孫璐，韋立新

（中國人民解放軍總醫(yī)院病理科，北京 100853）

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤預(yù)后生物標(biāo)志物的進(jìn)展

孫璐，韋立新

（中國人民解放軍總醫(yī)院病理科，北京 100853）

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤是一種異質(zhì)性腫瘤，捕獲與患者預(yù)后相關(guān)的分子和蛋白標(biāo)志物，建立生物標(biāo)志物預(yù)后模型來預(yù)測患者的不良結(jié)局和進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分層，對更好地管理患者和指導(dǎo)治療十分重要。

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤；預(yù)后；生物標(biāo)志物

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(Diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkins lymphoma，NHL)最常見的一種類型，占西方國家成人NHL的30%～40%。腫瘤具有異質(zhì)性，在基因改變、臨床特征、形態(tài)學(xué)表現(xiàn)、對治療的反應(yīng)和預(yù)后等方面存在著差異[1]。DLBCL的標(biāo)準(zhǔn)治療方案，如R-CHOP(利妥昔單抗、環(huán)磷酰胺、阿霉素、長春新堿和潑尼松)誘導(dǎo)的完全緩解率超過75%。然而目前的長期無事件生存率為50%～60%，而30%～40%的患者最終死于腫瘤[2]。捕捉反映腫瘤異質(zhì)性的預(yù)測指數(shù)，識別無法從現(xiàn)有治療獲益的DLBCL患者，能夠更好地管理患者和指導(dǎo)風(fēng)險(xiǎn)調(diào)整后的治療策略[3]。國際預(yù)后指數(shù)評分(International Prognostic Index，IPI)為DLBCL患者的管理提供預(yù)后指導(dǎo)，易于實(shí)施，是最重要的臨床預(yù)后評估工具之一。即使在利妥昔單抗時(shí)代仍是對DLBCL患者進(jìn)行危險(xiǎn)度分層的最有價(jià)值的工具。可是，IPI評分并不能完全代表疾病的異質(zhì)性，即使IPI評分相同的患者預(yù)后也存在很大差異[4]。因此，疾病的侵襲性和腫瘤進(jìn)展的差異與明顯的基因和分子異質(zhì)性相關(guān)。從而，學(xué)者們將重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到與患者預(yù)后相關(guān)的分子和基因標(biāo)志物的研究，以期建立某種模型來預(yù)測DLBCL患者的不良結(jié)局和進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分層，從而允許在高風(fēng)險(xiǎn)人群中試驗(yàn)新的治療方法是否能夠改善預(yù)后，并且保證研究人群中不會混有那些從標(biāo)準(zhǔn)治療中獲益的患者[5]。本文就國內(nèi)外文獻(xiàn)中報(bào)道較多的生物標(biāo)志物，尤其是繼基因表達(dá)譜分型(Gene expression profiling，GEP)后提出的一系列以免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry，IHC)方法模擬基因分型的新的生物預(yù)后模型做一綜述。

1 單個(gè)預(yù)后標(biāo)志物

淋巴瘤的惡性細(xì)胞出現(xiàn)遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)的累加變化，導(dǎo)致異常的基因活性和免疫表型，多條信號通路出現(xiàn)異常，使得瘤細(xì)胞持續(xù)增殖、逃避凋亡、不受抑制增殖和分化信號的調(diào)控、侵襲性生長和促進(jìn)血管生成。以上過程中的任意特殊分子的變化都可能成為腫瘤治療的選擇靶點(diǎn)和與預(yù)后相關(guān)的標(biāo)志物[6]。參與細(xì)胞循環(huán)的調(diào)控分子有TP53、p27KIP1、CyclinD和Ki-67，抑制細(xì)胞凋亡的蛋白有Survivin、BCL2和Caspases。在B細(xì)胞不同分化階段發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)化而形成的DLBCL，表現(xiàn)出細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)蛋白異質(zhì)性表達(dá)、免疫球蛋白基因不同狀態(tài)的突變，提示不同的癌基因起源，包括BCL-6、HGAL、CD10、CD5、FOXP1等，并且這些癌基因標(biāo)志物與患者預(yù)后相關(guān)。粘附分子主要參與炎癥部位淋巴細(xì)胞的回家和遷移，除正常生理功能外，還在腫瘤侵犯和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮作用。細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)和CD44陽性表達(dá)的DLBCL患者預(yù)后不良。血管生成是指從腫瘤外部的血管生成新的毛細(xì)血管，是腫瘤生長超出幾立方毫米的必須步驟，在成人受到多種促進(jìn)或抑制血管生長的調(diào)節(jié)蛋白的嚴(yán)格調(diào)控。外周血檢出高水平Endostatin或血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的患者預(yù)后差。惡性腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)過度破壞、新生血管密度增加和腫瘤擴(kuò)增與缺乏基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)相關(guān)。其他的單個(gè)分子預(yù)后標(biāo)志物還有nm23-H1、IL-10、肝細(xì)胞生長因子(HGF)和主要組織相容復(fù)合物分子。上述單個(gè)生物標(biāo)志物的研究提供了IPI之外的有價(jià)值的預(yù)后信息，豐富了我們關(guān)于淋巴瘤生長病理學(xué)機(jī)制的知識，但是大量的研究產(chǎn)生了矛盾的結(jié)果，不能得出統(tǒng)一的結(jié)論。其原因一方面在于多數(shù)研究是回顧性研究，存在固有的問題。另一方面，腫瘤的生長是復(fù)雜的生物學(xué)過程，涉及多個(gè)基因、多種信號通路和調(diào)節(jié)機(jī)制，單個(gè)基因或分子預(yù)測預(yù)后的能力有限，不能準(zhǔn)確反映惡性腫瘤的異質(zhì)性。

