田雅茹 焦艷梅 張 彤 吳 昊

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院感染中心，北京100069)

獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immune deficiency syndrome，AIDS)是人類感染人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)后導(dǎo)致免疫缺陷，并發(fā)一系列機(jī)會(huì)性感染及腫瘤，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡的綜合征。該病傳播速度快、病死率高，是危害極大的傳染性疾病之一。HIV主要有2種類型:HIV-1和HIV-2，其中HIV-1是引起艾滋病的主要病原。因此，目前艾滋病的防治研究主要是針對(duì)HIV-1進(jìn)行的。自從20世紀(jì)90年代后高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療(highly active antiretroviral therapy，HAART)應(yīng)用于艾滋病的臨床，使HIV-1患者的病毒載量下降及CD4+T細(xì)胞水平升高［1］，降低了HIV的發(fā)病率和病死率，顯著地改變了HIV-1感染者發(fā)展到AIDS的進(jìn)程，但是HAART需要堅(jiān)持終身用藥，這會(huì)引發(fā)藥物不良反應(yīng)、病毒耐藥突變和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)等問題［2］。長(zhǎng)期藥物治療會(huì)出現(xiàn)一些合并癥，包括心血管疾病、肝衰竭以及HIV相關(guān)神經(jīng)認(rèn)知功能障礙［3-5］，而且即使在HAART治療的前提下，一些患者體內(nèi)仍然存在持續(xù)低濃度的病毒血癥［6］。鑒于HAART的這些局限性及人們對(duì)抑制HIV-1感染機(jī)制理解的增加，研究者們開始致力于抗HIV-1的基因治療，即將人工合成的外源基因通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)導(dǎo)入靶細(xì)胞中，以外源基因的表達(dá)產(chǎn)物使靶細(xì)胞抵抗HIV-1的感染?；虔煼o論是作為獨(dú)立的治療方法，還是作為藥物的輔助方案，都顯示良好的發(fā)展前景。本文主要對(duì)近5年來該領(lǐng)域中的一些治療策略的新進(jìn)展進(jìn)行綜述，包括:①基于RNA的抑制劑，如反義RNA、RNA干擾、核酶、RNA誘餌和RNA適體;②基于蛋白的抑制劑，如顯性陰性突變體蛋白、細(xì)胞內(nèi)抗體、細(xì)胞內(nèi)趨化因子、融合抑制劑和鋅指核酶。同時(shí)探討了基因治療的應(yīng)用策略及目前轉(zhuǎn)基因方法的發(fā)展情況。

1 基于RNA的抑制劑

1.1 反義RNA

反義RNA(antisense RNA)是指與mRNA或DNA互補(bǔ)的小單鏈RNA分子，通過堿基配對(duì)形成mRNA/RNA或DNA/RNA的雜交雙鏈，從而抑制基因表達(dá)并加速其降解。天然的反義RNA廣泛存在于各類生物中，是細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)控的一種方式。近幾年來很多研究［7-8］通過人工合成的反義 RNA靶向HIV-1蛋白及靶細(xì)胞受體等的基因，與靶基因配對(duì)形成無功能的雙鏈從而封閉或調(diào)節(jié)靶基因功能及產(chǎn)物表達(dá)，有效地阻斷HIV在細(xì)胞中的復(fù)制。

Levine等［7］構(gòu)建了一種條件復(fù)制型慢病毒載體，表達(dá)靶向HIV-1包膜蛋白R(shí)NA的長(zhǎng)的反義RNA，并用這個(gè)載體轉(zhuǎn)染自體CD4+T細(xì)胞后再回輸?shù)交颊唧w內(nèi)。Tebas等［8］在對(duì)后續(xù)的研究中發(fā)現(xiàn)大多數(shù)這些患者在停止抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療后，其病毒載量下降，有一個(gè)患者測(cè)不出HIV-1 RNA的時(shí)間長(zhǎng)達(dá)104 d。目前這些反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物抑制HIV-1復(fù)制的實(shí)際機(jī)制還不明確，可能涉及促使HIV反義雙鏈的大量腺苷脫氨基，從而導(dǎo)致細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄停滯或者產(chǎn)生大量病毒無效突變。

