杭亞平綜述，胡龍華，王小中審校

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗科，江西 南昌330006)

質(zhì)譜 (mass spectrometry，MS)作為一種分析手段已出現(xiàn)幾十年，1975年質(zhì)譜技術(shù)就已初步用于細菌的快速鑒定，但直到l988年基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)、電噴霧電離(ESI)等軟電離技術(shù)的出現(xiàn)才得到進一步快速發(fā)展。MALDI分析時激光以脈沖方式使分子電離，恰好與TOF檢測器相匹配，組成了MALDI-TOF MS，很適合微生物多種生物大分子的分析[1]。最近，在MALDI-TOF MS基礎(chǔ)上引入了全細胞質(zhì)譜(WC-MS)[2]，進一步縮短了細菌鑒定時間(最快僅1h)，使直接對來源于血液和尿液標(biāo)本的病原菌進行分析和鑒定成為可能，這是目前其它細菌鑒定方法所無法比擬的。

MALDI-TOF MS的基本原理是將樣品與過量的小分子基質(zhì)的混合溶液點加在樣品的靶盤上,用激光照射樣品與基質(zhì)形成的共晶體,基質(zhì)分子吸收能量與樣品解吸附并使其電離，樣品離子在TOF電場作用下加速飛過飛行管道，通過檢測飛行時間確定離子的唯一質(zhì)荷比,串聯(lián)質(zhì)譜，形成不同高度波譜峰的質(zhì)譜圖。MALDI-TOF MS技術(shù)通過微生物蛋白質(zhì)表達譜中的特征譜峰來區(qū)分細菌的屬、種、株，甚至不同亞型。最后用標(biāo)準(zhǔn)菌株或來源分型明確的菌株建立的細菌質(zhì)譜圖庫或相關(guān)軟件將檢測結(jié)果與細菌庫進行比較。模式匹配得出分?jǐn)?shù)，分值大于2.0鑒定到種；1.7～2.0之間鑒定到屬；小于1.7鑒定結(jié)果不可信，從而得到結(jié)果[1]。

1 MALDI-TOF MS的常規(guī)應(yīng)用

快速分離鑒定病原微生物，是臨床抗感染治療成功的關(guān)鍵。目前，大多數(shù)臨床實驗室仍然采用傳統(tǒng)的細菌鑒定手段，如標(biāo)本接種、分離培養(yǎng)、革蘭染色、生化反應(yīng)、血清學(xué)試驗，這些方法不但費時，且鑒定細菌能力有限，尤其對一些難生長或生長慢的細菌常常不能鑒定，即使自動化鑒定儀也常會出現(xiàn)無法鑒定的細菌。MALDI-TOF MS與傳統(tǒng)的檢測方法比較優(yōu)勢顯著，可實現(xiàn)對未知微生物的快速鑒定、分型、溯源以及毒力分析等，具有操作簡便、測定速度快、靈敏度高、特異性強、信息直觀、易于自動化、檢測范圍廣以及樣品的純度要求不高等優(yōu)點，將微生物的鑒定時間由以小時計算推進到分鐘計算，逐漸被臨床實驗室所采納，MALDI-TOF MS的出現(xiàn)或許將有可能取代一直以來傳統(tǒng)的微生物鑒定流程的主導(dǎo)地位，改變現(xiàn)有的臨床微生物鑒定模式。

1.1 MALDI-TOF MS對常見細菌的鑒定 對臨床大多數(shù)的標(biāo)本如鼻咽分泌物、咽拭子、尿液及血液等進行微生物過夜分離培養(yǎng)，將其菌落進行MALDI-TOF MS，一個樣本的分析時間只需幾秒鐘，并高通量檢測，整個鑒定周轉(zhuǎn)時間顯著縮短。MALDI-TOF MS能準(zhǔn)確鑒定一大類常見細菌，包括革蘭陽性菌和陰性菌，如葡萄球菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬、腸桿菌科細菌、非發(fā)酵革蘭陰性桿菌等。

