朱羽堯，錢 驊，張琪瑤，黃曉德，陳 斌，趙伯濤

(南京野生植物綜合利用研究院, 江蘇 南京 210042)

肉桂(Cinnamomumcassia)，為樟科樟屬植物，是重要的藥用和食用材料，主要分布于我國廣西、廣東等地。肉桂主要含有肉桂油、油樹脂、多糖、黃烷醇及其多聚體、倍單萜及其糖苷、二萜及其糖苷、無機(jī)離子等多種生理活性物質(zhì)[1]。其中，肉桂油是指從干燥肉桂皮中提取得到的揮發(fā)油，為黃色澄清液體，其中主要成分為肉桂醛，另有苯甲醛、肉桂醇、鄰甲氧基肉桂醛、香豆素等[2-4]。大量研究表明, 肉桂精油具有較強(qiáng)的抗菌活性, 不但可以有效抑制沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等多種病原性微生物，而且對食品儲藏過程中的霉腐微生物的生長起到抑制作用，從而達(dá)到防腐保鮮的目的[5-6]。目前，以肉桂、丁香等植物精油為基礎(chǔ)而開發(fā)的天然綠色食品防腐保鮮劑得到了廣泛關(guān)注，大力開發(fā)此類植物源防腐保鮮劑是控制化學(xué)防腐劑或抗生素濫用，解決食品安全問題的重要手段[7-8]。

目前對肉桂精油抑菌活性方面的研究多以桂皮為主要研究對象，對于其枝、葉、果等其他部位的研究相對較少，使得肉桂整體的資源利用度不高[9]。因此，本研究對肉桂不同植物部位所含精油進(jìn)行提取，并采用氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)測定各部位精油的化學(xué)組成。并在此基礎(chǔ)上，從抑菌圈、最低抑菌濃度和最低殺菌濃度這幾方面對各部位精油的抑菌效果進(jìn)行評價，為了解肉桂各部位精油的成分差異及抑菌活性強(qiáng)弱提供依據(jù)，從而為肉桂資源的可持續(xù)利用提供科學(xué)途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

桂皮、桂枝、桂葉、果實、花萼均于2014年3月采自廣西省桂林市中國科學(xué)院廣西植物研究所，經(jīng)韋昆華副研究員鑒定為Cinnamomumcassia。采后晾曬24 h，裝袋，4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)由中國藥科大學(xué)張劍教授提供。

1.2 儀器與試劑

Agilent 7820A氣相色譜串聯(lián)5975質(zhì)譜檢測儀，Agilent公司；DW-2型調(diào)溫電熱套，通州市張芝山鎮(zhèn)決心化工電器廠；UTP-313千分之一電子天平，上?；ǔ彪娖饔邢薰?；752紫外可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司 752；BH2型顯微鏡，OLYMPUS公司；HZQ-F160振蕩培養(yǎng)箱，太倉市華美生化儀器廠；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；紫外無菌操作臺，蘇州凈化設(shè)備廠；圓底燒瓶、量筒等玻璃儀器。

高純氦氣(99.999%)，南京上元工業(yè)氣體廠；二甲苯，南京化學(xué)試劑有限公司；二甲基亞砜，中國醫(yī)藥公司北京公司；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 方法

1.3.1 水分含量的測定

根據(jù)GB/T12729.6-2008(香辛料和調(diào)味品 水分含量的測定)中相關(guān)規(guī)定，采用二甲苯蒸餾法對各實驗樣品中的水分含量進(jìn)行測定。水分含量的計算公式如下：

其中：W(%)—試樣的水分含量，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示(%)；m—試樣質(zhì)量，g；V—接收器中水的體積，mL；ρ—水的密度，1 g/mL。

1.3.2 肉桂各部位精油的提取

根據(jù)GB/T 30385-2013(香辛料和調(diào)味品揮發(fā)油含量測定)中相關(guān)規(guī)定，采用水蒸氣蒸餾法提取肉桂各部位的精油。分別稱取一定量干燥桂皮、桂枝、桂葉、果實、花萼置于1 000 mL圓底燒瓶中，加入400 mL蒸餾水，在精油提取裝置中水相液面滴加1 mL二甲苯，恒溫蒸餾4 h后收集提取所得揮發(fā)油并保存，計算肉桂油得率并將各精油樣品進(jìn)行GC-MS分析。

其中：V0—測得的二甲苯體積，mL；V1—測得的二甲苯和揮發(fā)油的總體積，mL；M—試樣質(zhì)量，g；W(%)—試樣水分百分含量。

1.3.3 GC-MS檢測肉桂各部位精油化學(xué)成分組成

取1 μL精油直接進(jìn)行GC/MS 分析，色譜、質(zhì)譜條件[4]如下：

色譜柱：HP-5MS(30 m ×0.25 mm ×0.125 μm)，載氣為高純氦氣(99.999%)。進(jìn)樣口溫度：250 ℃；程序升溫:初始溫度50 ℃，先以5 ℃/min升至200 ℃后，保持1 min，再以10 ℃/min升至260 ℃，保持1 min。各組分的相對含量采用峰面積歸一化法進(jìn)行定量。

