潘彩霞，楊明英，朱良均

（浙江大學(xué)應(yīng)用生物資源研究所，浙江杭州 310058）

絲素作為固定化酶載體材料的研究進(jìn)展

潘彩霞，楊明英，朱良均

（浙江大學(xué)應(yīng)用生物資源研究所，浙江杭州 310058）

酶的固定化在化學(xué)、生物醫(yī)學(xué)以及生物感應(yīng)器等領(lǐng)域應(yīng)用較廣。固定化酶的效果在很大程度上取決于載體結(jié)構(gòu)。絲素作為固定化酶載體材料有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。本文綜述了國(guó)內(nèi)外以不同的絲素形態(tài)作為固定化酶載體材料的研究進(jìn)展，重點(diǎn)介紹了非納米絲素固定化酶和納米絲素固定化酶（絲素納米顆粒和絲素納米纖維）的研究進(jìn)展。

絲素；固定化酶；納米固定化酶

酶是活細(xì)胞所分泌的具有催化功能的蛋白質(zhì)是生物催化劑，生物體各種生化反應(yīng)除極個(gè)別外，絕大多數(shù)由酶催化。酶的種類多，應(yīng)用范圍廣，如在有機(jī)化學(xué)和制藥工業(yè)、生物醫(yī)學(xué)、食品生產(chǎn)、分析化學(xué)與臨床診斷、三廢處理等領(lǐng)域都有大量的應(yīng)用與研究。

多數(shù)酶是水溶性的，但溶液酶的應(yīng)用仍然存在著不少缺點(diǎn)，如反應(yīng)后酶和產(chǎn)物、底物不易分離；酶不能重復(fù)使用，使用效率低成本高；穩(wěn)定性差；酶反應(yīng)過(guò)程不易控制等［1］。酶固定化的出現(xiàn)為解決這一問(wèn)題提供了重要支撐。固定化酶是利用化學(xué)、物理或生物方法，將目標(biāo)酶在保持活性的前提下構(gòu)筑于特定載體上而發(fā)揮生物催化作用［2］。固定化酶具有穩(wěn)定性好、可重復(fù)利用和易分離等優(yōu)點(diǎn)，是一種低耗高效且易于自動(dòng)化的酶催化反應(yīng)工具，在蛋白質(zhì)酶解、生物轉(zhuǎn)化以及生物傳感器等方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

但大多數(shù)酶固定以后，其活力通常低于相同的溶液酶，其原因除了酶種類及反應(yīng)性有關(guān)外，同時(shí)也與固定的載體條件和方法有關(guān)：其中載體的親水、疏水性質(zhì)和介質(zhì)的介電常數(shù)等直接影響酶的催化效率或者酶對(duì)底物做出的反應(yīng)能力，因此載體材料的好壞直接影響固定化酶的性質(zhì)和應(yīng)用范圍。

絲素有大量的親水和疏水基團(tuán)，不需要任何的交聯(lián)劑，就能完成基本的固定，因此固定過(guò)程中很少引入其他的化學(xué)試劑，從而減小酶失活的可能性，提高了酶的固定效率；絲素作為固定化酶載體，固定強(qiáng)度強(qiáng)，熱穩(wěn)定性好，絲素蛋白變性的程度可控，減少固定化酶使用時(shí)的酶的滲出；絲素?zé)o毒，安全性高，應(yīng)用在醫(yī)學(xué)上有其他材料無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)；絲素的可塑性高，經(jīng)過(guò)一定的處理可以制成多種形狀，如薄膜、粉末、海綿、凝膠、納米顆粒、納米纖維等。這些獨(dú)特的性能，使得絲素成為固定化酶的優(yōu)質(zhì)材料［3］。近年來(lái)，也有不少以絲素作為固定化酶載體的研究，并取得了一定的成果。

