鄧連霞，張海萍，楊明英，朱良均

（浙江大學(xué)應(yīng)用生物資源研究所，浙江杭州 310058）

蠶絲蛋白生物高分子材料的應(yīng)用研究新進(jìn)展

鄧連霞，張海萍，楊明英，朱良均

（浙江大學(xué)應(yīng)用生物資源研究所，浙江杭州 310058）

本文綜述了浙江大學(xué)應(yīng)用生物資源研究所生物資源高分子材料實驗室近5年來在蠶絲蛋白（絲素和絲膠）高分子材料在高吸水材料、支架材料、醫(yī)用生物材料等領(lǐng)域的應(yīng)用研究成果。

蠶絲蛋白；絲素；絲膠；高分子材料

蠶絲蛋白是一種性能優(yōu)良的天然蛋白，傳統(tǒng)上應(yīng)用于絲綢面料、纖維服飾等領(lǐng)域。隨著科技的進(jìn)步，蠶絲蛋白越來越多地被應(yīng)用于生物高分子材料領(lǐng)域，這對拓展蠶絲蛋白新用途、提高蠶絲行業(yè)整體經(jīng)濟效益等方面具有重要意義。

浙江大學(xué)生物資源與生物高分子材料實驗室，多年來致力于蠶絲蛋白的基礎(chǔ)研究［1～2］和蠶絲蛋白高分子材料的應(yīng)用研究，取得了一些階段性成果?，F(xiàn)把近5年來本實驗室在蠶絲蛋白高分子材料應(yīng)用研究取得的一些進(jìn)展概述如下。

1 絲素方面

1.1 絲素基高吸水材料

高吸水材料是一種具有較高吸水性能和保水性能的新型高分子材料［3］。高吸水材料經(jīng)適度交聯(lián)形成一定的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，含有強親水基團(tuán)，可通過水合作用迅速地吸收自重幾百倍乃至上千倍的水而成凝膠狀聚合物［4］。與傳統(tǒng)的吸水材料不同，高吸水材料具有吸水倍率大，吸水速率快，保水能力強，有效持續(xù)性強且無毒無味等優(yōu)點［5］。

汪琦翀等［6-7］以具有良好生物分解性能的絲素蛋白（SF）為原料，將其與丙烯酸（AA）和丙烯酰胺（AM）共聚合成一種新型的絲素蛋白/丙烯酸/丙烯酰胺吸水材料（SF/AA/AM），用紅外吸收光譜（FTIR）、掃描電鏡（SEM）、差示掃描量熱儀（DSC）對其結(jié)構(gòu)與性能進(jìn)行了分析，并對材料的吸水和保水性能進(jìn)行了測定。結(jié)果表明：SF/AA/AM吸水材料在去離子水、自來水和0.9%NaCl溶液中的吸水倍率分別為220～308 g/g，135～210 g/g，24.3～34.8 g/g。絲素蛋白與丙烯酸和丙烯酰胺聚合良好，絲素蛋白引入后，使材料的熱分解溫度升高，材料具有較高的熔融溫度，吸水比表面增加。本研究為進(jìn)一步研發(fā)具有生物分解性的新型高吸水材料提供參考。

1.2 新型絲素支架材料的體內(nèi)降解［8］

絲素材料因其良好的生物相容性、可降解吸收性和能制備成多種形態(tài)的材料等性能，在組織工程支架材料方面的應(yīng)用被人們廣泛關(guān)注。目前在支架材料制備及材料與各種哺乳動物細(xì)胞的相容性研究等方面已經(jīng)取得諸多成果。隨著對絲素支架材料研究向組織構(gòu)建和修復(fù)應(yīng)用方面的深入，調(diào)控絲素支架材料在體內(nèi)的降解吸收過程顯得十分重要。

將冷凍干燥法制備的新型絲素支架材料植入兔耳皮下進(jìn)行體內(nèi)降解試驗。肉眼外觀觀察發(fā)現(xiàn)植入絲素支架材料部位的皮膚無明顯紅腫，經(jīng)過28周左右皮下材料植入部位的突起逐漸消失；組織切片觀察發(fā)現(xiàn)絲素支架材料引起的組織反應(yīng)較弱；掃描電鏡在28周時只觀察到將近消失的絲素支架材料種植腔，表明材料已基本降解。相比之下28周時絲素膜仍完好，無明顯降解。研究結(jié)果表明，冷凍致孔新型絲素支架材料有望開發(fā)成為一種生物相容性優(yōu)良的可降解吸收性組織工程支架材料。

