張志麗 陳兵剛 姜太一 喬錄新 吳 昊 陳德喜 張玉林*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院感染中心，北京100069;2.山東省濱州市中心醫(yī)院感染內(nèi)科，山東濱州251700;3.北京市肝病研究所，北京100069)

在高活性抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療(highly active antiretroviral therapy，HAART)時代，人類免疫缺陷病毒-1(human immunodeficiency virus-1，HIV-1)相關(guān)慢性合并癥——HIV-1相關(guān)神經(jīng)損傷(HIV-1 associated neurological impairment，HANI)逐漸顯現(xiàn)，成為影響患者生活質(zhì)量和預(yù)后的重要危險因素［1］。HANI發(fā)病機制目前尚不完全清楚。一般認為可能與HIV病毒感染所引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)炎性反應(yīng)有關(guān)。其核心是HIV首先通過CCR5(C-C chemokine receptor 5)和CXCR4(C-X-C chemokine receptor 4)受體于外周感染單核/巨噬細胞，由其攜帶病毒損傷并透過血-腦脊液屏障(blood brain barrier，BBB)進入CNS，定植或感染其中的小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞，從而導(dǎo)致局部炎性反應(yīng)，表現(xiàn)為炎性反應(yīng)細胞激活、細胞因子和趨化因子分泌增加以及病毒顆粒(包括病毒膜蛋白gp120)的釋放和氧化應(yīng)激反應(yīng)等，最終使得神經(jīng)元功能障礙及凋亡，累積發(fā)生神經(jīng)認知損傷(neurocognitive impairment，NCI)［2-4］。本研究擬通過原代神經(jīng)細胞培養(yǎng)，體外觀察HIV-1包膜蛋白gp120神經(jīng)毒性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料

Balb/C小鼠購自中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院〔實驗動物許可證號:SYXK(京)2009－0020〕;重組gp120 V3環(huán)多肽購自北京Sino生物公司;D-Glucose、β-actin單克隆抗體購自Sigma公司(美國);神經(jīng)細胞培養(yǎng)基Neurobasal、B27、青鏈霉素、1 × Hanks液、青/鏈霉素、Glutamax購自Gibco公司(美國);CytoTox96非放射性細胞毒性檢測試劑盒購自Promega公司(美國);抗微管蛋白2(MAP-2)抗體、抗bcl-2單克隆抗體購自Santa Cruz公司(美國);兔抗bax多克隆抗體購自Abcam公司(英國);Cy3標記兔抗小鼠IgG購自BioLegend公司(加拿大);牛血清白蛋白(BSA)、原位細胞凋亡檢測試劑盒(TUNEL)購自羅氏公司(美國);辣根過氧化物酶標記抗小鼠和抗兔二抗購自Jackson公司(美國);其他相關(guān)分析純試劑購自國內(nèi)生產(chǎn)公司。

1.2 原代神經(jīng)細胞培養(yǎng)和gp120 V3環(huán)神經(jīng)毒性試驗

動物實驗嚴格按照首都醫(yī)科大學(xué)動物保護及實驗動物操作規(guī)范執(zhí)行。取孕16 d后balb/C胎鼠腦組織，在顯微鏡下于低溫解剖分離液(1×Hanks平衡鹽溶液+2.5 mmol/L Hepes+30 mmol/L D-Glucose+2 mmol/L CaCl2+0.5 mmol/L MgSO4+2 mmol/L NaHCO3+0.03%BSA+1%青/鏈霉素)中剝除硬腦膜，分離出大腦皮質(zhì)。解剖分離液清洗2遍后輕柔吹打，200目篩網(wǎng)過濾后，1 500 r/min離心3 min，棄上清液，加神經(jīng)細胞培養(yǎng)液(Neurobasal+1×Glutamax+2%B27+1%青/鏈霉素)，接種入右旋多聚賴氨酸包被的細胞培養(yǎng)板。對于預(yù)加蓋玻片的培養(yǎng)板，預(yù)先依次將蓋玻片在100%丙酮中洗滌40 min，無水乙醇洗滌20 min，0.1 mol/L鹽酸洗滌40 min，蒸餾水洗滌10 min，高壓滅菌25 min;然后將蓋玻片放入培養(yǎng)板孔中經(jīng)由右旋多聚賴氨酸包被后使用。每孔分別加培養(yǎng)液0.5 mL(24孔板)、1 mL(12孔板)和2 mL(6孔板)。細胞接種濃度分別為每孔2.5×105(24孔板)、5.0×105(12孔板)和12×105(6孔板)，置于37℃、體積分數(shù)為0.05 CO2恒溫培養(yǎng)箱溫育，每3 d更換一半培養(yǎng)液。依據(jù)既往文獻［5］說明，于神經(jīng)細胞培養(yǎng)第7天，分別向培養(yǎng)基中加入 0、200、500、1 000 pmol/L重組gp120蛋白，37℃下孵育24 h，進行神經(jīng)毒性試驗。以上實驗都在超凈臺內(nèi)無菌條件下進行，相同條件重復(fù)3次，且繼續(xù)以下實驗。