1 非納米絲素固定化酶

絲素被關(guān)注并作為固定化酶載體已有幾十年的研究過(guò)程。早期的絲素作為固定化酶載體的主要是以非納米的形式。非納米絲素的形式和狀態(tài)多樣，和酶結(jié)合制成固定化酶的包括絲素纖維［4］，絲素膜［5］，絲素粉末［6］，絲素海綿等。

朱祥瑞等［7，8］將脫膠蠶絲用稀堿溶液處理后制成多孔的堿化絲素，經(jīng)物理吸附方法分別固定α-淀粉酶和葡萄糖異構(gòu)酶，制得堿化絲素固定化酶。同時(shí)，將蠶絲脫膠溶解、脫鹽等處理后制成絲素粉末，經(jīng)吸附后用戊二醛為交聯(lián)劑分別固定α-淀粉酶和葡萄糖異構(gòu)酶，制成粉末絲素固定化酶。經(jīng)對(duì)固定化酶性質(zhì)的研究表明：堿化絲素纖維和絲素粉末均能較好的固定α-淀粉酶和葡萄糖異構(gòu)酶，最適溫度比游離酶升高了10～15℃，具有較長(zhǎng)的操作半衰期和貯存穩(wěn)定性。

Lu等［9］向絲素溶液中分別加入葡萄糖氧化酶、脂肪酶和辣根過(guò)氧化物酶，配成一定比例的混合溶液，放在培養(yǎng)皿中自然風(fēng)干制成固定了酶的絲素膜，并測(cè)定了這三種固定化酶的活性和穩(wěn)定性。除此之外，還將制成的固定化酶膜浸入甲醇中使該固定化酶成為不溶水的膜，并與未經(jīng)甲醇處理的固定化酶膜進(jìn)行穩(wěn)定性和活性的比較分析。結(jié)果顯示，保存在37℃10個(gè)月的絲素固定化葡萄糖氧化酶的活性基本沒(méi)有減弱，相比經(jīng)甲醇處理的，未經(jīng)甲醇處理的固定化酶的穩(wěn)定性更高；相比于未經(jīng)絲素固定的辣根過(guò)氧化物酶和葡萄糖氧化酶，經(jīng)絲素固定的酶都顯示出顯著的活力穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)表明，絲素膜是長(zhǎng)期固定、貯存酶的有效載體。

雖然絲素膜是很好的固定材料，但是未經(jīng)處理的絲素膜易溶于水，酶的溶失率較高，而經(jīng)甲醇處理的絲素膜的固定化酶的活性和穩(wěn)定性受到一定的影響。王亞玲等［10］將絲素與硅酸甲酯（TMOS）作用，從而獲得SF/SiO2雜化膜，該雜化膜的溶失率明顯小于絲素膜。然后再將粗馬鈴薯多酚氧化酶固定于SF/ SiO2雜化膜上，從而得到絲素/SiO2雜化膜固定化多酚氧化酶，并用于處理模擬含酚廢水。SF/SiO2雜化膜在水中的溶失率小于絲素膜在水中的溶失率。所得SF/SiO2雜化膜固定化多酚氧化酶的最適宜pH為7.4。相對(duì)于游離多酚氧化酶，該酶具有較好的穩(wěn)定性，貯存穩(wěn)定性及重復(fù)使用性。研究表明，SF/SiO2雜化膜固定化多酚氧化酶有實(shí)際處理含酚廢水的可能。

穩(wěn)定的3D蛋白質(zhì)梯度在組織再生過(guò)程中非常的重要。所以制備3D的固定化酶將擴(kuò)大固定化酶的使用范圍，也是固定化酶形態(tài)的發(fā)展趨勢(shì)。Vepari等［11］將絲素溶液和氯化鈉以一定比例混合，并將該溶液蒸發(fā)，經(jīng)甲醇處理，制備成3D的絲素多孔支架。以碳化二亞胺將辣根過(guò)氧化物酶固定在3D的絲素支架上，制成3D絲素支架固定化酶。固定后的酶對(duì)時(shí)間和溫度的穩(wěn)定性較以直接吸收的方式固定的酶都有所增強(qiáng)。