1.3 羥基磷灰石/絲素復(fù)合支架［9，10］

骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP-2）是轉(zhuǎn)錄生長因子β（TGF-β）家族成員之一，具有促進(jìn)成骨細(xì)胞分化、誘導(dǎo)骨組織再生的能力，目前已廣泛應(yīng)用于骨組織工程研究之中。羥基磷灰石（HA）是天然骨組織的主要無機成分，具有骨誘導(dǎo)性，能夠誘導(dǎo)新生骨的血管化，促進(jìn)新骨的形成，且植入體內(nèi)后不會引起炎癥反應(yīng)，常用作骨修復(fù)材料。絲素蛋白（SF）因其良好的生物相容性、降解性及獨特的力學(xué)性能等，廣泛用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。張艷紅等在大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行重組人的骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（rhBMP-2）的表達(dá)，并通過體外復(fù)性獲得了rhBMP-2重組蛋白。利用該重組蛋白與HA/SF支架復(fù)合，制備了新型復(fù)合支架材料。通過體內(nèi)外實驗表明，該材料的生物相容性良好，是一種潛在的骨修復(fù)材料。

1.4 絲腺絲素支架材料

相比于從繭殼里采取一些化學(xué)試劑溶解的方法提取絲素，直接從絲腺里提取絲素更加環(huán)保。楊明英等［11］采用直接從絲腺里提取的絲素制備了支架材料。絲素取自五齡第7 d的家蠶的中部絲腺。用冷凍干燥的方法制備了多孔支架。SDS-PAGE分析表明絲素分子量多在200 kDa以上。SEM（掃描電鏡）分析顯示支架孔徑均一且孔徑大小隨著絲素溶液濃度的增大而減小。通過力學(xué)萬能測試機測試，支架的壓縮模量達(dá)6.9±0.4 MPa。另外通過細(xì)胞增殖實驗表明，絲素支架具有較高的細(xì)胞粘附能力和增殖能力，同時也顯示出較高的堿性磷酸酶活性。絲腺絲素支架良好的抗壓能力和生物相容性使其有望應(yīng)用于骨組織工程。

1.5 絲素/殼聚糖復(fù)合支架

施李楊等［12］以絲素和殼聚糖為原料，采用冷凍干燥法制備絲素/殼聚糖支架，通過預(yù)礦化使羥基磷灰石（HA）沉積，形成多孔羥基磷灰石-絲素蛋白/殼聚糖復(fù)合支架。對復(fù)合支架進(jìn)行紅外吸收光譜（FTIR）、X射線衍射（XRD）、掃描電子顯微鏡（SEM）、熱重分析（TGA）、力學(xué)性能和空隙率表征；采用WST-1方法檢測MG-63骨肉瘤細(xì)胞在復(fù)合支架上的增殖情況，評價其細(xì)胞相容性。結(jié)果顯示，沉積的HA結(jié)構(gòu)屬于弱結(jié)晶態(tài)范疇，主要位于孔壁上，且隨著預(yù)礦化循環(huán)次數(shù)的增加沉積量增多，使預(yù)礦化復(fù)合支架的彈性模量得到極顯著地提高，其孔隙率保持在90%左右的較高水平；WST-1檢測表明，含有HA的預(yù)礦化復(fù)合支架對細(xì)胞增殖有明顯的促進(jìn)作用，具有良好的細(xì)胞相容性。

1.6 海綿狀絲素敷料

因絲素蛋白良好的生物相容性，早在2500年前，絲素就被作為手術(shù)縫合線應(yīng)用于生物醫(yī)用材料方面。閔思佳等［13］采用納米銀顆粒和1.25～5.0%（v/v）縮水甘油醚混合，再與絲素溶液共混冷凍干燥后得到海綿狀的絲素敷料。對敷料的力學(xué)性能，透氣性和吸濕性能進(jìn)行表征，發(fā)現(xiàn)材料具有良好的拉伸強度和彈性，敷于傷口上發(fā)現(xiàn)材料透氣性和吸濕性能均不錯。吸濕率能每小時達(dá)到101 g/m2，在干態(tài)和濕態(tài)下的吸濕倍率分別達(dá)到595.2%和251.9%。敷料中的納米銀在PBS緩沖液中處于相對穩(wěn)定狀態(tài)，抗菌性能良好。用新西蘭兔做實驗，將敷料敷于其背部創(chuàng)傷皮膚，發(fā)現(xiàn)17.7±2.4 d后創(chuàng)傷完全愈合，明顯快于作對照的豬皮敷料。以上實驗結(jié)果表明，海綿狀絲素敷料有巨大潛力應(yīng)用于人體皮膚創(chuàng)傷方面。目前這一研究已進(jìn)入臨床試驗階段。

