姜洪芳, 石寶俊，程 晶,張鳳倩，朱 熹,施國新*,張衛(wèi)明*

(1.南京師范大學, 江蘇 南京 210046；2.南京野生植物綜合利用研究院, 江蘇 南京 210042；3.南京農(nóng)業(yè)大學，江蘇 南京 210095)

鳳仙花(ImpatiensbalsaminaL.)為鳳仙花科(Balsaminaceae)鳳仙花屬(Impatiens)一年生草本植物。鳳仙花屬共有植物900余種，全球均有分布，其中鳳仙花(ImpatiensbalsaminaL.)作為觀賞植物國內(nèi)外均有種植，也是該屬植物的常見品種，其花、莖、葉、種子在民間有悠久的藥用歷史，被廣泛用于各種中藥配方中，例如抗感染、關節(jié)炎、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗過敏、抗腫瘤、肌肉拉傷及產(chǎn)后產(chǎn)生的疼痛[1-2]。已經(jīng)從鳳仙花中分離鑒別了多種成分，如黃酮、多酚、花青素、皂苷、醌類。一些化合物的鎮(zhèn)痛和抗過敏活性，特別是多酚及醌類已經(jīng)進行了廣泛研究[3-6]，而以植物化學為基礎的鳳仙花提取物的其他傳統(tǒng)應用相對研究較少。鳳仙花的傳統(tǒng)用法為，用水煮沸直接飲用治療細菌及真菌感染，或者是直接制成糊劑用于治療皮膚及指甲的局部感染。國內(nèi)胡喜蘭等利用不同溶劑對鳳仙花的紅色花瓣進行活性成分提取，采用試劑盒法對其進行抗氧化活性測定，結(jié)果顯示鳳仙花的各種不同提取物均具有一定的抗氧化能力[7]?，F(xiàn)代研究表明，抗氧化劑具有延緩衰老，降低多種疾病產(chǎn)生，增強人體免疫力等多種功能，研究開發(fā)安全高效的天然抗氧化劑已經(jīng)成為當今研究熱點之一，而鳳仙花各部位又具有不同功效，因此對于鳳仙花不同部位的抗氧化活性具有進一步探索的必要。

本文用55%的乙醇分別回流提取鳳仙花的莖、葉、花中的活性物質(zhì)，然后測定各部位的多酚及黃酮含量，采用常用的幾種體外抗氧化體系，測定各提取物對DPPH、羥自由基、超氧陰離子自由基的清除能力和還原力等抗氧化活性指標。結(jié)果表明，鳳仙花各部位的多酚含量由高到低依次為鳳仙花的葉、花、莖。各種提取物均有不同程度的抗氧化活性，且抗氧化活性與提取物濃度存在量效關系，其中葉提取物清除DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基活性以及還原力均最高，本研究為鳳仙花作為低毒高效的天然抗氧化劑應用提供了依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

T6紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)、恒溫水浴鍋、分析天平(METTLER)、離心沉淀機(上海手術器材廠)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮儀器廠)。

沒食子酸、蘆丁均購于中國生物制品檢定研究院，批號110831-201303、100080-201202。

抗壞血酸(即Vc)，三氯化鋁、福林酚(Folin-Ciocalteu)試劑、無水碳酸鈉、DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)、過氧化氫、鄰苯三酚(焦性沒食子酸)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、鹽酸、三氯乙酸、磷酸二氫鈉 、磷酸氫二鈉、三氯化鐵、水楊酸、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀為市售分析純。

鳳仙花的花、莖、葉、均于2013年7月采自南京市郊區(qū)，晾干，經(jīng)鑒定其基原為ImpatiensbalsaminaL.。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取物的制備

分別稱取50 g鳳仙花的花、莖、葉，研磨碾碎后分別加入55%乙醇750 mL，回流提取2 h，過濾，濾渣加入55%乙醇600 mL混勻，再次回流提取2 h，過濾，合并兩次濾液，70 ℃減壓蒸干，備用。

1.2.2 多酚、總黃酮含量測定[8-9]

1.2.2.1 多酚標準曲線的繪制

精密稱定0.1001 g沒食子酸，用蒸餾水溶解定容至100 mL，得1.001 mg/mL沒食子酸標準溶液。分別移取0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mL到50 mL容量瓶中，加入25 mL蒸餾水，加入2.00 mL Folin-Ciocalteu試劑搖勻，靜置4～5 min，加入10%Na2CO3溶液4.00 mL，用蒸餾水定容至50 mL，置于25 ℃的恒溫水浴鍋中顯色2 h，于最大吸收波長765 nm處測定各個標準溶液吸光度，以沒食子酸濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，求線性回歸方程。