1.2 RNA干擾

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指小雙鏈RNA在細(xì)胞內(nèi)特異性地誘導(dǎo)與之同源互補(bǔ)的mRNA降解，抑制相應(yīng)基因的表達(dá)，從而引起轉(zhuǎn)錄后基因沉默的現(xiàn)象［9］。目前研究的有微小 RNA(microRNA，miRNA)、小干擾 RNA(small interfering RNA，siRNA)、短發(fā)夾 RNA(short hairpin RNA，shRNA)均能夠介導(dǎo)RNA干擾作用。miRNA是一類廣泛存在于真核生物中的單鏈非編碼小分子RNA，通過與細(xì)胞內(nèi)靶mRNA 3'端-UTR區(qū)不完全互補(bǔ)配對(duì)或與靶mRNA完全互補(bǔ)配對(duì)來發(fā)揮抑制mRNA翻譯或降解靶mRNA的作用。Nathans等［10］研究表明 miR-29a能直接靶向HIV-1 nef基因，從而降低細(xì)胞內(nèi)的病毒水平，而miR-198可抑制反式轉(zhuǎn)錄激活因子(transactivator of transcription，Tat)的輔助因子Cyclin T1，限制HIV-1對(duì)單核細(xì)胞的感染［11］。這些研究［9-11］均表明細(xì)胞內(nèi)的天然miRNA對(duì)HIV-1的感染具有抑制作用，這也激起了很多研究者通過人工構(gòu)建miRNA以發(fā)揮對(duì)HIV-1更強(qiáng)的抑制作用的興趣。Liu等［12］構(gòu)建的mir-17－92可使HIV-1的復(fù)制受到有效的抑制。Aagaard等［13］構(gòu)建的三聯(lián)mir106b簇人工miRNA經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明對(duì)HIV-1復(fù)制表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制作用。

siRNA是由外源性雙鏈RNA(如病毒感染或人工插入)被細(xì)胞內(nèi)Dicer酶切割而成的具有21～22個(gè)堿基對(duì)的小雙鏈RNA分子。研究［14］表明，siRNA在抗病毒治療方面非常有效，而且已研發(fā)了一些RNA干擾的治療策略，來治療遺傳性疾病或傳染性病原體。因?yàn)槿藗儗?duì)HIV-1的生命周期和基因表達(dá)模式理解的比較多，所以HIV-1成為第1個(gè)被RNAi靶向的傳染性病毒。在RNAi治療中，由于能夠產(chǎn)生特異抵抗的病毒株，因此選擇合適的靶點(diǎn)很重要，目前已經(jīng)通過實(shí)驗(yàn)證明比較有效的靶點(diǎn)包括HIV基因組的病毒顆粒蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)因子(regulator of expression of virion proteins，Rev)、tat等基因［15］和宿主的核轉(zhuǎn)錄因子κB［16］(nuclear transcription factor κB，NF-κB)、CD4 受體、CC趨化因子受體5(CC chemokine receptor 5，CCR5)和CXC趨化因子受體4(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)等，抑制這些分子的表達(dá)可以有效地抑制病毒復(fù)制和感染過程。但是，最近有研究［17］發(fā)現(xiàn)，HIV存在一種交叉抵抗機(jī)制，即當(dāng)對(duì)某一種siRNA產(chǎn)生突變逃逸的同時(shí)，可以對(duì)另一種針對(duì)不同靶點(diǎn)的siRNA產(chǎn)生逃逸，目前具體機(jī)制仍然不清楚。這一發(fā)現(xiàn)為RNAi抗HIV治療靶點(diǎn)的選擇提出了更高的要求。鑒于宿主細(xì)胞基因產(chǎn)物在抗HIV RNAi治療中不易產(chǎn)生突變逃逸的優(yōu)點(diǎn)，目前，抗HIV新靶點(diǎn)的開發(fā)主要集中在與病毒復(fù)制相關(guān)的人類基因上。有些靶點(diǎn)已經(jīng)被用于實(shí)驗(yàn)性抗HIV治療，并取得了比較好的效果［18-19］。目前解決HIV-1突變逃逸的最好的方法是同時(shí)使用多個(gè)針對(duì)不同靶點(diǎn)的RNA干擾抑制劑［20］。Liu等［12］利用 mir-17 －92 多順反子的骨架結(jié)構(gòu)同時(shí)表達(dá)4個(gè)針對(duì)HIV-1不同位點(diǎn)的siRNA，使HIV-1的復(fù)制受到了有效的抑制。Ehsani等［21］依據(jù)miRNA作用于mRNA的3'端UTR區(qū)可以抑制靶基因翻譯的原理，將HIV-1 3'端UTR的部分互補(bǔ)序列插入到針對(duì)gag-pol基因和HIV-1的輔助受體CCR5基因的siRNA序列中，結(jié)果這種具有雙重功能的siRNA同時(shí)在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平抑制了基因的表達(dá)，并可避免病毒逃逸的產(chǎn)生。