2 與腫瘤細(xì)胞起源相關(guān)的GEP分型和相應(yīng)的免疫組化分型方法

本世紀(jì)初，隨著基因芯片技術(shù)的運(yùn)用，Alizadeh等[7]和Rosenwald等[8]根據(jù)GEP將DLBCL分為生發(fā)中心B細(xì)胞樣亞型(Germinal center B cell-like，GCB)、與外周血活化B細(xì)胞具有類似基因表達(dá)特點(diǎn)的外周血活化B細(xì)胞樣亞型(Activated B cell-like，ABC)以及第3型(type 3，特點(diǎn)無法界定)。其中，GCB亞型預(yù)后較好，而ABC亞型與第3型預(yù)后相似且明顯差于GCB亞型，故歸為一類即非生發(fā)中心亞型(non-GCB)。GCB組和non-GCB組的5年生存率分別為76%和16%，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這種差異在不同IPI組之間也依然存在。現(xiàn)階段，因GEP技術(shù)復(fù)雜、價(jià)格昂貴、需要新鮮組織等因素不利于臨床推廣應(yīng)用，所以很多病理學(xué)家研究在DLBCL病例中利用免疫組織化學(xué)技術(shù)模擬基因芯片，對石蠟包埋的組織進(jìn)行分型，從而推測腫瘤細(xì)胞來源和預(yù)測臨床結(jié)局。

已經(jīng)報(bào)道的多種分型方法中，Hans、Choi和Tally法均來自美國Nebraska大學(xué)醫(yī)學(xué)中心[9-11]。研究者以GEP分型為金標(biāo)準(zhǔn)，分別對CHOP和R-CHOP治療后的DLBCL患者的腫瘤組織芯片(Tissue microarray，TMA)進(jìn)行不同IHC分型方法與GEP分型一致性的比較，其中Tally法與GEP分型的一致率達(dá)93%，被認(rèn)為一致性最好，Choi法和Hans法的一致率分別為87%和86%。三種IHC分型方法的敏感性和特異性均較好，并且GCB組患者的預(yù)后均優(yōu)于non-GCB組。Hans法最早被提出，目前在臨床應(yīng)用最為廣泛，該分型法選擇了一組與GCB和non-GCB分型高度相關(guān)的IHC抗體作為套餐(包括CD10、BCL-6和MUM1)，并被寫入2008年WHO淋巴造血系統(tǒng)腫瘤分類。有學(xué)者針對CHOP治療患者的研究證實(shí)了Hans等的發(fā)現(xiàn)[12-13]，但是一些研究未能發(fā)現(xiàn)Hans分型后的GCB和non-GCB兩組間預(yù)后有顯著差異[14-16]。李敏等[15]的研究認(rèn)為在Hans法的抗體套餐外增加GCET1和FOXP1的Choi法分型與預(yù)后顯著相關(guān)。有趣的事，Nyman等[12]還發(fā)現(xiàn)，Hans法分型與R-CHOP治療后DLBCL患者的預(yù)后顯著相關(guān)，GCB組預(yù)后更好，這與Mayer等[11]的發(fā)現(xiàn)相符合。Natkunam等[14]進(jìn)一步提出以單一的抗體LMO2作為研究因素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論是CHOP治療組還是R-CHOP治療組，LMO2陽性表達(dá)組患者無進(jìn)展生存和總體生存明顯優(yōu)于LMO2陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示LMO2蛋白表達(dá)同LMO2的mRNA表達(dá)一樣，對DLBCL患者有預(yù)后意義，并且不受治療方式的影響。但是Natkunam法分型與GEP分型的一致性最差。Nyman等[12]選用MUM1和FOXP1兩個(gè)代表活化B細(xì)胞的標(biāo)記，只要有一個(gè)陽性表達(dá)就劃分為活化B細(xì)胞亞型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)活化B細(xì)胞組較其他病例組的預(yù)后差。Muris等[17]選擇CD10、MUM1和BCL-2為IHC套餐對DLBCL進(jìn)行危險(xiǎn)度分層，提示結(jié)合了GCB與non-GCB及凋亡蛋白的分組較單純的僅區(qū)分細(xì)胞來源和僅比較細(xì)胞凋亡的分組更能有力預(yù)測患者預(yù)后，尤其是在高IPI組。盡管Nyman法和Muris法與GEP分型的一致率達(dá)到81%和77%，但是前者敏感性過低，而后者特異性較差[11]。Mayer等[11]在Choi法基礎(chǔ)上加入LMO2，作為CD10、GCET1、MUM1和FOXP1后仍無法明確分型時(shí)的權(quán)重因子，提出新的Tally分型方法；還進(jìn)一步驗(yàn)證，全部的分型方法都可以將患者分成總體生存和無事件生存不同的兩組，但每種分型方法的風(fēng)險(xiǎn)比值不同。除了Nyman法，通過其他方法劃分的亞型是獨(dú)立于IPI的生存預(yù)測因子。