Bright[3]等人利用212種細菌建立一個較為完善的細菌質(zhì)譜圖搜索引擎與應(yīng)用軟件MUSETM(the Manchester metropolitan university search engine)，在株種屬水平上的準(zhǔn)確率分別為79%、84%和89%。近年來，張明新等[4]復(fù)蘇560株臨床分離株，應(yīng)用MALDI-TOF MS與Vitek2鑒定結(jié)果比較，G+細菌鑒定符合率為94.6%；G-細菌鑒定符合率為96.7%；酵母菌鑒定符合率為95.0%，15株鑒定結(jié)果不符的菌株經(jīng)16S rDNA測序確認(rèn)，結(jié)果與MALDI-TOF MS鑒定符合率更高。

不動桿菌屬已經(jīng)成為院內(nèi)感染的常見病原菌，且鮑曼不動桿菌耐藥及多重耐藥性嚴(yán)重，不同種之間不動桿菌感染治療措施有所不同，目前臨床上通過表型、生化反應(yīng)鑒定得到的結(jié)果實際上是鮑曼不動桿菌群。Kishii K等[5]應(yīng)用MALDITOF MS對123株臨床分離的不動桿菌屬進一步鑒定，能夠確認(rèn)到種的有106株(86.2%),其準(zhǔn)確率達84.0%，而16株(13.3%)只能鑒定到屬，該研究還顯示皮氏不動桿菌的感染率超過了鮑曼不動桿菌達到34.1%。MALDI-TOF MS對于常規(guī)方法無法準(zhǔn)確區(qū)分的復(fù)合菌的鑒定是很有意義的，臨床上很多復(fù)合菌如不動桿菌、陰溝腸桿菌等，分類廣泛、亞群復(fù)雜，MALDI-TOF MS能把復(fù)合菌內(nèi)很多微生物鑒定到物種水平。

1.2 MALDI-TOF MS對難培養(yǎng)微生物 (苛養(yǎng)菌、微需氧菌、厭氧菌等)的鑒定 難培養(yǎng)微生物的鑒定一直是臨床微生物工作者面臨最棘手的問題。由于其生長慢、生化反應(yīng)不活躍，自動化鑒定儀及API鑒定條都很難鑒定。MALDI-TOF MS彌補了微需氧菌及厭氧菌等難鑒定、培養(yǎng)要求苛刻的病原體的生化鑒定方面的不足。近年來我們已利用MALDI-TOF MS實現(xiàn)了對流感嗜血桿菌[6]、幽門螺桿菌[7]及厭氧菌[8]等微生物的鑒定，大大降低了這類難培養(yǎng)微生物鑒定的漏檢率并縮短所需時間，最大限度地滿足了臨床的需求。

1.3 MALDI-TOF MS對真菌的鑒定 真菌的分類鑒定一直是國內(nèi)外研究熱點，常規(guī)形態(tài)學(xué)方法雖然直觀、簡便，但樣品前處理繁瑣、培養(yǎng)周期長、時效性差，無法滿足臨床快速準(zhǔn)確診斷的要求。MALDI-TOF MS可用來鑒定酵母菌、酵母樣菌、絲狀型真菌，Marklein等[9]利用MALDI-TOF MS對250株臨床分離的念珠菌進行鑒定，96%可準(zhǔn)確鑒定，van Veen S等[2]的鑒定結(jié)果也表明對酵母樣真菌的鑒定準(zhǔn)確率達85%。目前在絲狀真菌鑒定方面的報道較少，主要原因是絲狀真菌可表現(xiàn)出完全不同的表型影響蛋白圖譜形成、蛋白提取無標(biāo)準(zhǔn)程序及目前數(shù)據(jù)庫中參考圖譜有限。最近MALDI-TOF MS在絲狀真菌鑒定方面的應(yīng)用也有進展，譬如曲霉菌和青霉菌[10]，常規(guī)鑒定絲狀真菌還需進一步完善數(shù)據(jù)庫和建立分析前標(biāo)準(zhǔn)程序。

1.4 MALDI-TOF MS對結(jié)核及非典型分枝桿菌的檢測 結(jié)核及非典型分枝桿菌的營養(yǎng)要求高、生長緩慢、只能通過傳統(tǒng)的抗酸染色、羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)、PCR方法進行鑒定，費時、成本高、操作要求高及傳染性強。MALDI-TOF MS可以通過快速和準(zhǔn)確地獲取其特異的蛋白質(zhì)或全菌質(zhì)譜圖[11]，通過與數(shù)據(jù)庫的比對快速準(zhǔn)確得出結(jié)果，從而為分枝桿菌的種屬鑒定提供了一種快速、簡便的方法。

