張忠奎,康道現(xiàn),劉太華,周 舟,王春梅,王 駿,唐麗君,陳業(yè)紅,冉玉平

龜分枝桿菌通常感染皮膚、軟組織和骨，宿主局部或全身防御功能缺陷或外傷往往是發(fā)病的內在因素。龜分枝桿菌屬于非結核分枝桿菌，其臨床表現(xiàn)與結核病或其它感染性疾病非常相似，臨床醫(yī)生很難根據(jù)患者的癥狀、體征和一般實驗檢查進行鑒別，從而給治療帶來很大困難。現(xiàn)報告1例龜分枝桿菌皮膚感染[1]的分離鑒定。

1 材料與方法

1.1材料 患者女，69歲，右小腿紅腫、結節(jié)、潰瘍伴疼痛6月，加重1月入院。6月前右下肢脛前被竹簽刺傷，隨后逐漸出現(xiàn)皮膚紅腫、結節(jié)、化膿、破潰，經“抗感染”治療，癥狀緩解不明顯。3個月前，多次查血糖>11.1mmol/L，診斷為“糖尿病”，“胰島素”控制血糖。1月前右小腿結節(jié)逐漸增多，部分結節(jié)隆起，呈暗紅色，膿血性分泌物滲出，觸痛明顯(圖1)。

病程中無畏寒、發(fā)熱、惡心、嘔吐、頭痛、腹痛、關節(jié)痛等不適，精神尚可，體力、食欲、睡眠正常。

實驗室檢查：血、尿、大便常規(guī)無明確異常。X線胸片：雙肺紋理稍增多，余未見確切異常。多次真菌鏡檢、培養(yǎng)陰性。3次革蘭染色未查見真菌。空腹血糖8.12(3.8～6.1)mmol/L，糖化血紅蛋白10.8(4.0%～6.5%)。

1.2組織病理 皮下組織慢性化膿性炎；大量急、慢性炎細胞浸潤，以小淋巴細胞為主(免疫表型檢測不支持淋巴組織增殖性疾病)，局部小膿腫形成，以皮膚附件周圍較為明顯。過碘酸雪夫(PAS)染色陰性，抗酸染色弱陽性(圖2、3)?？紤]：1.細菌感染，性質待定，2.糖尿病。

1.3細菌培養(yǎng)、分離、分子生物學鑒定。

1.3.1培養(yǎng) 創(chuàng)面分泌物沙堡瓊脂培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)4天，連續(xù)兩次培養(yǎng)出光滑、濕潤、不產色白色菌落(圖4)。涂片革蘭染色為陽性桿菌，抗酸染色陽性(圖5、6)。多次真菌鏡檢、培養(yǎng)陰性。

圖1 右膝關節(jié)數(shù)個紅色結節(jié)，破潰

Fig.1Erythematousnodulesandulcersontherightknee

圖2組織病理：皮下大量炎性細胞浸潤(HE×100)

Fig.2Histopathologyshowedsubcutaneousinflammatorycellsinfiltrated(HE×100)

1.3.2生化反應 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基28 ℃及35 ℃均可生長，暗處及光照均不產色，5%NaCl培養(yǎng)基(28 ℃)不生長，0.2%苦味酸鹽培養(yǎng)基不生長，鹽酸羥胺(500 μg/mL)培養(yǎng)基上生長，枸櫞酸鹽培養(yǎng)基(28 ℃)生長，鐵離子吸收試驗陰性，硝酸鹽還原試驗陰性，45 ℃不生長，耐熱觸酶試驗陰性，符合龜分枝桿菌生化特征。

圖3組織病理片示抗酸染色陽性桿菌(Ziehl-Neelsen×1000)

Fig.3Histopathologyshowedacid-fastbacilli(Ziehl-Neelsenstaining×1000)

圖4分泌物培養(yǎng)出光滑、濕潤、不產色白色菌落

Fig.4Smooth,moist,colorlesswhitecoloniesfromculturedsecretion

圖5菌落涂片鏡檢：長短不一、纖細分枝狀(Gram×1000)