1.3 神經(jīng)細胞毒性及凋亡檢測

通過FITC熒光標記的TUNEL檢測試劑盒評估細胞凋亡:4%多聚甲醛固定細胞，用磷酸鹽緩沖液沖洗后按TUNEL檢測試劑盒說明書操作，DAPI染色觀察細胞核形態(tài)。同時，通過測定培養(yǎng)基中的乳酸脫氫酶(LDH)來定量評估gp120的細胞毒性，培養(yǎng)基中LDH值越高則細胞凋亡/死亡比例就越高。按照商用乳酸脫氫酶試劑盒CytoTox96廠家說明書操作，簡言之，收集神經(jīng)細胞培養(yǎng)基與反應(yīng)底物各50 μL加入96孔板中室溫孵育30 min，再加終止液使反應(yīng)停止，通過Emax精密酶標儀(Molecular Devices)測定490 nm波長下樣本的吸光度。設(shè)定純神經(jīng)細胞培養(yǎng)基為陰性對照(0%死亡)，加入裂解液后細胞完全裂解的培養(yǎng)基為陽性對照(100%死亡)，每樣本測量3次取平均值。檢測樣本死亡細胞比例(%)=［(檢測樣本吸光度－陰性對照吸光度)/(陽性對照吸光度－陰性對照吸光度)］×100%。

1.4 神經(jīng)突起測量

通過抗MAP-2單克隆抗體免疫熒光顯像觀察神經(jīng)突起形態(tài)學(xué)變化，具體實驗步驟如下:4%多聚甲醛室溫固定15 min;1×PBS洗滌15 min;1%Triton穿孔15 min;1×PBS洗滌15 min×2次;1%BSA+2%羊血清+1×PBS 37℃封閉1 h;1∶1 000濃度MAP-2單克隆抗體(封閉液稀釋)4℃過夜;1×PBS洗滌15 min×3次;1∶1 000濃度Cy3標記抗小鼠二抗(封閉液稀釋)37℃溫育1 h;1×PBS洗滌20 min×3次;DAPI封片后于德國Leicadm500b型正向熒光顯微鏡下閱片并攝片(每個點至少選取3個視野，取平均數(shù));使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析神經(jīng)元突起數(shù)量和長度。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

細胞計數(shù)、神經(jīng)元突起長度分析使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件。使用PASW statistics 18統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料用均數(shù)±標準差(±s)表示，且給出雙側(cè)95%可信區(qū)間，組間比較采用單因素方差分析和多重均數(shù)比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 gp120可誘導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡

HIV包膜蛋白gp120能夠通過V3環(huán)與神經(jīng)元表面表達的趨化因子受體CCR5、CXCR4相互作用，直接或間接誘導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡。本實驗中，神經(jīng)細胞培養(yǎng)第8 天，向培養(yǎng)基中加入 0、200、500、1 000 pmol/L 重組gp120 V3環(huán)多肽37℃孵育24 h。TUNEL檢測顯示隨著gp120 V3環(huán)重組蛋白濃度增加，凋亡細胞數(shù)量明顯增加(圖1A)。通過培養(yǎng)基LDH檢測得出的不同濃度V3環(huán)細胞毒性所致細胞死亡比例分別為:(21.16±3.56)%(對照組)、(35.23 ±10.42)%(200 pmol/L組)、(57.45±9.26)%(500 pmol/L 組)、(62.21±14.35)%(1 000 pmol/L組)，除了500 pmol/L組與1 000 pmol/L組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義外(P＞0.05)，其余各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)(圖1B)。

圖1 gp120神經(jīng)細胞毒性Fig.1 HIV-1 envelope protein gp120 induced neuronal apoptosis