1.2.2.2 總黃酮標準曲線的繪制

精密稱定0.042 01 g蘆丁，用甲醇溶解定容至10 mL，得4.201 mg/mL蘆丁標準溶液。分別移取0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10 mL到10 mL具塞試管中，加入1%AlCl3溶液5.00 mL，混勻，室溫靜置30 min，于415 nm處測定吸光度值，以蘆丁濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，求線性回歸方程。

1.2.2.3 鳳仙花不同部位多酚、總黃酮測定

準確稱取鳳仙花的花、莖、葉提取物各0.1000 g，溶于100 mL 65%乙醇中，得1.000 mg/mL樣品液，準確吸取0.10 mL提取液按1.2.2.1、1.2.2.2進行顯色反應，按照回歸方程計算測定液中多酚、總黃酮濃度，并計算出提取物中多酚、總黃酮的含量。

1.2.3 鳳仙花各部位提取物抗氧化活性比較

準確稱取鳳仙花的花、莖、葉提取物和對照品Vc各0.100 0 g，溶于100 mL 65%乙醇中，得1.000 mg/mL母液，并分別稀釋，配制成0.10、0.25、0.50、0.75、1.00 mg/mL的提取物及對照品溶液，供抗氧化活性測定用。

1.2.3.1 對DPPH自由基清除活性的測定[10]

(1)0.5 mmol/L DPPH甲醇溶液

準確稱取DPPH固體粉末0.049 5 g，在燒杯中用少量甲醇溶解，定容至250 mL容量瓶中，配制成0.5 mmol/L DPPH甲醇溶液。

(2)樣品溶液的測定

分別移取不同濃度的樣品及對照品溶液2.00 mL，加入0.5 mmol/L DPPH甲醇溶液2.00 mL，混勻15 s后，放置30 min，以2 .00 mL不同濃度樣品或?qū)φ掌啡芤杭尤?.00 mL甲醇為參比，于517 nm測吸光度，記為A1，每個試樣作3次平行測定，取其均值，同時移取2.00 mL 65%乙醇加入2.00 mL 0.5 mmol/L DPPH甲醇溶液，混勻15 s后，放置30 min，以2.00 mL 65%乙醇加入2.00 mL甲醇為參比，于517 nm測吸光度，記為A0，并根據(jù)下述公式計算清除率。

1.2.3.2 對羥自由基清除活性的測定

采用改良的Smirnoff水楊酸法[11]，即利用H2O2與Fe2+反應產(chǎn)生羥自由基，即：H2O2+Fe2+→·OH+H2O+Fe3+，在體系內(nèi)加入水楊酸捕捉并產(chǎn)生有色物質(zhì)，該物質(zhì)在510 nm處有最大吸收。

(1)10 mmol/L硫酸亞鐵溶液的配制

精密稱取0.3475 g硫酸亞鐵，溶于250 mL蒸餾水中，即得10 mmol/L硫酸亞鐵溶液。

(2)10 mmol/L水楊酸乙醇溶液的配制

精密稱取0.417 5 g水楊酸，溶于250 mL乙醇中，即得10 mmol/L水楊酸乙醇溶液。

(3)2.5 mmol/L H2O2溶液的配制

精密量取0.13 mL H2O2溶液(體積分數(shù)為30%)，加蒸餾水稀釋，并定容至500 mL,即得2.5 mmol/L H2O2溶液。

(4)樣品溶液的測定

分別準確量取10 mmol/L硫酸亞鐵溶液、10 mmol/L水楊酸乙醇溶液和不同濃度的樣品溶液各1.00 mL，置于具塞試管中混勻，分別加入2.5 mmol/L H2O2溶液2.00 mL，37 ℃水浴30 min后，分別在510 nm處測定吸光度值。每個試樣作3次平行測定，取其均值為A1，另外參照上述操作分別測定相應的吸光度值A0和A2，按下式計算羥自由基清除率：

其中：A0為反應體系中不含樣品，但含鄰苯三酚的吸光度值；A1為反應體系中既含樣品，又含鄰苯三酚的吸光度值；A2為反應體系中含有樣品，但不含鄰苯三酚的吸光度值。

1.2.3.3 對超氧陰離子自由基清除活性的測定

采用鄰苯三酚自氧化法測定樣品對超氧陰離子自由基的清除能力[12]。

(1)0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH=8.2)的配制

精密稱取1.211 g 三羥甲基氨基甲烷(Tris),溶于蒸餾水中定容至100 mL；量取50.00 mL上述溶液與0.1 mol/L鹽酸22.90 mL混勻后，加水稀釋至100 mL，所得緩沖液pH值為8.2。

