為此本文抽取了53例孕婦羊水，通過(guò)測(cè)定胎兒羊水ABH血型物質(zhì)和序列特異性引物－聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction with sequence specific primes，PCR-SSP）基因分型檢測(cè)胎兒羊水細(xì)胞ABO血型，來(lái)判斷胎兒血型。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2011年3～10月在本院孕16～25周、年齡21～38歲的孕婦53例，采集羊水（雙方簽署知情同意書），每人2份，取樣注意避免母血污染。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑與材料 抗血清：抗A效價(jià)1∶64，抗B效價(jià)

1∶128，抗 H效價(jià)1∶32，購(gòu)自長(zhǎng)春博德；PCR-SSP ABO血型試劑，購(gòu)自天津秀鵬生物技術(shù)開發(fā)有限公司；DNA提取試劑，購(gòu)自杭州博日科技有限公司。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)抗血清制備 （1）標(biāo)記試管：3排18支，分別抗A、抗B及抗 H。每排再標(biāo)2、4、8、16……。（2）稀釋：每管加生理鹽水50μL。每排第1管對(duì)應(yīng)加抗A、抗B及抗H血清50μL，倍量稀釋成2、4、8、16……稀釋液。（3）加2%懸紅：每排各管對(duì)應(yīng)加懸紅50μL，振搖混勻，1 400r／min，離心15s。（4）結(jié)果：以3＋為標(biāo)化血清的最適稀釋度。

1.2.3 羊水ABH血型物質(zhì)測(cè)定 （1）無(wú)菌抽取羊水5～10mL，經(jīng)1 400r／min離心5min后留取上清液備用。（2）排列試管3支，分別標(biāo)明A、B、H，3管各加羊水1滴，每管加相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)抗血清1滴?；靹颍檬覝?，中和10min。（3）每管加相應(yīng)2%標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞懸液1滴，混勻，1 400r／min離心15s，觀察結(jié)果。

1.2.4 羊水細(xì)胞培養(yǎng) 取羊水專用培養(yǎng)基［3］，加入新鮮小牛血清（56℃，30min滅活補(bǔ)體），使終濃度達(dá)到10%。將5～10mL羊水接種于上述培養(yǎng)基中，置5%CO2孵箱中，37℃飽和濕度下培養(yǎng)，每隔48h換培養(yǎng)基。培養(yǎng)3～5d后，在倒置顯微鏡下觀察，如細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好。大部分或全部爬壁生長(zhǎng)良好后，即可終止傳代生長(zhǎng)。

1.2.5 引物設(shè)計(jì) 引物驗(yàn)證經(jīng)Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)，通過(guò)NCBI-BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)，輸入相應(yīng)引物進(jìn)行驗(yàn)證確認(rèn)。O1基因型：上游引物5′-TTA AGG GGA AGG ATG TCC TCG TCGTA-3′，Non O1基因型：下游引物5′-TAA GTG GAG GAGTG AGT TGT G-3′，共 同 引 物 5′-ATA TAT ATG GCA AAC ACA GIA ACC AAT G-3′；O2基因型：上游引物5′-GAC CCC CGG AAG AAG CTA TTG GA-3′，Non-O2基因型：下游引物5′-CGA CCC CCG CAA GAA GGC C-3′，共同引物5′-AGT GGA CGT GGA CAT GGA GTT CC-3′；B基因型：上游引物5′-ATC GAC CCC AGG GGA AGA CAG G-3′，Non-B 基 因型：下游引物5′-CCG ACC CCC CGA AGA GCC-3′；A2基因型：上游引物5′-GAG GCG GTC CGG AAG CG-3′，Non-A2基因型：下游引物5′-GAG GCG GTC CGG AAC ACG-3′，共同引物5′-GGG TGT GAT TTG AGG TGG GGA C-3′。

1.2.6 羊水細(xì)胞的DNA提取 將收集的羊水細(xì)胞于2 500 r／min離心10min，棄去上清液；再加入生理鹽水5～10mL，2 500r／min離心10min，棄去上清液。采用博日DNA提取試劑盒快速提取羊水細(xì)胞DNA，通過(guò)2%瓊脂電泳鑒定提取的質(zhì)量。

1.2.7 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系為20.0μL含模板2.0μL（約50ng），引物1.5μL，dNTP 1.6μL（0.4mmol），10×Buffer緩沖液2.0μL，Taq酶1.0U，加雙蒸水至20.0μL；PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性4.0min，94℃變性1.5min，52℃退火2.0min，72℃延伸2.0min，共30個(gè)循環(huán)。

