劉蘇健 范波 丁明超 王意忠 王斌

近年來(lái)，動(dòng)脈硬化及其閉塞性血管疾病的發(fā)生率迅速升高，自體靜脈移植是治療外周血管疾病的有效手段。然而移植血管中膜平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)向內(nèi)膜遷移、過(guò)度增殖和細(xì)胞外基質(zhì)大量合成是導(dǎo)致血管移植術(shù)后移植靜脈內(nèi)膜增厚、管腔狹窄的重要原因［1］。如何防治血管內(nèi)膜增生一直是困擾血管外科醫(yī)師的臨床難題。RNA干擾(RNA interference，RNAi)是在轉(zhuǎn)錄后水平使得靶基因mRNA降解，從而使得目的基因表達(dá)減少或沉默［2］。本研究針對(duì)PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路中關(guān)鍵信號(hào)因子Akt亞型Akt1進(jìn)行RNA干擾，通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)觀(guān)察其抑制平滑肌細(xì)胞增殖的效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 質(zhì)粒pGenesil-1和感受態(tài)大腸桿菌DH-5α購(gòu)自武漢晶賽生物技術(shù)有限公司，Lipofectamine2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，DMEM培養(yǎng)基(Dulbcco's Modified Eagle Medium)和新生牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ、SalⅠ、PstⅠ和T4 DNA連接酶購(gòu)自New England Biolabs公司，質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，Annexin V-PE購(gòu)自Bender Medsystems公司。

1.2 方法

1.2.1 基因序列:利用Invitrogen網(wǎng)站(www.invitrogen.com)提供的設(shè)計(jì)工具設(shè)計(jì)目的靶基因兔Akt1 mRNA序列，依照shRNA設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)并合成4條shRNA片段，退火形成雙鏈后進(jìn)行酶切和測(cè)序，經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)后挑選出2條有效地Akt1 shRNA真核表達(dá)載體，一條為5’-GGGACUAGACCAUAAUCCATA-3’，另外一條為5’-CCTGGCUGACUUGAAUAUGTT-3’，陰性對(duì)照(錯(cuò)配質(zhì)粒shRNA)序列為5’-UUAGACCUCTGGUUCGUACTT-3’，確保選擇的shRNA與其他基因序列至少存在3個(gè)以上的堿基不同［3］。

1.2.2 合成shRNA序列DNA單鏈并測(cè)序:每條靶序列設(shè)計(jì)并合成所編碼shRNA的DNA前向和反向序列單鏈，經(jīng)退火形成雙鏈后成與相應(yīng)的黏性末端連接;再次退火連接、載體pGenesil-1質(zhì)粒線(xiàn)性化處理及回收、稀釋退火片段，用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒。經(jīng)測(cè)序鑒定無(wú)誤后命名為Akt1-shRNA-1和Akt1-shRNA-2。

1.2.3 分組及轉(zhuǎn)染:該課題設(shè)置空白對(duì)照組(A組)、陰性對(duì)照組(B組)，Akt1-shRNA-1(C組)，Akt1-shRNA-2(D組)。原代培養(yǎng)的第3代日本大耳白兔胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞于轉(zhuǎn)染前1 d接種于6孔板中，用2 ml含10%無(wú)抗新生牛血清的培養(yǎng)基定量;置于37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染時(shí)，按Lipofectamine2000操作步驟仔細(xì)操作，將DNA與Lipofectamine2000溶于無(wú)血清無(wú)抗的DMEM培養(yǎng)基中，將兩者吹打后混勻;室溫下孵育15～20 min，將混勻的轉(zhuǎn)染試劑用移液器加入到6孔板中，48 h觀(guān)察轉(zhuǎn)染效率。