(2)鹽酸溶液的配制

精密量取0.8 mL的濃鹽酸，加蒸餾水稀釋至100 mL,即得0.1 mol/L鹽酸溶液；精密量取0.85 mL濃鹽酸，加水稀釋至1 000 mL，即得10 mmol/L鹽酸溶液。

(3)25 mmol/L鄰苯三酚溶液的配制

精密稱取0.315 0 g鄰苯三酚，用10 mmol/L鹽酸溶解，定容至100 mL，即得25 mmol/L鄰苯三酚溶液。

(4)樣品溶液的測定

精密量取0.05 mmol/L Tris-HCl緩沖液4.50 mL，25 ℃水浴20 min，分別加入1.00 mL不同濃度的各樣品溶液和25 mmol/L鄰苯三酚溶液0.40 mL,混勻，于25 ℃水浴中反應5 min，加入10 mmol/L鹽酸溶液1.00 mL終止反應，于325 nm處測定吸光度。每個試樣作三次平行測定，取其均值為A1。另外參照上述操作分別測定相應的吸光度值A0和A2，按下式計算超氧陰離子清除率：

其中：A0為反應體系中不含樣品，但含鄰苯三酚的吸光度值；A1為反應體系中既含樣品，又含鄰苯三酚的吸光度值；A2為反應體系中含有樣品，但不含鄰苯三酚的吸光度值。

1.2.3.4 鳳仙花還原力的測定

參考Oyaizu和Amarowicz等的方法，稍作改進[13]。

(1)pH6.6磷酸緩沖液的配制

分別精密稱取磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉和氯化鈉1.740 0 g、2.700 0 g、1.700 0 g，溶于400 mL蒸餾水中，即得pH6.6磷酸緩沖液。

(2)1%鐵氰化鉀溶液的配制

精密稱取1.000 0 g鐵氰化鉀，溶于100 mL蒸餾水中，即得1%鐵氰化鉀溶液。

(3)10%三氯乙酸溶液的配制

精密稱取10.000 0 g三氯乙酸，溶于100 mL蒸餾水中，即得10%三氯乙酸溶液。

(4)0.1%三氯化鐵溶液的配制

精密稱取0.170 0 g六水合氯化鐵，溶于100 mL蒸餾水中，即得0.1%三氯化鐵溶液。

(5)樣品溶液的測定

精密量取不同濃度的樣品溶液2.50 mL于試管中，依次加入2.50 mL磷酸緩沖液(pH6.6)和1%鐵氰化鉀溶液2.50 mL，于50 ℃水浴保溫20 min，快速冷卻，再加入10%三氯乙酸2.50 mL，以3 000 r/min離心10 min，取上清液2.50 mL，依次加入2.00 mL蒸餾水，0.1%的三氯化鐵溶液0.50 mL，充分混勻，靜置10 min后，于700 nm處測吸光度值，吸光值越大表示還原力越強(以蒸餾水作對比)。每個試樣作3次平行測定，取其平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 鳳仙花各部位乙醇提取物的提取率、多酚及總黃酮含量

從表1中可以看出，鳳仙花不同部位的乙醇提取物的得率存在差異，其中鳳仙花的花提取物得率為33.20%，鳳仙花的莖提取物得率為22.40%，鳳仙花的葉提取物的得率為28.33%。通過應用多酚線性回歸方程：y=0.108 5x-0.027 9(R2=0.995 5)及總黃酮線性回歸方程：y=6.517x-1.159 6(R2=0.999 2)，計算出鳳仙花不同部位醇提取物中的多酚含量(以沒食子酸計)及總黃酮含量(以蘆丁計)，見表1。

表1 鳳仙花不同部位乙醇提取率和多酚、總黃酮含量

2.2 鳳仙花各部位提取物抗氧化活性比較

2.2.1 對DPPH自由基清除活性的測定結(jié)果

DPPH法從1958年被提出后，就被廣泛地用于各種生物試樣和食品的抗氧化能力測定。DPPH自由基以氮為中心，其結(jié)構十分穩(wěn)定，主要是由于起共振作用的3個苯環(huán)的空間障礙，使氮原子上的單電子不能夠發(fā)揮電子成對作用。DPPH檢測法是根據(jù)DPPH自由基于517 nm處有一強吸收峰，其醇溶液呈紫色的特性。當自由基清除劑存在時，通過使DPPH分子中1個穩(wěn)定自由基與抗氧化劑提供的1個電子配對結(jié)合使DPPH的特征紫色消失,褪色的程度和自由基清除劑的電子數(shù)量存在定量關系，因此可用分光光度計進行快速定量分析從而用于抗氧化劑清除自由基能力的評價。與其他體外抗氧化法相比，清除DPPH自由基法更加快速、簡單、靈敏，因而被廣泛應用。