造成各種IHC研究結(jié)果不一致的原因，既有生物學(xué)因素，又有技術(shù)因素。前者是與患者和治療相關(guān)的特征，如患者人群的異質(zhì)性和不同的治療藥物，后者包括染色的差別、TMA切片與整塊組織切片的差別、組織固定、一抗的差異和數(shù)據(jù)計(jì)分的主觀性。在上述各方法中使用的抗體中，BCL-6染色和計(jì)數(shù)的重復(fù)性最差。CD10陽性率低是導(dǎo)致Hans法將GEP分型中的GCB亞型錯(cuò)分為non-GCB亞型的原因之一。

3 考慮腫瘤微環(huán)境影響的GEP研究結(jié)果和相應(yīng)的免疫組化分型方法

Rosenwald等[8]的研究定義了4種基因印跡，它們在DLBCL中發(fā)揮不同生物學(xué)作用，與CHOP治療后的患者生存相關(guān)?！吧l(fā)中心B細(xì)胞”印跡提示預(yù)后好，與GCB樣和ABC樣分型平行?！霸鲋场庇≯E提示預(yù)后差，包括MYC及其目標(biāo)基因?！爸饕M織相容復(fù)合物Ⅱ”印跡在DLBCL部分亞群的腫瘤細(xì)胞中沉默，與預(yù)后差相關(guān)。“淋巴結(jié)”印跡提示預(yù)后好，反映了腫瘤微環(huán)境的性質(zhì)，包括細(xì)胞外基質(zhì)成分。由此可見，除腫瘤細(xì)胞外，DLBCL背景中非腫瘤細(xì)胞的類型和數(shù)量，即腫瘤微環(huán)境，也發(fā)揮著重要的作用，決定患者的預(yù)后[18]。最近，Lenz等[19]運(yùn)用GEP技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，DLBCL腫瘤微環(huán)境中非腫瘤細(xì)胞的不同組成成分及其特征可以預(yù)測患者的預(yù)后，尤其是編碼細(xì)胞外基質(zhì)成分的基因的表達(dá)與臨床結(jié)局有關(guān)。他們命名了兩個(gè)重要的基質(zhì)印跡Stromal-1和Stromal-2。Stromal-1反映細(xì)胞外基質(zhì)的沉積和單核組織細(xì)胞的浸潤，預(yù)示良好結(jié)局；而Stromal-2很大程度上反映了腫瘤間質(zhì)的血管生成和血管密度，預(yù)示不良結(jié)局。細(xì)胞外基質(zhì)包括纖維粘連蛋白、骨粘連蛋白(SPARC)、多種膠原和層粘連蛋白Isoforms和抗新生血管因子Thrombospondin。Meyer等[20]用抗SPARC抗體模擬Stromal-1印跡來評估DLBCL微環(huán)境中基質(zhì)細(xì)胞和組織細(xì)胞的表達(dá)，結(jié)果顯示腫瘤基質(zhì)中SPARC陽性表達(dá)組比陰性組有更長的生存期，二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Brandt等[21]發(fā)現(xiàn)聯(lián)合表達(dá)基質(zhì)標(biāo)記物纖維粘連蛋白和SPARC的DLBCL患者總生存期更長。Cardesa-Salzman等[22]通過測量DLBCL中的微血管密度模擬Stromal-2印跡，提示微血管密度高是預(yù)后差的相關(guān)因素。