電子轟擊(EI)離子源；電子能量70 eV；接口溫度：280 ℃，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，質(zhì)量掃描范圍：33～600 m/z。獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過NIST 11質(zhì)譜圖庫進(jìn)行檢索。

1.3.4 抑菌圈測定

本實驗采用濾紙片法[8]測定肉桂不同部位精油的抑菌圈。取6 mm圓形濾紙片若干，置于潔凈干燥的培養(yǎng)皿內(nèi)，干熱滅菌后分別浸泡與各精油中。將配制好的107～108cfu/mL菌懸液震蕩均勻，用無菌移液槍吸取0.15 mL于平板表面，并涂布均勻，制成含菌平板。將浸泡過精油的濾紙片貼在含菌平板中央，每組各做3個平行樣，置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃下培養(yǎng)24 h。觀察抑菌情況，并測量抑菌圈直徑評價其抑菌效果。

1.3.5 最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)測定[10]

配置精油濃度1.6%，二甲基亞砜(DMSO)濃度為2.0%的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。取無菌試管9支，并采用空白營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基倍比稀釋，制備含精油濃度分別為1.6%，0.8%，0.4%，0.2%，0.1%，0.05%，0.025%和0.0125%的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，同時以含2.0% DMSO的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基作為空白對照。各檢測試管中加入200 μL 微生物濃度為106～107 cfu/mL的對數(shù)期菌液，并置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后取出觀察，未見明顯微生物生長的最低精油濃度濃度即為該精油的MIC。確定了MIC后，將各試管中含精油的菌液采用空白培養(yǎng)基稀釋100倍，放入培養(yǎng)箱于37 °C培養(yǎng)48 h，未能觀察到微生物生長的最低精油濃度即為MBC。每組實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 肉桂不同部位中精油含量

表1 肉桂不同部位精油的得率

由表1可知,肉桂的不同植物部位中，桂皮的精油含量(1.74%±0.22%)，遠(yuǎn)高于其他部位。花萼其次，其精油含量為0.88%±0.08%，桂枝和桂葉相對較低，而果實中幾乎不含精油。

2.2 肉桂不同部位精油化學(xué)成分組成分析

桂皮、桂枝、桂葉、花萼精油的總離子流圖見圖1～4。通過NIST 2011標(biāo)準(zhǔn)化合物質(zhì)譜庫進(jìn)行匹配，并結(jié)合化合物的保留時間，對揮發(fā)油中的化學(xué)成分進(jìn)行鑒定，并采用面積歸一法計算其相對含量，結(jié)果見表2。

圖1 桂皮精油的總離子流量圖

圖2 桂葉精油的總離子流量圖

圖3 桂枝精油的總離子流量圖

圖4 花萼精油的總離子流量圖

由表2可知，從桂皮中共檢測出了23個組分，鑒定了匹配度在80%以上的17種化合物，占總相對含量的96.47%，主要成分是反式肉桂醛(53.71%)、鄰甲氧基肉桂醛(36.66%)占總相對含量的91.61%。從桂葉中檢測出了31個組分，鑒定了匹配度在80%以上的25種化合物，占總相對含量的95.09%，主要成分是反式肉桂醛(51.85%)、鄰甲氧基肉桂醛(22.69%)、1-苯基-2-硝基丙烯(10.24%)，占總相對含量的86.40%。從桂枝中檢測出了29個組分，鑒定了匹配度在80%以上的23種化合物，占總相對含量的98.22%，主要成分是反式肉桂醛(80.05%)、鄰甲氧基肉桂醛(6.08%)、肉桂醛(2.13%)，占總相對含量的88.26%。從桂葉中檢測出了32個組分，鑒定了匹配度在80%以上的25種化合物，占總相對含量的99.43%，主要成分是反式肉桂醛(87.68%)、鄰甲氧基肉桂醛(2.67%)、肉桂醛(2.35%)，占總相對含量的92.7%。

