何偉 李英 胡志娟 馬云娜 高占紅

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)發(fā)病機制復雜，主因是腎血流動力學及非血流動力學兩大因素綜合作用的結(jié)果，涉及到腎素-血管緊張素、降鈣素基因相關肽(calcitonin-gene-related peptide，CGRP)、內(nèi)皮素-1(endothelin，ET-1)等多種血管活性肽類物質(zhì)的相互作用。本研究應用糖尿病大鼠模型，觀察CGRP和ET-1在糖尿病大鼠腎組織的表達情況以及氯沙坦對兩種肽類物質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 糖尿病大鼠模型的建立和分組 選取體重120～150 g健康雄性Wister大鼠(河北醫(yī)科大學實驗動物中心供給)42只，隨機分成對照組、糖尿病組及氯沙坦組，每組14只。糖尿病組和氯沙坦組大鼠腹腔一次性注射鏈尿佐菌素(溶于0.1 mmol/L枸櫞酸緩沖液，pH值4.5)65 mg/kg，72 h后取尾靜脈血，測血糖 ＞16.65 mmol/L(美國強生One TouchⅡ血糖儀測定)，表明造模成功;正常對照組大鼠以等量枸櫞酸緩沖液一次性腹腔注射。氯沙坦組大鼠給予氯沙坦30 mg·kg-1·d-1灌胃，對照組和糖尿病組大鼠給予等量0.9%氯化鈉溶液灌胃。實驗期間大鼠自由進食、進水，不使用胰島素及其他降糖藥，每天測體重1次。于實驗第8周處死3組動物，處死前1 d采用代謝籠留取24 h尿液，測24 h尿蛋白定量;處死當天股動脈取血，分離血清測血糖、尿素氮、肌酐;取雙腎去包膜稱重。取部分腎組織置于4%多聚甲醛固定，用于免疫組織化學檢測;部分腎組織提取總RNA。

1.2 光鏡觀察及圖像分析 腎組織石蠟切片，HE染色，光鏡觀察。每張切片隨機選取20個腎小球，用自動圖像分析儀計算其平均截面積(average sectional acreage，AG)，并根據(jù)公式1.38/1.1(AG)3/2計算平均體積(average volume，VG)。

1.3 免疫組織化學染色 采用SABC法:石蠟切片經(jīng)二甲苯及乙醇脫蠟，滴加3%過氧化氫孵育5 min，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶;蒸餾水沖洗3次，每次2 min，0.01 mol/L PBS浸泡5 min，10 mmol/L的枸櫞酸鈉微波抗原修復10 min;自然冷卻后，加10%正常山羊血清封閉液室溫封閉10 min;傾去封閉液后滴加1∶100稀釋的一抗(兔抗小鼠CGRP和ET-1抗體)，4℃過夜(以PBS代替一抗作為陰性對照);0.01 mol/L PBS清洗5 min 3次，滴加辣根過氧化物酶標記的二抗工作液(山羊抗兔IgG)，37℃孵育20 min;0.01 mol/L PBS洗3次，每次5 min;滴加辣根過氧化物酶標記的鏈酶卵白素(1∶200稀釋)，37℃孵育20 min;0.01 mol/L PBS洗3次，每次5 min。滴加DAB試劑顯色，顯微鏡下控制顯色時間，以組織中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性染色。自來水沖洗終止反應，蘇木精復染，常規(guī)脫水、透明、封片。在400倍光鏡下分腎小球、皮質(zhì)腎小管-間質(zhì)、外髓腎小管-間質(zhì)、內(nèi)髓腎小管-間質(zhì)各選10個視野，利用病理圖像分析系統(tǒng)測定陽性著色面積比×平均灰度，并求均值。

1.4 RT-PCR分析檢測腎組織CGRP與ET-1mRNA表達 采用TRIzol試劑(異硫氰酸胍-酸性酚一步法)提純各組腎組織總RNA，加入反轉(zhuǎn)錄體系于42℃進行3 h，將CGRP和ET-1的引物加入PCR反應體系，進行30～40次PCR循環(huán)。CGRP上游引物5’CGTGATCTTCTCTCTGCTGT3’，下游引物5’TTGACCCAGATGATGTCCAG3’;ET-1上游引物5’GACTCTTGCTCCTGTACCAG3’，下游引物5’CTCCCTGACTTTCATCTGAC3’。將PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中進行電泳，置于凝膠圖像分析系統(tǒng)(Bio-Rad公司，美國)進行吸光度掃描。