1.2.4 FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡:將原第3代兔胸主動(dòng)脈細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞爬滿(mǎn)玻璃片后Lipofectamine2000脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染細(xì)胞:加入結(jié)合緩沖液分別兩次懸浮平滑肌細(xì)胞，將細(xì)胞懸液移入5 ml流式管中，加入5 μl Annexin V-PE和10 μl 7-AAD，室溫孵育15 min后加緩沖液至500 μl;流式細(xì)胞儀分析，凋亡細(xì)胞所占總細(xì)胞比例即為凋亡率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，分別于轉(zhuǎn)染后24、48、72、96 h處理細(xì)胞。

1.2.5 TUNEL檢測(cè)平滑肌細(xì)胞凋亡程度:將細(xì)胞接種于6孔板中，置孵育箱中培養(yǎng)，使細(xì)胞密度達(dá)到90%～100%。Lipofectamine2000脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染平滑肌細(xì)胞，培養(yǎng)6 h后給予換液，按TUNEL試劑盒操作步驟進(jìn)行操作，分別加入50 μl TUNEL液和50 μl轉(zhuǎn)化劑-POD，在濕盒中孵育30 min。PBS沖洗3次，加入200 μl DAB底物溶液，室溫孵育10 min，PBS沖洗3次后封片，在光鏡下分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兔平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng) 原代培養(yǎng)5～7 d后給予更換DMEM培養(yǎng)液，可見(jiàn)少量平滑肌細(xì)胞從組織塊邊緣游出(圖1);10～13 d可見(jiàn)組織塊邊緣有明顯的平滑肌細(xì)胞聚集，細(xì)胞呈帶狀、長(zhǎng)梭狀(圖2);采用α-SM-actin對(duì)兔原代培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定，見(jiàn)圖3。

圖1 原代培養(yǎng)5 d的平滑肌細(xì)胞，可見(jiàn)組織塊邊緣有小的平滑肌細(xì)胞游出

圖2 培養(yǎng)12 d的平滑肌細(xì)胞，呈現(xiàn)特征性“峰”“谷”生長(zhǎng)

圖3 α-SM-actin染色，陽(yáng)性呈棕黃色(TUNEL×400)

2.2 兔平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染第3代平滑肌細(xì)胞于48 h后在熒光顯微鏡下觀(guān)察，兩人分別同時(shí)計(jì)數(shù)相同視野下綠色熒光細(xì)胞與光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞總數(shù)，重復(fù)三次后取其平均值。見(jiàn)圖4。

圖4 平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h熒光照片，轉(zhuǎn)染細(xì)胞呈綠色，48 h轉(zhuǎn)染率為17.8%(TUNEL×200)

2.3 流式細(xì)胞儀計(jì)算細(xì)胞凋亡數(shù)目 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明24 h Akt1-shRNA-1和Akt1-shRNA-2組細(xì)胞凋亡率分別為15.97%和12.47%，在48 h凋亡率分別達(dá)到19.72%和15.43%，抑制增殖效果達(dá)到最高峰，轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，之后抑制增殖效果趨于平緩;A組與B組相比凋亡細(xì)胞數(shù)目差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)圖5、6。

2.4 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡數(shù)目Lipofectamine2000脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染第3代兔胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48 h用多聚甲醛固定平滑肌細(xì)胞，TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組相比細(xì)胞凋亡明顯增多(P＜0.05)。TUNEL結(jié)果顯示C組和D組均促進(jìn)凋亡的發(fā)生，以C組較為明顯。見(jiàn)圖7、8。

圖5 各時(shí)間點(diǎn)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡直方圖，A為空白對(duì)照組、B為陰性對(duì)照組，C為Akt1-shRNA-1，D為Akt1-shRNA-2。*為與A組和B組相比P＜0.05，各時(shí)間點(diǎn)A組與B組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)

圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)48 h細(xì)胞凋亡示意圖

圖7 兔血管平滑肌細(xì)胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h結(jié)果(TUNEL×100)