1.2.8 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè) 取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2.0μL，2.5%瓊脂糖凝膠電泳（T＝6.0%，C＝3.3%，凝膠規(guī)格為82mm×64mm×0.75mm）。電極緩沖液為1×TBE。將加有1／5體積上樣緩沖液的酶切產(chǎn)物電泳，電壓220V，電泳20～30min。紫外線下成像。結(jié)果判斷見相應(yīng)說(shuō)明書。

2 結(jié) 果

2.1 羊水ABH血型物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果及分布 53例羊水ABH血型物質(zhì)結(jié)果中非分泌型16例（30.2%），A型分泌型13例（24.5%），B 型 分 泌 型 6 例 （11.3%），0 型 分 泌 型 15 例（28.3%），AB型分泌型3例（5.7%）。

2.2 PCR-SSP法檢測(cè)結(jié)果 53例羊水細(xì)胞DNA除5例未能正確檢出，其余均測(cè)出ABO血型。表現(xiàn)型為A型有18例，基因型 O1A1：7例，A1A1：2例，A1O2：9例；B型有8例，其基因型為O1B：4例，O2B：4例；表現(xiàn)型為O型有19例，其基因型為O1O1：3例，O1O2：11例，O2O2：5例，表現(xiàn)型為 AB型有3例，基因型均為A1B。

2.3 結(jié)果比對(duì) 除非分泌型的結(jié)果和無(wú)效檢測(cè)結(jié)果外，孕婦羊水血型物質(zhì)分泌型檢測(cè)結(jié)果與基因分型結(jié)果均一致，說(shuō)明兩種方法能達(dá)到臨床檢測(cè)的要求。

3 討 論

血型是以血液抗原形式表現(xiàn)出來(lái)的一種遺傳性狀，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并成為國(guó)際輸血協(xié)會(huì)承認(rèn)的血型系統(tǒng)有30多種［4］，ABO血型是最早發(fā)現(xiàn)的一個(gè)血型系統(tǒng)，也是應(yīng)用最廣、與臨床輸血最密切、最重要、研究和認(rèn)識(shí)較深入的一個(gè)血型系統(tǒng)。ABH血型抗原在5～6周胎兒RBC已可測(cè)出［5］，出生時(shí)抗原性只達(dá)成人的25%～50%，在出生后18個(gè)月時(shí)才能充分表現(xiàn)出抗原性［6］。

所有ABO血型的抗原都由H物質(zhì)合成而來(lái)，Se／se基因和H／h基因都可以控制合成H物質(zhì)。Se／se基因的表達(dá)決定體液中是否出現(xiàn)ABH抗原，決定ABH抗原為分泌型或非分泌型，人類的這種分泌狀態(tài)受控于分泌座位（FUTZ）的一對(duì)等位基因，即Se和se，Se基因編碼有活性的為α2-L巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶；se是無(wú)效基因。大部分群體的20%為非分泌型，是se基因的純合子。H／h基因的表達(dá)決定RBC上是否出現(xiàn)ABH抗原。再依ABO基因表達(dá)的不同，合成出不同抗原形成不同的 ABO 血型［7］。

母嬰ABO血型不相容是臨床新生兒溶血癥的常見原因，新生兒溶血病起源于胎兒從父親方面繼承了一些母親沒(méi)有的RBC抗原，使得母嬰血型不合，母體存在與胎兒RBC血型抗原相應(yīng)的免疫性抗體，此免疫性抗體可以通過(guò)胎盤進(jìn)入胎兒體內(nèi)，并包被在胎兒RBC上，在分娩前、后加速胎兒RBC破壞發(fā)生溶血，造成胎兒發(fā)生以溶血為主要損害的一種被動(dòng)免疫性疾?。?］，常常導(dǎo)致胎兒宮內(nèi)感染，早產(chǎn)、胎兒智力低下，嚴(yán)重的造成胎兒死亡。國(guó)內(nèi)常見的血型不合引起的新生兒溶血為ABO及Rh血型不合，其中以ABO不合者居多，Rh不合者次之［9］。因此，及早分析胎兒的血型，對(duì)于預(yù)防和治療具有重要的臨床意義，胎兒的血型鑒定以前主要是通過(guò)胎兒父母的血型，按照孟德爾遺傳規(guī)律推算出的子代血型，具有一定的盲從性和主觀性，通過(guò)宮內(nèi)穿刺采集胎兒血液進(jìn)行胎兒血清學(xué)的ABO鑒定，有較大的風(fēng)險(xiǎn)性，容易造成胎兒損傷，甚至導(dǎo)致胎兒死亡，且胎兒ABO血型抗原發(fā)育不成熟，RBC的凝聚力只有成人的20%，常常導(dǎo)致血型鑒定困難容易造成錯(cuò)判或誤判［10］。