為了防止RNA酶對(duì)siRNAs的降解，通常將siRNAs做成發(fā)夾狀，即shRNAs，再用慢病毒載體等導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。已經(jīng)有研究組［22］構(gòu)建了能穩(wěn)定下調(diào)CCR5表達(dá)的shRNAs，他們?cè)隗w外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)慢病毒載體投遞針對(duì)CCR5的shRNAs能有效地降低細(xì)胞CCR5的表達(dá)，并賦予細(xì)胞對(duì)CCR5嗜性毒株的抗性。研究者［23］先前已經(jīng)證明即使應(yīng)用單一的shRNAs也會(huì)顯著的抑制HIV-1，但是也觀察到HIV-1在RNA干擾的壓力下，通過其靶序列的突變而迅速逃逸。為了避免這個(gè)問題，針對(duì)HIV不同位點(diǎn)的多個(gè)有效的shRNAs組成的聯(lián)合體就可以長(zhǎng)期抑制HIV-1的復(fù)制，這種抗HIV-1的RNA干擾組合的基因療法將進(jìn)入臨床試驗(yàn)［24］。有研究［25］顯示shRNAs的表達(dá)是決定其毒性的關(guān)鍵因素。Kiem等［25］利用RNA聚合酶III啟動(dòng)子U6區(qū)過表達(dá)shRNAs可導(dǎo)致原始T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒性，為了避免shRNAs細(xì)胞毒性，可以利用轉(zhuǎn)錄活性較弱的RNA聚合酶III的H1啟動(dòng)子來降低shRNAs的表達(dá)，同時(shí)選擇一種強(qiáng)有力的靶向CCR5的shRNAs以保證能有效地下調(diào)CCR5的表達(dá)。這種優(yōu)化的組合方法使體外人原始T淋巴細(xì)胞和源自CD34+細(xì)胞的巨噬細(xì)胞的CCR5受體降低了25倍，并且沒有毒性作用［26］。

目前RNA干擾在基因治療方面仍然有許多問題需要解決。由于機(jī)體固有免疫反應(yīng)的激活和與內(nèi)源性RNA的功能競(jìng)爭(zhēng)，基于RNA的方法有潛在的脫靶毒性［27］及非特異性的免疫應(yīng)答，如果長(zhǎng)期應(yīng)用可能干擾內(nèi)源miRNA的功能［28］。