圖8 TUNEL檢測(cè)凋亡直方圖。A為空白對(duì)照組、B為陰性對(duì)照組，C為Akt1-shRNA-1，D為Akt1-shRNA-2

3 討論

隨著社會(huì)的發(fā)展，血管閉塞性疾病越來(lái)越給老年患者帶來(lái)痛苦，而除介入操作外血管搭橋術(shù)可解決血管外科大部分疾病的困擾，而血管移植術(shù)后再狹窄的主要原因之一是血管中膜平滑肌細(xì)胞的增殖和向內(nèi)膜遷移［2］。新生內(nèi)膜增生開(kāi)始于靜脈移植術(shù)后的早期，并最終可能導(dǎo)致移植血管管腔狹窄或閉塞［3］。血管移植術(shù)后移植血管再狹窄的發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、血管活性物質(zhì)參與已得到證實(shí)［4，5］。PKB(Akt)是PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路系統(tǒng)中一個(gè)重要信號(hào)位點(diǎn)，是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡的重要信號(hào)分子;Akt家族包括Aktl，Akt2，Akt3三個(gè)亞類(lèi)，它們的結(jié)構(gòu)相似但功能截然不同，Aktl可能參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和生存［6］。激活的Akt通過(guò)促進(jìn)下游靶位點(diǎn)如(mTOR)等磷酸化而發(fā)揮其廣闊的生物學(xué)效應(yīng)。通過(guò)影響信號(hào)通路來(lái)防治VSMC的增殖和促進(jìn)其凋亡是近年來(lái)血管外科領(lǐng)域基因研究的熱點(diǎn)。

RNAi技術(shù)有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)即高效性、高特異性和可遺傳性。目前已進(jìn)行的一些哺乳動(dòng)物細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用RNAi技術(shù)表明其可有效地抑制細(xì)胞靶基因的表達(dá)。目前尚未見(jiàn)有關(guān)利用RNAi技術(shù)抑制Akt1基因表達(dá)的文獻(xiàn)報(bào)道。本課題組應(yīng)用RNAi技術(shù)抑制VSMCs Akt1基因的表達(dá)。通過(guò)Lipofectamine2000將shRNA轉(zhuǎn)染入原代培養(yǎng)的兔胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)，利用熒光顯微鏡觀(guān)察其轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果顯示脂質(zhì)體成功地將shRNA轉(zhuǎn)染入原代培養(yǎng)兔胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)，48 h轉(zhuǎn)染率為17.8%;應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)于24、48、72、96 h檢測(cè)shRNA抑制平滑肌細(xì)胞增殖，結(jié)果顯示shRNA轉(zhuǎn)染后試驗(yàn)組細(xì)胞凋亡數(shù)目增加，48 h凋亡率最高，之后隨著時(shí)間延長(zhǎng)凋亡細(xì)胞逐漸減少。上述結(jié)果分別從蛋白和細(xì)胞水平驗(yàn)證了針對(duì)Akt1的shRNA有效地抑制了兔原代培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞的增殖，為下一步試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

1 Payeli SK，Latini R，Gebhaed C，et al.Prothrombotic gene expression profile in vascular smooth muscle cells of human saphenous vein，but not internal mammary artery.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2008，28:705-710.

2 Werth D，Grassi G，Konjer N，et al.Proliferation of human primary vascular smooth muscle cells depends on serum response factor.Eur J Cell Biol，2010，89:216-224.

3 劉蘇健，劉宏，趙京，等.大鼠Pik3cb短發(fā)卡狀RNA對(duì)平滑肌細(xì)胞增殖的影響.南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào).2008，28:1234-1239.

4 Scott NA.Restenosis following implantation of bare metal coronary stents:pathophysiology and pathways involved in the vascular response to injury.Adv Drug Deliv Rev，2006，58:358-376.

5 Chapman MJ.From pathophysiology to targeted therapy for atherothrombosis:A role for the combination of statin and aspirin in secondary prevention.Pharmacol Ther，2007，113:184-196.

6 Song G，Ouyang G，Bao S.The activation of Akt/PKB signaling pathway and survival.J Cell Med，2005，9:59-71.