從化學(xué)成分組成可以看出，桂皮與桂葉的化學(xué)組成與桂枝和花萼有明顯區(qū)別，主要體現(xiàn)在其中鄰甲氧基肉桂醛的含量。萼片中鄰甲氧基肉桂醛的含量僅為2.67%，而在桂皮中含量為36.66%，超過前者10倍以上。桂葉中1-苯基-2-硝基丙烯的含量為10.24%，遠(yuǎn)高于其他三種部位。此外，通過結(jié)合精油得率以及肉桂醛的相對含量可以發(fā)現(xiàn)，四種植物部位中肉桂醛絕對含量分別為0.93%(桂皮)> 0.77%(花萼)> 0.48%(桂枝)> 0.25%(桂葉)。雖然桂皮中反式肉桂醛的絕對含量最高，但若以制備高品質(zhì)反式肉桂醛的肉桂精油為目的，桂皮并不是最佳選擇材料。首先其中鄰甲氧基肉桂醛含量偏高，將影響產(chǎn)品的品質(zhì)；其次，桂皮的采收對資源的可持續(xù)利用帶來的負(fù)面影響遠(yuǎn)高于桂枝等材料部位；此外從產(chǎn)量的角度來看，桂皮的產(chǎn)量也遠(yuǎn)低于桂枝。因此，綜合產(chǎn)品質(zhì)量以及資源的可持續(xù)利用角度的分析，桂枝是大規(guī)模生產(chǎn)高品質(zhì)肉桂精油的最佳材料。

表2 肉桂各部位精油化學(xué)成分組成

2.3 抑菌圈法檢測肉桂各部位精油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌效果

表3 肉桂各部位精油對大腸桿菌抑菌圈直徑(mm)

精油抑菌圈實驗結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)是：抑菌圈直徑>20 mm 為極度敏感、15～20 mm 為高度敏感，10～15 mm 時為中度敏感，7～9 mm 時為低度敏感，<7 mm為不敏感[10]。

抑菌圈實驗結(jié)果如表3所示，并參照以上標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評價后發(fā)現(xiàn)，肉桂各部位精油精油對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑均大于20 mm，屬于極度敏感。大腸桿菌對桂皮、桂枝以及花萼精油極其敏感，抑菌圈直徑均為30 mm左右。以金黃色葡萄球菌為研究對象發(fā)現(xiàn)，桂枝與花萼所提取的精油抑制效果最好，抑菌圈直徑分別達(dá)到33.7 mm±1.2 mm和32.3 mm±1.5 mm。而桂皮精油的抑菌圈直徑為26.3 mm±0.6 mm，雖然同樣顯示出顯著抑菌活性，但相對于桂枝精油而言其抑菌效果僅為78.1%。

圖5 桂枝精油對大腸桿菌(1)和金黃色葡萄球菌(2)的抑菌圈

2.4 肉桂精油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)

肉桂各植物部位精油均能在較低濃度范圍內(nèi)對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌起到良好的抑制作用。桂皮、桂枝和花萼對于大腸桿菌的MIC為0.05%，花萼中提取的精油擁有最低的MBC為0.05%。對金黃色葡萄球菌而言，桂枝及花萼中提取所得精油的MIC和MBC均為0.025%，低于桂皮和桂葉。

表4 肉桂各部位精油對E.coli和S.aureus的MIC和MBC(%)

結(jié)合反映肉桂精油抑菌效果的抑菌圈、MIC和MBC實驗結(jié)果與各部位精油化學(xué)成分組成共同分析可以發(fā)現(xiàn)，抑菌效果的強(qiáng)弱與精油中肉桂醛的含量具有相關(guān)性。在肉桂醛含量上，桂皮和桂葉中明顯低于桂枝和花萼；而相應(yīng)的桂皮和桂葉的抑菌圈大小、MIC和MBC均弱于桂枝和花萼。

3 結(jié) 論

本研究對肉桂的桂皮、桂枝、桂葉、花萼以及果實這幾個部位中精油的含量及化學(xué)組成進(jìn)行檢測分析，并進(jìn)一步通過抑菌圈、MIC和MBC實驗對各部位精油抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌生長活性進(jìn)行評價。結(jié)果表明，五種植物部位中，除果實外均富含精油，其中以桂皮中精油含量最高為1.74%。值得注意的是，各部位精油的化學(xué)組成存在顯著差別。桂枝和花萼提取所得精油中，反式肉桂醛的含量達(dá)80%以上，而桂皮和桂葉中僅為50%左右。抑菌結(jié)果表明，這些成分組成上的差異與相應(yīng)精油的抑菌活性存在直接相關(guān)性。反式肉桂醛含量較高的桂枝和花萼提取所得精油體現(xiàn)出的抑菌效果明顯優(yōu)于桂皮和桂葉提取所得精油。由此可見，反式肉桂醛是肉桂精油中發(fā)揮最主要抑菌活性的成分，其含量的高低與精油的抑菌效果直接相關(guān)。因此，若以生產(chǎn)制備高含量反式肉桂醛的肉桂精油為目的，相比之下桂枝由于其所含精油中反式肉桂醛含量高，并且綜合考慮充足材料來源和資源的可持續(xù)利用，將成為最佳生產(chǎn)原料。

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