2 納米絲素固定化酶

現(xiàn)代酶技術(shù)，作為工業(yè)生物技術(shù)科學(xué)的一個(gè)分支，正廣泛探索如何極大限度的使酶在細(xì)胞外長(zhǎng)期保持活性，并能有效適應(yīng)非生態(tài)環(huán)境的條件。納米科學(xué)的迅速發(fā)展為酶的穩(wěn)定和高效催化帶來(lái)了新的機(jī)遇。納米材料作為酶固定化的新型載體，能體現(xiàn)良好的生物相容性、較小的顆粒直徑、較大的比表面積、較小的擴(kuò)散限制、有效提高載酶量并能在溶液中穩(wěn)定存在等優(yōu)點(diǎn)［12］。近年來(lái)，以納米絲素作為固定化酶載體主要有絲素納米顆粒和靜電紡絲絲素納米纖維兩種形式。

2.1 絲素納米顆粒固定化酶

張雨青等［13］將脫膠的絲素在不同的環(huán)境條件下溶解，可以獲得分子量分布不同的液態(tài)絲素，并用有機(jī)溶劑將這種水溶液絲素制備成絲素納米顆粒。以這些絲素納米顆粒為載體，用戊二醛為交聯(lián)劑制成絲素納米顆粒-L–天冬酰胺酶結(jié)合物。研究表明，分子鏈斷裂較少的液態(tài)絲素制成的納米顆粒更適合酶的固定化。結(jié)果顯示，L-天冬酰胺酶與絲素納米顆粒經(jīng)戊二醛交聯(lián)后，其熱穩(wěn)定性較游離的酶有明顯的提高，最適反應(yīng)溫度提高10℃，且范圍有所加寬，最適pH范圍為6.0～8.0。

周珍禎等［14］以絲素納米顆粒為載體，分別以交聯(lián)和包埋兩種方式，制備β-葡萄糖苷酶-絲素納米顆粒結(jié)合酶。以游離酶為對(duì)照，利用對(duì)硝基苯基-β-D-葡萄糖苷為底物，探討了兩種結(jié)合酶制備的最佳實(shí)驗(yàn)條件并分析了兩種結(jié)合酶的活性等性能。結(jié)果表明，以戊二醛為交聯(lián)劑制備的β-葡萄糖苷酶-絲素納米顆粒在戊二醛濃度為0.25%、交聯(lián)時(shí)間5 h、交聯(lián)溫度37℃以及酶（U）與絲素納米顆粒（mg）比例為75∶100條件下可以獲得最佳生物連接效果；用包埋法制備的β-葡萄糖苷酶-絲素納米顆粒在酶（U）與絲素蛋白（mg）比例為1∶1條件下可獲得最佳固定效果；兩種方法所得的結(jié)合酶活性回收率分別為46.0%和59.2%。結(jié)果還顯示，無(wú)論是包埋還是交聯(lián)，游離酶和絲素納米顆粒結(jié)合后，熱穩(wěn)定性都有所提高，也都具有良好的操作穩(wěn)定性，可以反復(fù)使用。

Ai等［15］將絲素和聚酰胺-胺共價(jià)結(jié)合到磁性Fe3O4納米顆粒上，制備成磁性絲素納米顆粒，并用戊二醛將辣根過(guò)氧化物酶（HRP）交聯(lián)到磁性絲素納米顆粒上制備成結(jié)合酶。向反應(yīng)溶液中插入電極，在溶液中直接產(chǎn)生過(guò)氧化氫，同時(shí)通入氧氣。該方法不僅將絲素制備成納米顆粒增加了酶載量和反應(yīng)的比表面積；加入的Fe3O4方便反應(yīng)結(jié)束后固定化酶的回收；同時(shí)該裝置還自助制H2O2，免去了隨時(shí)要加H2O2的麻煩。結(jié)果顯示，制備的磁性絲素納米顆粒載酶量達(dá)0.7 mg/g。酶的活力回收達(dá)68%，固定化辣根過(guò)氧化物酶的活力達(dá)476 U/g納米顆粒。該研究還為用電極和酶結(jié)合的方法除去廢水中的有機(jī)磷和芳香類化合物提供了理論依據(jù)。