1.5 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗8周時3組大鼠一般情況及腎功能指標與對照組比較糖尿病組腎重/體重、血糖、24 h尿蛋白定量(TP/24 h)、肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)明顯增高(P＜0.01)。氯沙坦組腎重/體重、血糖、TP/24 h、SCr、BUN明顯低于糖尿病組而高于對照組(P＜0.05)。見表1。

表1 3組大鼠實驗8周后血糖、腎重/體重、TP/24、Scr和BUN比較n=14，±s

表1 3組大鼠實驗8周后血糖、腎重/體重、TP/24、Scr和BUN比較n=14，±s

注:與對照組比較，*P＜0.05，#P＜0.01;與糖尿病組比較，△P＜0.05

組別 血糖(mmol/L)腎重/體重(×10-3)TP/24(mg)Scr(μmol/L)BUN(mmol/L)對照組7.10±0.604.81±0.475.67±1.5142.35±1.798.11±0.46糖尿病組33.82±1.10#8.58±0.14#26.83±3.97#69.23±2.78#15.07±0.17#氯沙坦組28.18±1.15＊△6.62±0.18＊△14.33±2.42＊△52.44±1.73＊△11.90±0.98＊△

2.2 腎組織形態(tài)學改變 對照組大鼠腎小球未見異常;糖尿病組大鼠可見92%腎小球系膜細胞增生，基質(zhì)彌散性增高，AG和VG增大(P＜0.01);氯沙坦組AG和VG較糖尿病組下降，較正常組增大(P＜0.05)。見表2。

表2 3組大鼠實驗8周后腎小球AG和VG檢測結(jié)果比較n=14，±s

表2 3組大鼠實驗8周后腎小球AG和VG檢測結(jié)果比較n=14，±s

注:與對照組比較，*P＜0.05，#P＜0.01;與糖尿病組比較，△P＜0.05

組別AG(A/μm2×104)VG(V/μm3×106)0.95±0.091.19±0.15糖尿病組1.30±0.19#2.11±0.20#氯沙坦組1.11±0.12＊△1.59±0.14對照組＊△

2.3 免疫組化結(jié)果CGRP與ET-1在3組大鼠腎組織中均有表達，CGRP主要分布在腎小球固有細胞、腎小管上皮細胞及鮑曼氏囊中，ET-1主要分布于腎小球固有細胞、系膜細胞及腎小管上皮細胞中。免疫組化病理圖像分析結(jié)果示:與對照組相比糖尿病組腎組織中CGRP表達明顯降低，ET-1表達明顯升高(P＜0.01);氯沙坦組較糖尿病組腎組織CGRP表達明顯升高，ET-1表達明顯降低(P＜0.05)。見表3，圖1、2。

表3 3組大鼠實驗8周后CGRP與ET-1免疫組化染色均數(shù)比較n=14，±s

表3 3組大鼠實驗8周后CGRP與ET-1免疫組化染色均數(shù)比較n=14，±s

注:與對照組比較，*P＜0.05，#P＜0.01;與糖尿病組比較，△P＜0.05

CGRPET-1對照組組別2.85±0.190.46±0.15糖尿病組0.89±0.12#2.17±0.19#氯沙坦組1.76±0.14＊△1.29±0.18＊△

圖1 CGRP在3組腎組織中的表達(免疫組化×400)

圖2 ET-1在3組腎組織中的表達(免疫組化×400)

2.4 RT-PCR結(jié)果RT-PCR密度梯度掃描結(jié)果:與對照組相比糖尿病組腎組織中CGRP的mRNA表達明顯降低，ET-1的mRNA表達明顯升高;氯沙坦組較糖尿病組腎組織CGRP的mRNA表達明顯升高，ET-1的mRNA表達明顯降低。見圖3。

3 討論

CGRP是由37個氨基酸組成的活性多肽，是體內(nèi)最強的舒血管物質(zhì)之一;ET-1是由21個氨基酸組成的酸性多肽，是目前所知體內(nèi)作用最強的縮血管活性多肽之一。研究表明，CGRP是ET-1有效的內(nèi)源性拮抗劑，它通過下調(diào)ET-1受體的密度而拮抗ET-1的生物學效應，CGRP可以抑制致炎細胞因子，如TNF-β、IL-1和IL-2的產(chǎn)生，雙向調(diào)節(jié)IL-6的產(chǎn)生(小劑量增加，大劑量抑制)，增加NO和前列腺素的產(chǎn)生，抑制ET-1的合成［1，2］;而ET-1通過對血管的收縮作用，引起組織缺血、缺氧，造成高乳酸環(huán)境，可直接刺激CGRP的神經(jīng)興奮，引起CGRP的釋放增加，二者處于相對平衡狀態(tài)［3］。