1.3 核酶

核酶是能酶促切割靶mRNA的反義RNA。按分子大小可分為大分子核酶和小分子核酶，大分子核酶由幾百個(gè)核苷酸組成，結(jié)構(gòu)復(fù)雜。小分子核酶僅含幾十個(gè)核苷酸，其中包括錘頭狀核酶、發(fā)夾狀核酶、丁型肝炎病毒核酶以及鏈孢霉線粒體合成酶與核酶復(fù)合體［29］。目前已有很多研究證明以核酶為基礎(chǔ)的用于治療HIV感染的相關(guān)策略。使用一種丁型肝炎病毒來源的核酶靶向HIV-1的tat和rev序列，體外觀測(cè)到靶mRNA被裂解，能使tat介導(dǎo)的反式激活水平降低62% ～86%［30］。提高核酶抗HIV-1效果的關(guān)鍵也是選擇合適的靶點(diǎn)，Mitsuyasu等［31］設(shè)計(jì)了針對(duì)vpr和tat基因重疊區(qū)的核酶 OZI，該核酶可以有效抑制HIV-1的復(fù)制，同時(shí)在長(zhǎng)期的細(xì)胞培養(yǎng)中核酶靶基因區(qū)的耐藥位點(diǎn)并沒有發(fā)生突變。此外，將核酶與靶RNA進(jìn)行共定位也可以達(dá)到理想的抗HIV-1效果。Unwalla等［32］將核仁小 RNA(small nucleolus RNA，snoRNA)U16區(qū)中1～2個(gè)莖環(huán)隨機(jī)插入錘頭狀核酶中，建立了一個(gè)錘頭狀核酶基因庫(kù)，通過與含有HSVTK基因的前病毒DNA共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，最終篩選出一個(gè)與U5區(qū)和gag基因部分同源的核酶序列，該核酶可以與靶RNA共定位于細(xì)胞核，從而有效地抑制HIV-1復(fù)制。為了防止發(fā)生HIV-1病毒的突變逃逸，可設(shè)計(jì)針對(duì)HIV-1基因的多個(gè)靶點(diǎn)的核酶。研究者［33］針對(duì)人CCR5 mRNA的7個(gè)靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)了多位點(diǎn)錘頭狀核酶Rz1－7，與單一錘頭狀核酶相比，該核酶對(duì)CCR5 mRNA表達(dá)水平的下調(diào)更為持久有效，幾乎完全阻止了HIV-1對(duì)細(xì)胞的感染。DiGiusto等［34］用慢病毒載體將核酶導(dǎo)入由HIV-1感染者體內(nèi)分離的自體CD34+細(xì)胞，然后將這些細(xì)胞再回輸?shù)交颊?不管有沒有進(jìn)行骨髓預(yù)處理)體內(nèi)去治療艾滋病相關(guān)淋巴瘤，證明了用慢病毒－核酶載體進(jìn)行基因改造細(xì)胞是安全的。

1.4 RNA誘餌

RNA誘餌作為一種外源性RNA，其序列與病毒復(fù)制過程中重要調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合的順式作用元件相似，通過競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白而起到抑制病毒復(fù)制的作用。以人免疫缺陷病毒tat蛋白的反式激活應(yīng)答(transactivating response，TAR)元件為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的TAR誘餌也可用于基因治療。研究者［34］將TAR誘餌與針對(duì)HIV-1 tat/rev的短發(fā)夾RNA及靶向CCR5的核酶共表達(dá)于一個(gè)慢病毒載體(rockville，MD)，這種三重組合的載體已經(jīng)獲得美國(guó)食品和藥物管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)用于艾滋病或淋巴瘤患者自體外周血干細(xì)胞移植的臨床試驗(yàn)。最近已經(jīng)進(jìn)行了I期臨床試驗(yàn)測(cè)試了這種載體，可以顯著抑制HIV-1的復(fù)制。

1.5 RNA適體

RNA適體是指體外篩選得到的能高親和力地結(jié)合目標(biāo)配體的單鏈寡聚核苷酸。盡管適體在抗HIV中展示出前景，但到目前為止，還沒有應(yīng)用抗HIV適體的臨床試驗(yàn)，可能因?yàn)轶w外篩選的適體在細(xì)胞內(nèi)也許不形成所需的三級(jí)結(jié)構(gòu)來有效地結(jié)合靶蛋白。近年主要研究的是利用適體介導(dǎo)siRNA的細(xì)胞特異性傳遞［35］。

2 基于蛋白的抑制劑

多數(shù)的蛋白抑制劑是從病毒載體長(zhǎng)末端重復(fù)序列中表達(dá)，但在一些情況下，它們是由插入病毒載體中的強(qiáng)大的啟動(dòng)子產(chǎn)生。