2 絲膠方面

2.1 海綿狀純絲膠凝膠支架

絲膠在自然狀態(tài)下能夠形成凝膠，但機械性能較差，不能滿足生物材料的要求。通過與其他生物高分子（如聚乙烯醇等）復(fù)合或用交聯(lián)劑進(jìn)行化學(xué)修飾，可以明顯地提高絲膠凝膠的機械性能。而化學(xué)試劑的添加容易降低材料的生物相容性，因此若能少用或不用化學(xué)試劑來研制絲膠凝膠材料將是一個重要突破。張海萍等［14］以沸水法提取的普通繭層絲膠為原料，在不添加化學(xué)交聯(lián)劑的條件下，采用冷凍解凍的方法制備出一種新型的海綿狀絲膠凝膠支架材料。通過對不同制備條件（如絲膠濃度、冷凍時間、冷凍溫度和冷凍解凍次數(shù)等）下絲膠凝膠生成率的比較分析，確定了效率最高的絲膠凝膠制備工藝條件。并對不同條件下制備絲膠凝膠的多孔結(jié)構(gòu)、孔徑大小和形態(tài)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行了研究，為開發(fā)實用性凝膠支架材料建立了基礎(chǔ)。

2.2 絲膠/甘油混合膜［15］

一直以來，由于絲膠的力學(xué)性能欠佳，限制了其在組織工程等方面的應(yīng)用。為改善絲膠膜的力學(xué)特性，在絲膠溶液中添加適量甘油以期能改變其性能。結(jié)果表明，不論在干態(tài)還是濕態(tài)下，均可以通過調(diào)節(jié)甘油的量來調(diào)節(jié)絲膠膜的拉伸性能。ATR-FT?IR（傅里葉紅外光譜全反射）和熱分析（TGA和DSC）均表明甘油的加入促進(jìn)了膜的無定形結(jié)構(gòu)的形成。SEM（掃描電鏡）結(jié)果表明甘油的量在10 wt%時，絲膠和甘油混合得比較均一。絲膠膜拉伸性能的改善對其力學(xué)性能是一個優(yōu)化，增加了絲膠基高分子材料在組織工程應(yīng)用的可能性。

2.3 絲膠蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架材料［16］

復(fù)合骨支架是重要的骨組織修復(fù)材料。用氫氧化鈣和磷酸濕法合成羥基磷灰石，按一定的比例加入到濃縮后的絲膠溶液中，經(jīng)冷凍干燥制備絲膠蛋白/羥基磷灰石復(fù)合骨支架材料。通過SEM、XRD、FTIR、DSC及力學(xué)性能等檢測方法，探討了制備工藝條件對絲膠/羥基磷灰石復(fù)合支架材料的影響及結(jié)構(gòu)性能。結(jié)果表明，絲膠/羥基磷灰石復(fù)合支架材料的孔隙分散均勻且孔與孔之間相互貫通，孔隙率為33.0%～62.5%；為弱結(jié)晶，與人體骨中晶體態(tài)相似；分子呈β結(jié)構(gòu)，熱分解溫度提高，熱學(xué)性能發(fā)生變化；彈性模量最大為15.64 MPa。具有較好的力學(xué)性能。

2.4 絲膠蛋白基復(fù)合吸水材料

目前廣泛使用的聚丙烯酸類高吸水材料生物降解性能差，對生態(tài)環(huán)境造成危害，同時其原料來源于日益枯竭的石油資源。因此，研究可生物降解吸水材料，對于減少環(huán)境污染等具有重要意義。絲膠蛋白是一種天然高分子，一般作為制絲生產(chǎn)的廢棄物。絲膠蛋白的氨基酸中含有大量極性基團(tuán)（如-OH、-COOH、-NH2等），具有較好的親水性、反應(yīng)活性和生物降解性。如能將絲膠蛋白變廢為寶作為生物資源加以利用，研制絲膠蛋白基可生物降解吸水材料，不僅豐富了吸水材料類型，也為絲膠蛋白資源利用提供了一條新途徑［17］。

本實驗室在絲素蛋白基吸水材料的基礎(chǔ)上，以絲膠（Sericin）為原料，丙烯酸（AA）和丙烯酰胺（AM）為單體，合成了具有生物降解性能的Sericin/PAAAM復(fù)合吸水材料。研究了Sericin/PAA-AM復(fù)合吸水材料的合成條件如絲膠蛋白用量、單體配比、交聯(lián)劑用量、引發(fā)劑用量、中和度、反應(yīng)溫度、溶液pH等對復(fù)合吸水材料吸水性能的影響，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，設(shè)計五因素四水平正交試驗獲得了最適宜的制備條件：反應(yīng)溫度60°C，反應(yīng)時間2 h，絲膠與單體的配比為1∶2，AA和AM的配比為2，引發(fā)劑用量為單體用量的2%，交聯(lián)劑用量為單體用量的0.3%，中和度為70%，pH為7。復(fù)合吸水材料的吸收去離子水倍率為483 g/g，吸收自來水倍率為296 g/g，吸收0.9%NaCl溶液倍率為52 g/g［18］。