2.2 gp120可抑制神經(jīng)突起形成

本實驗中通過免疫熒光Cy3標記的抗神經(jīng)纖維特異性MAP-2抗體檢測gp120 V3環(huán)對神經(jīng)突起造成的損傷(圖2A)。對照組、200 pmol/L組、500 pmol/L組和1 000 pmol/L組平均每個神經(jīng)元突起數(shù)量分別為6.26±2.12、4.85±1.68、4.23±1.08和 3.81±0.86，除200 pmol/L組與500 pmol/L組，500 pmol/L組與1 000 pmol/L組外(P＞0.05)，其余各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(圖2B)。各組平均神經(jīng)突起長度為(900.24±169.06)μm(對照組)、(679.32±157.37)μm(200 pmol/L 組)、(445.64 ±56.13)μm(500 pmol/L組)和(173.39±29.58)μm(1 000 pmol/L組)。神經(jīng)突起長度隨gp120濃度增加而縮短(P＜0.01)(圖2C)。因此，HIV包膜蛋白gp120不僅誘導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡，還會抑制神經(jīng)突起形成。

圖2 gp120抑制神經(jīng)突起形成Fig.2 HIV-1 envelope protein gp120 inhibited neurite outgrowth

2.3 gp120 V3環(huán)的神經(jīng)毒性與bcl-2低表達有關(guān)

Gp120誘導(dǎo)bcl-2蛋白低表達，但對bax蛋白低表達無影響(圖3)?？梢奼p120 V3環(huán)通過抑制bcl-2表達來誘導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡。

圖3 蛋白印跡檢測不同條件下凋亡調(diào)控蛋白bcl-2與bax蛋白表達水平的變化Fig.3 The change of bcl-2 and bax protein expression under different experimental conditions via Western blotting

3 討論

HIV相關(guān)神經(jīng)認知障礙與感染HIV的單核細胞透過血-腦脊液屏障，在CNS產(chǎn)生炎性反應(yīng)有關(guān)［6］。除了受HIV感染的炎性反應(yīng)(單核/巨噬細胞系統(tǒng)和膠質(zhì)細胞)細胞釋放的各種炎性介質(zhì)外，感染的炎性反應(yīng)細胞還可以釋放HIV-1相關(guān)蛋白，繼而產(chǎn)生病毒蛋白相關(guān)的興奮性神經(jīng)毒性，導(dǎo)致癥狀輕重不等的神經(jīng)認知障礙［7-8］。HIV病毒調(diào)控元件包括長末端重復(fù)序列(long terminal repeat，LTR)、基因編碼的病毒蛋白Tat、Vpr、Nef和膜基因編碼的包膜蛋白 gp120與gp41 等［9］。

本研究發(fā)現(xiàn)gp120除了能夠誘導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡外，還能影響神經(jīng)突起的發(fā)育和生長，表明gp120在誘導(dǎo)神經(jīng)元細胞凋亡之前可能已經(jīng)抑制神經(jīng)突觸傳遞，從而影響神經(jīng)元功能［10-11］。與神經(jīng)細胞凋亡相比，gp120或其他病毒蛋白對神經(jīng)軸突與樹突的損傷性抑制，對于無癥狀性和輕度神經(jīng)認知障礙的發(fā)生可能更為重要［12-13］。除了誘導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡外，有研究［14-15］報道gp120還可通過蛋白激酶C途徑以及受體介導(dǎo)的Ca2+釋放，改變?nèi)四X微血管內(nèi)皮細胞中緊密連接蛋白的表達，導(dǎo)致細胞骨架的改變、單核細胞內(nèi)移增加。多項研究［16-18］證明gp120擾亂神經(jīng)細胞鈣穩(wěn)態(tài)、破壞線粒體膜完整性，導(dǎo)致細胞色素C釋放、激活caspase和核酸內(nèi)切酶，而gp120對神經(jīng)元鈣穩(wěn)態(tài)的破壞是通過干擾質(zhì)膜與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的鈣調(diào)控系統(tǒng)來實現(xiàn)的［19-20］。

Bcl-2家族蛋白通過調(diào)控線粒體外膜的透化作用，使神經(jīng)細胞暴露于多種不同的促死亡信號［21］。Bcl-2家族中主要抗凋亡成員Bcl-2的表達會降低線粒體外膜的透化作用，以及線粒體死亡誘導(dǎo)因子如Ca2+及細胞色素C向胞質(zhì)的釋放［22］。而bcl-2家族中主要促凋亡成員bax的表達作用相反。因此，線粒體膜的透化作用是gp120誘導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡的通路。本研究發(fā)現(xiàn)，重組人gp120 V3環(huán)多肽可誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡和抑制神經(jīng)突起形成，并呈濃度依賴性。同時，gp120 V3環(huán)誘導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡與抑制bcl-2表達有關(guān)。

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