2.1 顯性陰性突變體

顯性陰性突變體是病毒蛋白的重要功能區(qū)出現(xiàn)突變。這種突變體蛋白可以和野生型病毒蛋白競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合靶位點(diǎn)，或與其形成多聚體，從而抑制正常病毒蛋白的功能。第1個(gè)用于抗HIV-1基因療法臨床試驗(yàn)的蛋白是艾滋病病毒Rev蛋白的突變體M10(Rev M10)。Rev M10蛋白通過阻斷單個(gè)剪接和未剪接的艾滋病病毒RNA從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的輸出，來阻止病毒顆粒的組裝及隨后的播散。目前這種突變蛋白仍然是一種最有效的抑制HIV復(fù)制的抑制劑。

2.2 細(xì)胞內(nèi)抗體、細(xì)胞內(nèi)趨化因子

細(xì)胞內(nèi)抗體和細(xì)胞內(nèi)趨化因子也是非常有效的HIV復(fù)制抑制劑。這些蛋白與病毒或細(xì)胞的靶蛋白結(jié)合，導(dǎo)致靶蛋白被蛋白酶降解。值得注意的是，這些靶蛋白包括HIV-1輔助受體CXCR4［36］。

2.3 融合抑制劑

融合抑制劑能夠在細(xì)胞表面與HIV-1的gp41結(jié)合而阻止病毒進(jìn)入細(xì)胞。這些阻斷HIV進(jìn)入細(xì)胞的蛋白可從反轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體鏈中表達(dá)，因而適合在基因治療中應(yīng)用。恩夫韋肽(FUZEON，羅氏)，俗稱T20，通過抑制病毒包膜與細(xì)胞膜融合所需的構(gòu)象改變來阻斷HIV進(jìn)入細(xì)胞，已于2003年被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于臨床實(shí)踐［37］。但是為了克服對(duì)T20已經(jīng)產(chǎn)生的耐藥性以及改進(jìn)T20的一些不足，如體內(nèi)生物利用度低、使用不便(皮下注射，2次/d)、價(jià)格昂貴等因素，需要研發(fā)新的融合抑制。最近研究了1種新的融合抑制劑，稱為C46，是由來自gp41的第2個(gè)七肽重復(fù)區(qū)的氨基酸組成，類似于T20，C46通過與HIV-1 gp41融合中間體的N末端卷曲螺旋核結(jié)合，阻止六螺旋體核心結(jié)構(gòu)的形成，從而阻止HIV-1與細(xì)胞的融合。與其他基于蛋白的抑制劑一樣，也能由反轉(zhuǎn)錄病毒載體表達(dá)并用于基因治療［38］。最近的一份報(bào)告［39］證實(shí)，與 tat/rev特異的shRNAs和靶向HIV膜蛋白基因的長(zhǎng)反義RNA(稱為VRX496)相比，C46的抑制HIV-1感染的效果更強(qiáng)。C46的一種膜錨定形式(maC46)能賦予非人類靈長(zhǎng)動(dòng)物造血干細(xì)胞對(duì)HIV的抵抗性。值得注意的是，在體外及人源化小鼠體內(nèi)接種HIV-1后，證明maC46賦予轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞選擇性優(yōu)勢(shì)的能力最強(qiáng)。西夫韋肽(sifuvirtide)是我國(guó)自主研發(fā)的第3代HIV-1融合抑制劑，研究［40］結(jié)果顯示，其具有顯著的抗病毒效果，且對(duì)T20耐藥毒株有很好的抑制效果，目前，該化合物已完成臨床Ⅱb期研究。