圖1 鳳仙花不同部位提取物對DPPH清除活性

鳳仙花各部位乙醇提取物對DPPH清除率的分析如圖1所示，在此實驗中，以Vc為對照，在試驗濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的升高，Vc及各樣品對DPPH自由基的清除率都呈現(xiàn)增長的趨勢，且各樣品對DPPH自由基清除率在濃度較低時上升較快，在濃度較高時上升較慢。各試驗樣品對DPPH清除能力大小從高到低分別為：Vc >鳳仙花的葉提取物>鳳仙花的花提取物>鳳仙花的莖提取物。當濃度達到1.00 mg/mL時，Vc對DPPH自由基的清除率高達98.03%，鳳仙花的葉提取物對DPPH自由基也具有較好的清除能力，清除率為88.53%。

2.2.2 對超氧陰離子自由基清除活性的測定結(jié)果

人體內(nèi)大部分氧分子代謝生成水，但有約5%的氧分子受單一電子還原，從而成為超氧陰離子，超氧陰離子不僅是陰離子同時也是自由基，性質(zhì)十分活潑，具有很強的氧化性和還原性。超氧陰離子是氧自由基生成中的第一個自由基，是生物體生理反應常見的中間產(chǎn)物，作為活性氧的一種，可能引起細胞結(jié)構功能的破壞，從而導致組織損傷、衰老，誘發(fā)炎癥和腫瘤。

鄰苯三酚自氧化法是測定超氧陰離子自由基清除活性的常用方法，其主要機理為，鄰苯三酚在堿性條件下發(fā)生自氧化從而釋放超氧陰離子自由基，并生成有色中間物質(zhì)，該物質(zhì)在325 nm左右有特征吸收，當有抑制劑存在時，可以減少此中間物質(zhì)的積累，因此可通過比色法檢測該物質(zhì)的吸光度值來計算待測物質(zhì)對超氧陰離子的清除能力。

圖2 鳳仙花不同部位提取物對超氧陰離子自由基的清除活性

以Vc為對照，測定鳳仙花各部位提取物清除超氧陰離子的能力，結(jié)果如圖2所示。從圖中可以看出，在試驗所測定濃度范圍內(nèi)，各樣品對超氧陰離子自由基的清除率都隨著濃度的升高而升高。各試驗樣品對超氧陰離子清除能力大小從高到低分別為：Vc>鳳仙花的葉提取物>鳳仙花的花提取物>鳳仙花的莖提取物。其中Vc的上升趨勢較快，并且在濃度達到0.75 mg/mL時，Vc對超氧陰離子自由基的清除率已經(jīng)達到95%；鳳仙花各部位提取物對超氧陰離子自由基的清除率雖然有所升高，但趨勢較為緩慢，在1.00 mg/mL的濃度下，其抑制率不到40%，因此鳳仙花對超氧陰離子自由基具有一定的清除作用，但是較弱。

2.2.3 鳳仙花對羥自由基清除活性的測定

人體在生命活動氧化代謝過程中會產(chǎn)生各種各樣的自由基，而羥自由基是其中化學性質(zhì)最活潑、對機體危害最大的自由基。它能夠和多肽、蛋白、脂類、DNA，特別是鳥嘌呤核苷等發(fā)生反應，使得不飽和脂肪酸氧化，生成脂質(zhì)過氧化物，導致膜結(jié)構遭到破壞，從而使機體受到損傷與破壞，加快機體的衰老，引起腦缺血、帕金森氏癥、風濕性關節(jié)炎、呼吸窘迫綜合癥、心血管疾病和癌癥等疾病[1]。本試驗采用水楊酸法測定樣品對羥自由基的清除能力，水楊酸是最常用的捕獲劑，其羥基化產(chǎn)物是2,3-二羥基苯甲酸以及2,5-二羥基苯甲酸。過氧化氫和硫酸亞鐵溶液中的二價鐵離子發(fā)生Fenton反應產(chǎn)生羥自由基，用水楊酸捕捉高活性的羥自由基可產(chǎn)生有色物質(zhì)，且該有色物質(zhì)在510 nm處有最大吸收，若向反應體系里加入抗氧化劑，可以和水楊酸形成競爭從而減少有色物質(zhì)生成。因此本試驗通過分光光度計對有色物質(zhì)的吸光度進行測定達到間接測定自由基的目的，進而反應氧化應激水平。