Fig.5Colonysmearslenderbranchingbacilli(Gramstaining×1000)

1.3.3分子生物學鑒定 16S-rRNA及rpoB、hsp65

圖6菌落涂片抗酸染色陽性(Ziehl-Neelsen×1000)

Fig.6Colonysmearpositiveacidfaststain(Ziehl-Neelsenstaining×1000)

基因擴增方法[2-4]。以16S-rRNA引物(上游5′-GCGTGCTTAACACATGCAAGTC-3′，下游5′-TCCTCCTGATATCTGCGCATTC-3′)擴增后測序。rpoB引物序列：上游：5′-GGCAAGGTCACCCCGAAGGG-3′，下游：5′-AGCGGCTGCTGGGTGATCATC-3′，hsp65引物Tb11 (5′-ACCAACGATGGTGTGTCCAT-3′)，Tb12 (5′-CTTGTCGAACCGCATACCCT-3′), 擴增后測序比對。

2 結 果

以16S-rRNA引物擴增后測序結果：

于GenBank中做Blast比對，與龜分枝桿菌(Mycobacteriumchelonae)AB548610.1同源性達100%。

rpoB引物序列測序結果：

比對結果與龜分枝桿菌同源性為99%。

hsp65引物測序結果:

比對結果與龜分枝桿菌同源性仍為99%。最后診斷：1.龜分枝桿菌皮膚感染，2.糖尿病。

3 討 論

從患者腿部皮損分泌物分離培養(yǎng)出革蘭氏染色陽性桿菌和抗酸染色陽性桿菌，抗酸染色陽性桿菌除分枝桿菌外，還有諾卡氏菌、棒狀桿菌屬和紅球菌屬[5]，因此，需要做進一步鑒別。諾卡氏菌屬等3種菌都為革蘭氏染色陽性，但培養(yǎng)生長時間較短一般為1～3 d，而非結核分支桿菌培養(yǎng)生長時間至少需要2～3 d。對分離培養(yǎng)出的革蘭氏染色陽性桿菌進行了生化鑒定，生化反應、生物學特征和培養(yǎng)基上生長情況與龜分支桿菌的結果一致。

核酸序列分析技術已經用于細菌鑒定、種系發(fā)生及分類，臨床微生物實驗室正逐漸應用PCR技術，而其中廣譜PCR技術16S-rDNA常被用于細菌鑒定[6]。進行分子生物學鑒定，以16S-rRNA引物擴增后測序[7]，測序結果與龜分枝桿菌(Mycobacteriumchelonae)AB548610.1同源性達100%。分枝桿菌種類繁多，目前已鑒定到100多種。以rRNA基因為靶基因, 采用PCR直接測序方法,通過序列分析不僅可以鑒定病原菌, 還可以確定新發(fā)現(xiàn)病原菌在細菌分類系統(tǒng)中的位置。rRNA基因被稱為細菌的“活化石”,為高度保守基因。該基因進化速度十分緩慢, 據(jù)推算1%堿基的取代需要大約50×106年,因而使其具有生物鐘的特點,已用于細菌系統(tǒng)發(fā)育分類的目的基因。由于16S-rRNA基因序列具有細菌屬、種的特征,因而16S-rRNA基因(16S-rDN A)的序列測定已作為細菌分類和鑒定的金標準。經過序列比對后和膿腫分枝桿菌也是99%的同源性，因此，需要其他保守序列如hsp65，rpoB等聯(lián)合鑒定。膿腫分枝桿菌(Mycobacteriumabscessus)原為龜分枝桿菌(Mycobacteriumchelonae)膿腫亞種，它們之間整個16S-rRNA基因序列(約1 500 bp)僅相差4至8個堿基[8]。利用其他基因如hsp65、rpoB基因序列作為16S rRNA基因的補充，區(qū)分16S-rRNA基因不能區(qū)分的種[9-10]。本陽性分枝桿菌hsp65、rpoB擴增產物與龜分枝桿菌同源性均為99%，因此，我們認為該分枝桿菌為龜分枝桿菌。

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