隨后，有學(xué)者又在上述研究腫瘤微環(huán)境組成成分差異對DLBCL預(yù)后影響的基礎(chǔ)上，結(jié)合以往的以腫瘤細(xì)胞為主體的分型，提出了一個(gè)綜合性的新的生物預(yù)后模型[23]。該模型中以non-GCB細(xì)胞樣亞型，SPARC陽性細(xì)胞＜5%和微血管密度四分位數(shù)為4作為預(yù)后差的因素，每一個(gè)預(yù)后差的因素計(jì)1分。研究發(fā)現(xiàn)：生物計(jì)分低(0～1分)的組預(yù)后好，而生物計(jì)分高(2～3分)的組預(yù)后差；提示這一新的生物預(yù)后模型可以與IPI評分一起用于DLBCL的危險(xiǎn)度分層，并據(jù)此開展新的或風(fēng)險(xiǎn)適應(yīng)性治療。Alizadeh等[24]也認(rèn)為，通過分別測定一個(gè)反映腫瘤細(xì)胞來源的基因(LMO2)和一個(gè)反映腫瘤微環(huán)境的宿主細(xì)胞的基因(TNFRSF9)可以有力地預(yù)測DLBCL患者的預(yù)后。

4 小結(jié)

依據(jù)不同生物標(biāo)志物設(shè)定的免疫分型方法，對DLBCL患者預(yù)后的影響尚存在爭議。尤其是Hans分型方法，雖然目前應(yīng)用較普遍，但在Hans等[9]認(rèn)為預(yù)后較好的GCB類型中，同樣存在著少部分預(yù)后差的病例，不同的研究小組在免疫分型與預(yù)后相關(guān)性方面的研究結(jié)果也存在著分歧。同時(shí)本文中綜述的各種生物標(biāo)志物是否適用于中國人群，尤其是新的結(jié)合腫瘤細(xì)胞來源與微環(huán)境影響的綜合性生物標(biāo)記物模型，是少數(shù)西方研究者針對本地區(qū)病例研究后所得，國內(nèi)尚未見報(bào)道。綜上所述，有必要在國內(nèi)多個(gè)中心開展有關(guān)DLBCL的多種生物標(biāo)志物的深入研究，發(fā)現(xiàn)那些與中國DLBCL患者預(yù)后相關(guān)的標(biāo)志物，為認(rèn)識中國人群相關(guān)疾病特征和開展有針對性的治療提供理論依據(jù)。

[1] Stein H, Warnke RA, Chan WC, et al. Diffuse large B-cell lymphoma,not otherwise specified [M]//Swerdlow SH, Campo E, HarrisNL, et al. WHO Classification of Tumours of Haematopoietic andLymphoid Tissues. Lyon, France∶ IARC; 2008∶ 233-237.

[2]Coiffier B,Lepage E,Briere J,et al.CHOP chemotherapy plus rituximab compared with CHOP alone in elderly patients with diffuse large-B-cell lymphoma[J].N Engl J Med,2002,346(4)∶235-242.

[3]Dunleavy K,Pittaluga S,Czuczman MS,et al.Differential efficacy of bortezomib plus chemotherapy within molecular subtypes of diffuse large B-cell lymphoma[J].Blood,2009,113(24)∶6069-6076.

[4]Zelenetz A,Abramson J,Advani R,et al.NCCN clinical practice guidelines in oncology∶non-Hodgkin’s lymphomas[J].J Natl Compr Canc Netw,2010,8(3)∶288-334.

[5]Diaz-Cano SJ.General morphological and biological features of neoplasms∶integration of molecular findings[J].Histopathology, 2008,53(1)∶1-19.

[6]Lossos IS,Morgensztern D.Prognostic biomarkers in diffuse large B-cell lymphoma[J].J Clin Oncol,2006,24(6)∶995-1007.

[7]Alizadeh AA,Eisen MB,Davis RE,et al.Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling[J]. Nature,2000,403(6769)∶503-511.

[8]Rosenwald A,Wright G,Chan WC,et al.The use of molecular profiling to predict survival after chemotherapy for diffuse large B-cell lymphoma[J].N Engl J Med,2002,346(25)∶1937-1947.