圖3 鳳仙花不同部位提取物對羥自由基的清除活性

從圖3可以看出，在試驗濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增大，Vc對羥自由基的清除率上升較快，鳳仙花各部位提取物對羥自由基的清除率有緩慢的升高。當濃度在0.1 mg/mL左右時，各提取物的清除能力均高于Vc；當濃度達到0.25 mg/mL時，鳳仙花的葉提取物對羥自由基的清除率分別達到57.84%，基本與Vc(清除率為58.14%)相同；隨著濃度繼續(xù)升高，試驗樣品對羥自由基清除能力大小從高到低分別為：Vc>鳳仙花的葉提取物>鳳仙花的花提取物>鳳仙花的莖提取物；當濃度達到1 mg/mL時，鳳仙花的葉提取物對羥自由基清除率分別達到74.57%，具有較強的清除作用。

2.2.4 還原力測定

一種物質(zhì)的還原能力可以在一定程度上反應它潛在的抗氧化活性，通過給自由基提供電子而自身得到一個質(zhì)子，使自由基失活。通常來說，物質(zhì)的還原力越強，就表示其抗氧化活性越強。還原力測定的實質(zhì)就是檢測待測樣品能否成為好的電子供應者。本試驗以普魯士藍的生成作為檢測指標，待測樣品將Fe3+/鐵氰化物還原為Fe2+/鐵氰化物，反應體系溶液變?yōu)椴煌潭鹊乃{色，其在700 nm處有特征光吸收，吸光度大小反應待測樣品的抗氧化活性。

圖4 鳳仙花不同部位提取物還原力測定

由圖4可以看出，在試驗濃度范圍內(nèi)，試驗樣品還原力大小由高到低分別為：Vc >鳳仙花的葉提取物>鳳仙花的花提取物>鳳仙花的莖提取物。Vc還原力隨著濃度的增加而明顯增大，在濃度為0.25 mg/mL時，其還原能力達到1.4；鳳仙花各部位提取物的還原力與濃度存在量效關系，但還原能力一般，在濃度為1 mg/mL時，鳳仙花的花、莖、葉提取物的還原力分別為0.536、0.315、0.787。

3 結(jié) 論

3.1 鳳仙花的花、莖、葉三個部位均采用55%乙醇回流提取獲得提取物，但提取率有所差異，其中鳳仙花的花得率最高為33.32%，其次為鳳仙花的葉，鳳仙花莖的得率最低為22.40%；鳳仙花各部位醇提取物中多酚的含量也有差異，鳳仙花的葉的多酚含量最高為72.81 mg/g，其次為鳳仙花的花66.07 mg/g，而鳳仙花莖的多酚含量最低為37.07 mg/g，總黃酮的含量在花、莖、葉三個部位中為112.13～30.62 mg/g。

3.2 目前，沒有一種普遍通用的方法就能較為準確地定量測定某樣品的抗氧化能力，因此在評價某樣品抗氧化活性時，通常采用幾種不同的檢測方法。本文采用了DPPH自由基清除能力測定、羥自由基清除能力測定、超氧陰離子清除能力測定和還原能力測定，以Vc為對照，結(jié)果表明，鳳仙花各部位提取物均有不同程度的抗氧化活性，且抗氧化能力與濃度呈量效關系；綜合各個檢測方法，鳳仙花的葉相比花和莖，具有較強的自由基清除活性和還原力，但仍低于對照組的Vc，且都有劑量依賴性，其次是鳳仙花的花，而鳳仙花的莖抗氧化活性最低。

3.3 樣品的抗氧化活性與多酚、總黃酮含量之間存在一定的相關性。雖然未對其相關性作定量測定，但實驗結(jié)果表明，總的來說鳳仙花各部位的抗氧化活性與多酚、總黃酮含量有較為密切的關系，多酚及總黃酮含量越高的部位，其抗氧化活性也越強。

3.4 鳳仙花提取物中成分復雜，但其中的多酚可能是主要抗氧化成分之一。通過本實驗可知，鳳仙花的各部位特別是鳳仙花的葉，具有較好的綜合抗氧化能力，可以作為新型天然抗氧化劑的原料來開發(fā)利用。

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