1.5 MALDI-TOF MS對病毒的檢測 雖然MALDI-TOF MS在病毒鑒定方面的應(yīng)用還不普遍，但MALDI-TOF MS被證實是加快病毒鑒定的一種方法。目前，大多數(shù)的研究集中在通過MALDI-TOF MS分析病毒特征，分析一些有意義的蛋白，例如衣殼蛋白[12]或病毒融合蛋白[13]。不同的病毒變異體的融合蛋白影響病毒的毒力，進而影響與宿主細胞的結(jié)合。

1.6 MALDI-TOF MS對細菌毒力因子的鑒定 在細菌毒力研究方面，MALDI-TOF MS對殺白細胞素(Panton-Valentine leukocidin，PVL)陽性的金黃色葡萄球菌檢測[14]的靈敏度為100%，特異性為90.6%，能在4448Da質(zhì)荷比質(zhì)譜峰處檢測到特異峰，該方法可快速完成金黃色葡萄球菌PVL的毒力鑒定。MALDI-TOF MS在真菌毒力方面也有很好的應(yīng)用，黃曲霉產(chǎn)毒株和非產(chǎn)毒株的質(zhì)譜圖存在顯著的差別，根據(jù)質(zhì)譜峰的不同，產(chǎn)毒黃曲霉菌株和非產(chǎn)毒黃曲霉菌株得以鑒別[15]。

2 質(zhì)譜的臨床應(yīng)用舉例

2.1 質(zhì)譜對菌血癥的診斷 近年來，菌血癥的發(fā)病率和致死率相當(dāng)高，快速準(zhǔn)確的血流感染病原菌鑒定對于臨床抗菌藥物的合理使用和病愈率的提高顯得至關(guān)重要。2010年首次報道了MALDITOF MS直接對陽性血培養(yǎng)瓶進行鑒定的應(yīng)用，使得直接對血液標(biāo)本的病原菌鑒定有了可能。隨后Stevenson[16]進行了類似的工作，嘗試縮短培養(yǎng)時間(4～6h)或不經(jīng)過分離培養(yǎng)直接從標(biāo)本中應(yīng)用MALDI-TOF MS鑒定細菌。在212例血培養(yǎng)陽性標(biāo)本中鑒定出170株(80.2%)，鑒定準(zhǔn)確率為95.3%，而且這種鑒定程序已經(jīng)被研發(fā)成了商業(yè)化的Bruke SepsiTyper Kit軟件包，取得了顯著的進展。血培養(yǎng)陽性標(biāo)本直接用于細菌鑒定的研究比較普遍[17]，但是仍需要長時間儀器報警及常規(guī)分析時間。與傳統(tǒng)的血培養(yǎng)金標(biāo)準(zhǔn)需要1～3d的增菌時間和1～2d的鑒定時間的檢測技術(shù)相比，MALDI-TOF MS可以在2～3h內(nèi)對陽性血培養(yǎng)瓶中致病菌進行檢測和鑒定，縮短了細菌分離培養(yǎng)時間，加快了病床周轉(zhuǎn)率，為臨床合理應(yīng)用抗生素治療提供了可靠的依據(jù)，減少了患者治療費用。MALDI-TOF MS直接微生物鑒定對于不同種類的培養(yǎng)瓶鑒定準(zhǔn)確度均較好，而且對于單一細菌陽性培養(yǎng)瓶的鑒定能力較強，但是對于葡萄球菌的鑒定率較低,可能無法或會忽略對混合菌的鑒定[18]。

2.2 質(zhì)譜對尿路感染(UTIs)的診斷 UTIs是人類常見感染性疾病，傳統(tǒng)的尿路感染診斷主要依賴于尿液分析、尿沉渣涂片革蘭染色鏡檢和細菌培養(yǎng)，但臨床更注重的是快速準(zhǔn)確的檢測技術(shù)，現(xiàn)如今利用MALDI-TOF MS的技術(shù)優(yōu)勢可以彌補常規(guī)方法的不足。有研究[19]對UTIs的220份尿液標(biāo)本進行常見細菌MALDI-TOF MS直接鑒定，當(dāng)細菌數(shù)量大于105CFU/ml,鑒定到屬的一致率92.7%，鑒定到種的一致率為91.8%，尤其對于大腸埃希菌，準(zhǔn)確率達97.6%。檢測時間縮短到小于30min，提示MALDI-TOF MS能快速、準(zhǔn)確地鑒定尿液標(biāo)本中的病原菌。雖然應(yīng)用MALDI-TOF MS對多微生物標(biāo)本直接鑒定只可以告知存在微生物及其豐度，剛好符合絕大多數(shù)UTIs患者臨床診斷治療中所關(guān)注的重點，所以從各種情況來看，MALDI-TOF MS對尿液標(biāo)本直接檢測幾乎是UTIs的配套診斷檢測方法。