2.4 鋅指核酸酶

鋅指核酸酶是一種人工設(shè)計(jì)、表達(dá)的融合蛋白，包含2個(gè)結(jié)構(gòu)域:DNA結(jié)合鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域和核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域［41］，能專一性地結(jié)合特定基因組序列，然后其中的核酸酶內(nèi)切割靶DNA。當(dāng)這些雙鏈切口修復(fù)的時(shí)候，就會(huì)在分裂部位發(fā)生高頻缺失和插入。通過鋅指核酸酶破壞CCR5基因的編碼序列，會(huì)產(chǎn)生無功能的CCR5突變體，致使細(xì)胞對(duì)HIV的CCR5嗜性毒株具有抵抗性。在臨床前研究中，Perez等［42］報(bào)道了用腺病毒載體投遞針對(duì)CCR5氨基末端的基因編碼序列的鋅指核酸酶，導(dǎo)致人CD4+T細(xì)胞的CCR5等位基因破壞了50%。Holt等［43］將CCR5基因特異的鋅指核酸酶導(dǎo)入由人臍帶血和胎肝分離的CD34+細(xì)胞，結(jié)果CD34+細(xì)胞的CCR5等位基因破壞率大約為17%，他們估計(jì)有5%～7%的鋅指核酸酶處理的細(xì)胞可能在2個(gè)等位基因上發(fā)生了突變。目前所面臨的難題是，只能將鋅指核酸酶蛋白或基因轉(zhuǎn)錄單位短暫地轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞中，因?yàn)殇\指核酸酶穩(wěn)定表達(dá)可能引起基因毒性(來自染色體破壞，如易位)，而目標(biāo)是在引起單一突變后，就從細(xì)胞中清除核酸酶。

總之，雖然基于蛋白的方法在體外有強(qiáng)大的抗病毒效應(yīng)，但是不僅需要維持其足夠的表達(dá)水平，而且要避免在體內(nèi)的免疫原性，因?yàn)檎T發(fā)的免疫反應(yīng)會(huì)使其抗病毒活性喪失。因此，蛋白抑制劑進(jìn)入臨床試驗(yàn)中后，需要評(píng)估其效能和免疫原性。

3 目前基因療法的應(yīng)用策略

3.1 針對(duì)靶細(xì)胞受體

HIV-1與靶細(xì)胞的CD4受體及輔助受體CXCR4、CCR5結(jié)合是其感染細(xì)胞的早期步驟，因此通過上述基因療法使這些受體的表達(dá)減少來抑制HIV-1的感染是近年來的研究方向。但是由于遺傳研究［42-43］表明CD4的破壞會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的免疫缺陷，而CXCR4受體是造血干細(xì)胞歸巢和T細(xì)胞分化必不可少的受體，所以靶向這些受體可能不是一個(gè)可行的方法。相反，CCR5受體的破壞不影響免疫功能，具有CCR5受體32bp缺失的純合子突變體的人更耐受HIV的CCR5嗜性毒株，所以CCR5輔助受體作為靶向目標(biāo)，通過破壞CCR5來實(shí)現(xiàn)免疫系統(tǒng)抵抗HIV病毒的目的，這一方法將特別有前景，目前已經(jīng)有很關(guān)于這方面的研究［21-22，26，42-43］。

3.2 聯(lián)合策略

單一的抗HIV-1基因治療可能導(dǎo)致病毒突變逃逸的發(fā)生，而且應(yīng)用CCR5抑制劑治療的病例可能出現(xiàn)CXCR4嗜性和雙嗜性HIV-1毒株，因此聯(lián)合多個(gè)抗HIV-1基因治療的策略來抑制病毒生命周期的多個(gè)步驟以保護(hù)靶細(xì)胞是非常重要的［12，20-21，24，33］。通過這種方法，有研究組［44］已將多個(gè)抗HIV基因并入到一個(gè)單一的慢病毒載體。有研究［45］表明將針對(duì)CCR5的shRNAs、人類/恒河猴的嵌合TRIM5α(tripartite motif protein 5-alpha)和TAR誘餌共表達(dá)于一個(gè)慢病毒載體，這種抗病毒的三重組合在體外有效地抑制了來自CD34+細(xì)胞的巨噬細(xì)胞的HIV-1復(fù)制。這樣的做法還有，將一種膜錨定的融合抑制劑C46和多個(gè)針對(duì)tat/rev的shRNAs被聯(lián)合表達(dá)在一個(gè)慢病毒載體上［25］。盡管這些研究非常有前景，預(yù)計(jì)未來將會(huì)研發(fā)出更新的抗HIV-1基因制劑及更有效的組合方法。