考慮到Sericin/PAA-AM復(fù)合吸水材料吸水量的不足，嘗試把熱水沸煮提取的絲膠蛋白再用堿性蛋白酶進(jìn)一步水解得到不同分子量分布的絲膠溶液，并研究酶解改性處理條件對絲膠蛋白分子量分布的影響。研究表明，酶解濃度越高，絲膠蛋白分子量越小。在此基礎(chǔ)上，選擇合適的酶解改性絲膠蛋白，進(jìn)一步與丙烯酸/丙烯酰胺復(fù)合單體進(jìn)行接枝共聚，研制具有生物降解性的酶解絲膠/丙烯酸/丙烯酰胺復(fù)合吸水材料，研究不同酶解改性絲膠蛋白復(fù)合吸水材料的結(jié)構(gòu)與性能差異，闡明絲膠蛋白結(jié)構(gòu)差異對復(fù)合吸水材料的接枝率、吸水性、保水性、生物降解性等的影響機制。研究表明，當(dāng)堿性蛋白酶和絲膠的質(zhì)量比為5 mg/g時，酶解絲膠/丙烯酸/丙烯酰胺復(fù)合吸水材料的接枝率、吸水率、保水率、生物降解均達(dá)到最大。在此條件下，經(jīng)冷凍干燥的酶解絲膠/丙烯酸/丙烯酰胺復(fù)合吸水材料吸收去離子水倍率達(dá)到896 g/g，吸收自來水倍率為424 g/g，吸收0.9%NaCl溶液倍率為83 g/g。

本研究對于絲膠蛋白基生態(tài)功能材料研發(fā)具有參考意義。

2.5 絲膠蛋白/羥基磷灰石復(fù)合膜

王雪云等［19］以乙醇處理的家蠶絲膠膜為模板，采用氯化鈣和磷酸氫二鈉溶液交替浸漬的方法，研究經(jīng)不同礦化周期處理絲膠膜上的礦化物沉積及對絲膠膜結(jié)構(gòu)的改變情況。通過紅外吸收光譜（FT?IR）、X射線衍射（XRD）、掃描電子顯微鏡（SEM）和X射線能譜（EDX）對表面沉積礦化物的絲膠膜進(jìn)行微觀形貌與結(jié)構(gòu)表征，發(fā)現(xiàn)礦化物能快速有效地在絲膠膜表面沉積和生長，隨著礦化周期的增加，礦化物的沉積量不斷增加，絲膠膜表面的結(jié)晶度略有提高，沉積的礦化物呈龜裂、薄板狀，主要成分為無定形磷酸鈣鹽。

將礦化第7 d的復(fù)合膜材料和乙醇預(yù)處理絲膠膜與MG-63人成骨瘤細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和XTT比色法檢測研究復(fù)合材料的生物相容性。結(jié)果表明，復(fù)合膜材料更能促進(jìn)MG-63細(xì)胞的增殖和生長。

3 展望

隨著生物技術(shù)的日新月異，研究手段的不斷進(jìn)步，目前國內(nèi)外對蠶絲蛋白的基礎(chǔ)研究和蠶絲蛋白高分子材料的應(yīng)用研究都越來越深入，并已取得了一些有價值的成果。蠶絲蛋白的諸多優(yōu)良性能使得蠶絲蛋白高分子材料應(yīng)用前景廣泛，這對拓展蠶絲資源利用新途徑，促進(jìn)蠶絲業(yè)循環(huán)經(jīng)濟建設(shè)發(fā)展等方面意義重大。不過由于技術(shù)條件等的限制，目前蠶絲蛋白高分子材料的很多應(yīng)用研究還處在實驗室階段。要讓其真正走向市場，還需要突破一些技術(shù)限制，任重而道遠(yuǎn)。

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New Progress in Applied Research of Silk protein biopolymer materials

DENG Lian-xia,ZHANG Hai-ping,YANG Ming-ying,ZHU Liang-jun
（Institute of Applied Bioresources,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China）

This paper summarized the application research achivement of silk protein biopolymer materials in superabsor?bent polymer,scaffold,biomaterials and other fields of the laboratory of Bio-resources and Macromolecuar Material Insti?tute of Applied Bioresources,Zhejiang University in recent 5 years.

silk protein;fibroin;sericin;biopolymer materials

S886.9

A

0258-4069［2014］03-005-04

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項（CARS-22）

鄧連霞（1986-），女，湖北荊州人，博士后，從事蠶絲蛋白生物資源高分子材料研究。E-mail：denglianxia2008@163.com

朱良均，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail：ljzhu@zju.edu.cn