圖3 3組大鼠腎組織中CGRP與ET-1mRNA的表達比較

本實驗結(jié)果顯示糖尿病組較對照組腎重/體重、血糖、TP/24 h、SCr、BUN明顯增高，腎小球AG和VG增大，表明糖尿病組出現(xiàn)腎臟功能和形態(tài)的改變，檢測CGRP表達減少，其mRNA表達下調(diào)，而ET-1表達升高，其mRNA表達上調(diào)，表明CGRP與ET-1的失衡在糖尿病腎病發(fā)病中存在一定作用。文獻報道，糖尿病患者血漿ET增加，可使血管內(nèi)皮細胞受損，內(nèi)皮細胞損傷可導致組織缺、缺血，CGRP免疫反應纖維減少，使CGRP釋放減少［3，4］;并且一氧化氮合酶(nitricoxide synthase，NOS)減少，不能介導CGRP釋放增多，引起CGRP，減少［5］。高血糖狀態(tài)損傷血管內(nèi)皮細胞引起ET-1的大量釋放;缺氧、血管內(nèi)皮細胞損傷，高胰島素血癥，高三酰甘油血癥等因素可促進ET-1合成及釋放增多。在糖尿病腎病中，隨CGRP下降，ET升高，使血管的舒張作用及內(nèi)皮的保護作用減弱，誘導血管收縮，微循環(huán)障礙，造成出、入球小動脈收縮加重，特別是出球小動脈，引起腎小球內(nèi)高灌注、高濾過、高壓的三高狀態(tài)，從而出現(xiàn)蛋白尿;隨病情進展，轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)上調(diào)，促進血管平滑肌細胞、系膜細胞的增殖，腎小球體積增大，繼而腎小球硬化，降低腎小球的濾過率，造成腎功能受損。

糖尿病的發(fā)生、發(fā)展中，腎臟局部RAS系統(tǒng)活性增強，應用氯沙坦有明確治療作用。本實驗顯示氯沙坦治療組較糖尿病組比較腎功能指標明顯減輕，腎小球肥大減輕;并且CGRP表達增加，其mRNA表達上調(diào)，而ET-1表達減少，其mRNA表達下調(diào)，表明氯沙坦的腎臟保護機制與CGRP與ET-1的拮抗作用有一定關系。氯沙坦有效地拮抗血管緊張素Ⅱ作用，降低TGF-β的分泌，阻斷ET的生理功能，促進CGRP的合成，從而緩解CGRP與ET-1的失衡，降低血壓，改善腎臟的血流動力學，減輕腎小球毛細血管收縮，使毛細血管壓降低，改善腎小球高濾過狀態(tài)，從而減少尿蛋白;緩解CGRP與ET-1的失衡，可增強細胞保護，抑制血管平滑肌細胞增殖，從而延緩腎小球硬化和腎功能惡化［6，7］，起到對糖尿病腎病的保護作用。

1 Padilla Be，Cottrell GS，Roosterman D，et al.Endothelin-converting enzyme-1 regulates endosomal sorting of calcitonin receptor-like receptor and beta-arrestins.J Cell Biol，2007，179:981-997.

2 Hashitani H，Lang RJ，Mitsui R，et al.Distinct effects of CGRP on typical and atypical smooth muscle cells involved in generating spontaneous contractions in the mouse renal pelvis.Br J Pharmacol，2009，158:2030-2045.

3 Luo F，Ji N，Zhang S，et al.Changes of endothelin and calcitonin gene-related peptide concentrations in plasma during propofol anesthesia.J Newrosurg Anesthesiol，2009，21:47-50.

4 Wynne BM，Chiao CW，Webb RC.Vascular smooth muscle cell signaling Mechanisms for contraction to AngiotensinⅡand Endothlin-1.J Am Soc Hypertens，2009，3:84-95.

5 Haworth RS，Cuello F，Avkiran M.Regulation by phosphodiesterase isoforms of protein kinase A-mediated attenuation of myocardial protein kinase D activation.Basic Res Cardiol，2011，106:51-63.

6 Edvinsson L.Calcitonin gene-related peptide and migraine.Increases understanding of physiopathology can lead to new drug therapy.Lakartidningen，2010 Dec 15-21:3208-3211.

7 Hofman C，Rosenthal T，Winaver J，et al.Renal and systemic effects of endothelin-1 in diabetic-hypertensive rats.Clin Exp Hypertens，2011，33:444-454.