2.2 靜電紡絲絲素納米纖維固定化酶

靜電紡絲是近年來(lái)制備納米纖維的一項(xiàng)新興技術(shù)，是在高壓電場(chǎng)的作用下的一種紡絲過(guò)程［16］。靜電紡絲技術(shù)的操作方法簡(jiǎn)單、制備成本低廉，采用該技術(shù)制備的納米纖維已被廣泛應(yīng)用于濾器、復(fù)合材料及傳感器、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域［17］。因?yàn)殪o電紡絲納米纖維具有結(jié)構(gòu)豐富、持久耐用、比表面積大以及易于分離回收等優(yōu)點(diǎn)，許多學(xué)者將其用于酶的固定化研究。將電紡納米纖維膜作為固定化酶的載體，有利于酶與底物充分接觸，能有效提高酶的催化效率和重復(fù)利用性，因此被認(rèn)為是一種潛在的具有廣闊應(yīng)用前景的酶固定化基質(zhì)，并成為靜電紡絲納米纖維應(yīng)用研究領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一［18］。

將絲素制成靜電紡絲納米纖維膜用來(lái)固定酶，將充分發(fā)揮靜電紡絲和絲素在酶固定化領(lǐng)域的優(yōu)勢(shì)。Hwan Park等［19］將絲素溶液靜電紡絲成直徑不同的納米纖維，固定胰凝乳蛋白酶。結(jié)果顯示，絲素納米纖維能達(dá)到5.6 wt%的載酶量；直徑為20 5nm的絲素納米纖維固定化酶在25℃環(huán)境下24 h的酶活力回收值仍達(dá)90%；320 nm的絲素納米纖維固定化酶經(jīng)乙醇處理仍顯示出較強(qiáng)穩(wěn)定性，活力回收值仍高于45%。研究結(jié)果表明，絲素納米纖維固定化酶的活力強(qiáng)于絲素纖維固定化酶的活力。

3 結(jié)語(yǔ)

絲素作為固定化酶載體材料有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。隨著納米材料的普及和應(yīng)用，納米絲素固定化酶將成為絲素固定化酶的研究熱點(diǎn)，尤其是靜電紡絲納米絲素，制備成本低、操作簡(jiǎn)便、固定效果好，將是今后值得關(guān)注的課題。雖然至今已有很多關(guān)于絲素作為載酶載體的研究，但應(yīng)用在實(shí)際生產(chǎn)中仍具有一定的限制。絲素作為固定化酶的載體材料仍需繼續(xù)探索和改進(jìn)。

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Research on Progress of Fibroin as Immobilized Enzyme Carrier Materials

PAN Cai-xia,YANG Ming-ying,ZHU Liang-jun

（Institute of Applied Bioresources,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China）

Immobilized enzyme has been applied in many fields such as chemical biomedical and biological sensors. The effect of the immobilized enzyme depends largely on the structure of the supporter.Researches in the recent years show that silk fibroin as immobilized enzyme supporter material has its unique advantages.This article reviews the do?mestic and foreign scholars in different fibroin forms as the research progress of immobilized enzyme carrier materials, including the silk fibroin immobilized enzyme and nano silk fibroin immobilized enzyme(nanoparticles and nanofibers).

silk fibroin;immobilized enzyme;nano-immobilized enzyme

S886.9

A

0258-4069［2014］03-009-04

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)（CARS-22）

潘彩霞（1992-），女，江西景德鎮(zhèn)人，碩士研究生。從事蠶絲蛋白生物資源高分子材料研究。E-mail:412932303@qq.com

朱良均，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail:ljzhu@zju.edu.cn