人類ABO基因定位于第9對(duì)染色體長(zhǎng)臂末端，ABO血型系統(tǒng)的3個(gè)基因，由7個(gè)外顯子組成［11］。ABO血型系統(tǒng)不同的表型是由其基因水平上的幾個(gè)核苷酸的不同所決定［12］。PCR-SSP技術(shù)檢測(cè)ABO血型基因型是利用ABO基因發(fā)生突變位點(diǎn)的不同核甘酸，分別設(shè)計(jì)一系列序列特異性引物，直接擴(kuò)增ABO血型基因型物質(zhì)片段從而測(cè)得ABO血型及其亞型［13－14］。

本次實(shí)驗(yàn)共收集到53例羊水標(biāo)本，均來(lái)自為16～25周的健康孕婦，通過(guò)間接凝集抑制試驗(yàn)測(cè)得的ABO分泌型37例（69.8%），非分泌型16例（30.2%），稍高于文獻(xiàn)報(bào)道［15］，可能為胎兒尚未成熟，羊水中分泌較少。同時(shí)對(duì)53例羊水標(biāo)本進(jìn)行了細(xì)胞培養(yǎng)，通過(guò)PCR-SSP技術(shù)進(jìn)行了基因分型，除5例標(biāo)本可能因提取DNA相對(duì)不夠加之天氣炎熱，DNA可能降解，未能成功檢測(cè)外，其余均能正常檢測(cè)，PCR-SSP技術(shù)鑒定胎兒羊水細(xì)胞血型實(shí)驗(yàn)顯示，結(jié)果清晰可靠，方法可行，與分泌型的檢測(cè)比對(duì)結(jié)果均為一致。

本研究表明，采用PCR-SSP法檢測(cè)胎兒羊水細(xì)胞ABO血型基因型來(lái)確定胎兒血型是準(zhǔn)確可靠的。可有效克服常規(guī)血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)的不足和新生兒血型免疫系統(tǒng)不完善，以及血型結(jié)果影響因素較多的問(wèn)題。能較早快速準(zhǔn)確地鑒定胎兒血型，可直接用于臨床檢測(cè)，有助于臨床新生兒溶血癥的預(yù)防和治療。

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Detection of amniotic fluid ABH blood group substances and ABO blood type gene classification＊

ChenJiang，LuXinmin，GuoYu，HuWei
（DepartmentofLaboratory，YibinMunicipalSecondPeople′sHospital，Yibin，Sichuan644000，China）

ObjectiveTo detect amniotic fluid ABH blood group substances and ABO blood group genotype by the polymerase chain reaction with sequence-specific primers（PCR-SSP）to increase the prenatal diagnosis of fetal ABO blood group.Methods53 pregnant women with gestational age 16－25weeks were selected.Amniotic fluid was extracted for detecting ABH blood group substances by the serological indirect agglutinating reaction；the amniotic fluid cells were separated for extracting DNA.Then the PCR-SSP technique was adopted to analyze the ABO blood group genotypes.Results16specimens of amniotic fluid were non-secreting type phenotype（30.2%）and 37specimens of amniotic fluid were secreting type phenotype（69.8%）；48specimens of amniotic fluid were detected out the ABO blood group genotype by the PCR-SSP method.ABO blood group of fetal amniotic fluid cells by the gene identification was consistent to the detection results of amniotic fluid secreting type ABH blood group substances.ConclusionThe PCR-SSP technique can accurately detect the fetal amniotic fluid cells ABO blood group.

ABO blood-group system；amniotic fluid；cell；polymerase chain reaction with sequence specific primes；ABH blood group substances

10.3969／j.issn.1671-8348.2014.11.008

A

1671-8348（2014）11-1302-02

四川省衛(wèi)生廳資助項(xiàng)目（20100583）；宜賓市科技局資助項(xiàng)目（2010SF011）。

陳江（1974－），副主任技師，碩士研究生，主要從事分子生物學(xué)與流式細(xì)胞學(xué)研究。

2013-09-28

2013-12-22）

論著·臨床研究