[9]Hans CP,Weisenburger DD,Greiner TC,et al.Confirmation of the molecular classification of diffuse large B-cell lymphoma by immunohistochemistry using a tissue microarray[J].Blood,2004,103 (1)∶275-282.

[10]Choi WW,Weisenburger DD,Greiner TC,et al.A new immunostain algorithm classifies diffuse large B-cell lymphoma into molecular subtypes with high accuracy[J].Clin Cancer Res,2009,15(17)∶5494-5502.

[11]Meyer PN,Fu K,Greiner TC.Immunohistochemical methods for predicting cell of origin and survival in patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with rituximab[J].J Clin Oncol,2011,29 (2)∶200-207.

[12]Nyman H,Adde M,Karjalainen-Lindsberg ML,et al.Prognostic impact of immunohistochemically defined germinal center phenotype in diffuse large B-cell lymphoma patients treated with immunochemotherapy[J].Blood,2007,109(11)∶4930-4935.

[13]李合,王晉芬,郗彥鳳,等.Choi和Hans分型在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤預(yù)后評價(jià)中的意義[J].白血病·淋巴瘤,2010,20(5)∶292-295.

[14]Natkunam Y,Farinha P,Hsi ED,et al.LMO2 protein expression predicts survival in patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with anthracycline-based chemotherapy with and without rituximab [J].J Clin Oncol,2008,26(3)∶447-454.

[15]李敏,劉翠伶,尹文娟,等.中國人彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤新分類模型的預(yù)后分析[J].中華血液學(xué)雜志,2012,33(10)∶801-804.

[16]趙茜,傅衛(wèi)軍,張春陽,等.147例彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者的臨床特點(diǎn)及預(yù)后分析[J].中華血液學(xué)雜志,2013,34(9)∶737-740.

[17]Muris JJ,Meijer CJ,Vos W,et al.Immunohistochemical profiling based on Bcl-2,CD10and MUM1 expression improves risk stratification in patients with primary nodal diffuse large B cell lymphoma [J].J Pathol,2006,208(5)∶714-723.

[18]Lossos IS,Czerwinski DK,Alizadeh AA,et al.Prediction of survival in diffuse large-B-cell lymphoma based on the expression of six genes[J].N Engl J Med,2004,350(18)∶1828-1837.

[19]Lenz G,Wright G,Dave SS,et al.Stromal gene signatures in large-B-cell lymphomas[J].N Engl J Med,2008,359∶2313-2323.

[20]Meyer PN,Fu K,Greiner T,et al.The stromal cell marker SPARC predicts for survival in patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with rituximab[J].Am J Clin Pathol,2011,135(1)∶54-61.

[21] Brandt S, Montagna C, Georgis A, et al. The combined expressionof the stromal markers fibronectin and SPARC improves the predictionof survival in diffue large B-cell lymphoma [J]. Exp HemotolOncol, 2013, 2(1)∶ 27-34.

[22] Cardesa-Salzmann TM, Colomo L, Gutierrez G, et al. High microvesseldensity determines a poor outcome in patients with diffuselarge B-cell lymphoma treated with rituximab plus chemotherapy[J]. Haematologica, 2011, 96(7)∶ 996-1001.

[23]Perry AM,Cardesa-Salzmann TM,Meyer PN,et al.A new biologic prognostic model based on immunohistochemistry predicts survival in patients with diffuse large B-cell lymphoma[J].Blood,2012,120 (11)∶2290-2296.

[24]Alizadeh AA,Gentles AJ,Alencar AJ,et al.Prediction of survival in diffuse large B-cell lymphoma based on the expression of 2 genes reflecting tumor and microenvironment[J].Blood,2011,118(5)∶1350-1358.

Research progress of prognostic biomarkers in diffuse large B-cell lymphoma.

SUN Lu,WEI Li-xin.Department of Pathology,PLA General Hospital,Beijing 100853,CHINA

Diffuse large B-cell lymphoma(DLBCL)is a heterogenous group of neoplasm.The discovery of specific genetic alterations and the assessment of protein expression lead to the identification of molecular markers capable of predicting the outcome of DLBCLpatients independently of clinical variables and finding better therapeutic target.

Diffuse large B-cell lymphoma;Prognosis;Biomarker

R733.4

A

1003—6350（2014）19—2879—04

2014-05-23)

韋立新。E-mail：73887391@qq.com

doi∶10.3969/j.issn.1003-6350.2014.19.1132