2.3 質(zhì)譜在細菌耐藥監(jiān)測中的應(yīng)用 MALDI-TOF MS可通過檢測細菌針對不同抗菌藥物各種獲得性酶而明確其耐藥性。革蘭陰性桿菌對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥的最主要原因是產(chǎn)ESBLs酶和碳青霉烯酶。MALDI-TOF MS依據(jù)β-內(nèi)酰胺酶的水解作用、監(jiān)測β-內(nèi)酰胺類抗生素分子量的變化可以分析細菌的耐藥性，國內(nèi)外對碳青霉烯酶的研究熱點集中在攜帶 KPC、VIM、IMP、NDM 及 OXA革蘭陰性菌株上[20，21]。外膜蛋白與AmpC酶聯(lián)合是導(dǎo)致細菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥重要原因，國內(nèi)研究[22]將MALDI-TOF MS應(yīng)用于外膜蛋白OmpK36缺失的檢測，相較于傳統(tǒng)的SDS-PAGE技術(shù)優(yōu)勢明顯。革蘭陰性桿菌親緣性較強、抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜，MALDI-TOF MS對其耐藥性檢測效果較差，但此方法對葡萄球菌檢測結(jié)果較好，尤其是耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)，主要通過檢測MRSA(PBP2a)蛋白表達的差異來實現(xiàn)耐藥性的分析[23]。

MALDI-TOF MS對真菌藥敏試驗的檢測也有了長足的發(fā)展。基本原理是菌株在不同藥物濃度壓力下蛋白組表達差異，最后通過MALDI-TOF MS檢測蛋白譜的變化。在此基礎(chǔ)上監(jiān)測白色念珠菌蛋白質(zhì)的改變，顯示了MALDI-TOF MS測定藥物敏感試驗的可行性[24]。另外，MALDI-TOF MS結(jié)合PCR方法可以檢測到核苷酸突變，Ikryannikova[25]研究組在此方面貢獻突出，檢測到結(jié)核分枝桿菌blaTEM基因的突變。但總體來說，目前MALDITOF MS對細菌耐藥機制的檢測還比較困難。

3 質(zhì)譜目前仍存在的缺陷和展望

總之，MALDI-TOF MS技術(shù)可以快速、特異地鑒定常見細菌，以及很好地鑒定真菌、分枝桿菌、苛養(yǎng)菌及厭氧菌，利用其強大的優(yōu)勢改變了臨床微生物實驗室感染性疾病診斷的傳統(tǒng)格局。然而，技術(shù)的不夠完善及臨床需求的不斷提高，MALDITOF MS也有局限性。

MALDI-TOF MS難定量、最初的儀器成本高、對抗生素耐藥性和耐藥機制的檢測能力有限，無法鑒定混合菌，而且對于報告的結(jié)果缺乏統(tǒng)一的驗證和解釋。還有MALDI-TOF MS對不常見病原體缺乏相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫，這就要求我們必須加快完善罕見菌數(shù)據(jù)庫的速度來滿足臨床的要求。在日常工作中，MALDI-TOF MS靈敏度還不高，對一些進化過程中比較接近、蛋白表達相似的細菌的辨別有較大困難。比如，無法區(qū)分志賀菌和(或)O157大腸埃希菌與普通的大腸埃希菌，以及不能鑒別肺炎鏈球菌和輕型鏈球菌/口腔鏈球菌。另外微生物在不同環(huán)境條件下蛋白表達不同，所以MALDITOF MS要常規(guī)應(yīng)用于臨床必須要進行前處理程序的標(biāo)化和評價，保證技術(shù)的重復(fù)性，將會擴展MALDI-TOF MS在感染性疾病診斷的實際應(yīng)用。

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