4 抗HIV-1基因治療中的基因轉(zhuǎn)運(yùn)方法

目前在抗HIV-1基因治療研究中的基因投遞方法很多，如病毒載體中的反轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體等，非病毒載體中的免疫脂質(zhì)體和穿透肽介導(dǎo)的抗體靶向傳遞方法［46-47］。隨著納米技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了更多的材料和方法，如利用明膠、殼聚糖等多聚物以及樹狀大分子、納米粒子等非多聚物進(jìn)行藥物輸送［48］。本文著重探討近年來研究較多的慢病毒載體和抗體靶向傳遞。

4.1 慢病毒載體

由于慢病毒載體可以感染非分裂期的細(xì)胞，能夠高效的整合到細(xì)胞的基因組中，并穩(wěn)定傳遞到子細(xì)胞中長(zhǎng)期表達(dá)，所以應(yīng)用很廣，而且已經(jīng)有研究［49］證明第3代慢病毒載體用于人類是安全的，到目前為止還沒有報(bào)道插入性腫瘤的發(fā)生。但是在HIV-1靶細(xì)胞—巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞中由于存在髓系來源的抗HIV-1 限制因子 SAMHD1［50-54］(sterile α motif domain and HD domain-containing protein 1)，所以對(duì)于慢病毒載體的轉(zhuǎn)染不敏感。但猴免疾缺陷病毒(simian immunodeficiency virus，SIV)及HIV-2來源的Vpx蛋白能夠誘導(dǎo)SAMHD1降解來解除其抑制作用，據(jù)此原理，Bobadilla等［51］將一段 SIVmac/HIV-2來源的 Vpx序列引入慢病毒載體，顯著提高了慢病毒載體對(duì)巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞的感染能力。

4.2 抗體介導(dǎo)的靶向傳遞

抗體通過與抗原結(jié)合后內(nèi)化將siRNA靶向投遞至靶細(xì)胞中。實(shí)驗(yàn)中常用的抗體包括抗CD7和淋巴細(xì)胞功能抗原-1(lymphocyte function associated antigen-1，LFA-1)抗體等。但是能夠介導(dǎo)內(nèi)化的抗體并不容易制備，目前研究者常用穿透肽或免疫脂質(zhì)體與抗體相連后介導(dǎo)抗體內(nèi)化，并用于RNAi治療中，取得不錯(cuò)的結(jié)果。Kumar等［52］將CD7單鏈抗體與穿透肽形成能夠內(nèi)化的融合抗體，然后連接針對(duì)HIV-1 vif、tat基因以及針對(duì)宿主細(xì)胞CCR5基因的siRNA并注入人源化HIV-1病毒血癥的小鼠體內(nèi)，結(jié)果有效地抑制了HIV-1的復(fù)制并且增加了CD4+T細(xì)胞數(shù)量。Kim等［53］將靶向LFA-1的免疫脂質(zhì)體包裹CCR5 siRNA成為納米顆粒，注射病毒血癥的人源化小鼠能夠有效地抑制病毒的擴(kuò)增以及感染造成的CD4+T細(xì)胞減少。

5 結(jié)語(yǔ)

抗HIV-1的基因療法有許多可選方案，轉(zhuǎn)基因可以編碼以RNA為基礎(chǔ)的制劑，也可以編碼以蛋白為基礎(chǔ)的制劑。該領(lǐng)域面臨的主要問題是抗HIV基因的靶向?qū)Ｒ恍浴⒎乐共《镜挚剐院瓦@些制劑的潛在抗原性。鑒于在高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療中聯(lián)合應(yīng)用藥物所取得的成功，最有意義的做法是，設(shè)計(jì)出抗病毒基因聯(lián)合體共同表達(dá)于細(xì)胞的基因治療策略。相對(duì)于僅僅靶向細(xì)胞或病毒基因，靶向CCR5和病毒基因的聯(lián)合體有理論上的優(yōu)勢(shì)。鑒于現(xiàn)有的抗病毒基因的所有組成部分，這應(yīng)該是未來基因治療試驗(yàn)的目標(biāo)。

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