覃基政 徐志宏 史冬泉 陳東陽 戴進 蔣青

（南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院關(guān)節(jié)中心，南京210008）

PRKAA2基因單核苷酸多態(tài)性與骨科術(shù)后深靜脈血栓的相關(guān)性研究*

覃基政 徐志宏 史冬泉 陳東陽 戴進 蔣青**

（南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院關(guān)節(jié)中心，南京210008）

背景：腺苷酸活化蛋白激酶α2亞基（AMPKα2）被證實參與調(diào)控血小板的活化過程，并可能通過調(diào)控肌細胞形態(tài)與功能影響血栓的發(fā)生、發(fā)展。

目的：探索 AMPKα2 的編碼基因 PRKAA2 單核苷酸多態(tài)性（rs2143749）與骨科術(shù)后深靜脈血栓（DVT）的相關(guān)性。

方法：共收集828例骨科手術(shù)患者，其中DVT組255例，術(shù)后發(fā)生DVT；非DVT組573例，術(shù)后未發(fā)生DVT。分析828例患者rs2143749的基因型和等位基因頻率，比較DVT組與非DVT組基因型和等位基因頻率的差異。

結(jié)果：DVT 組與非DVT組患者中rs2143749 的基因型和等位基因頻率無顯著性差異（P＞0.05）。

結(jié)論：PRKAA2 單核苷酸多態(tài)性（rs2143749）與骨科術(shù)后 DVT無相關(guān)性。

深靜脈血栓；PRKAA2；腺苷酸活化蛋白激酶α2亞基；骨科手術(shù)

Background:Adenosine monophosphate(AMP)-activated protein kinase α2 subunit(AMPKα2)encoded by protein kinase, AMP-activated,alpha 2 catalytic subunit(PRKAA2)is involved in the process of platelet activation,and plays an important role in regulating muscle cell function ultimately modulating the thrombogenesis.

Objective:To evaluate the association between the PRKAA2 polymorphism(rs2143749)and deep vein thrombosis(DVT) after orthopedic surgery.

Methods:A case-control study was performed in 255 DVT subjects(189 females and 66 males)and 573 matched controls without DVT(354 females and 219 males).Genotypic and allelic frequencies were compared between DVT subjects and control subjects.

Results:No significant difference was detected in genotypic or allelic frequencies between DVT subjects and control subjects(all P＞0.05).

Conclusions:PRKAA2 polymorphism(rs2143749)is not a risk factor for deep vein thrombosis after orthopedic surgery in the Chinese Han population.

下肢深靜脈血栓（deep vein thrombosis,DVT）是一種多因素共同作用引起的疾病，如遺傳變異、制動、懷孕、藥物、外傷和手術(shù)等[1-3]。其發(fā)病特征為血凝塊堵塞靜脈管腔，多發(fā)生于大腿和小腿靜脈[4]，其并發(fā)癥肺栓塞（pulmonary embolism,PE）是導致患者死亡的主要原因[5,6]。遺傳研究表明，基因變異可能在DVT形成發(fā)展中起至關(guān)重要的作用，抗凝血蛋白和凝血 因 子 的 編 碼 基 因 變 異 已 被 證 明 參 與 血 栓 形 成[7-9]。腺 苷 酸 活 化 蛋 白 激 酶（adenosine monophosphate kinase,AMPK）是由一個催化亞基（α）和兩個調(diào)節(jié)亞基（β和γ）組成的異三聚體，其中PRKAA2基因編碼了腺 苷 酸 活 化 蛋 白 激 酶 α2 亞 基（adenosine monophos-phate kinaseα2subunit,AMPKα2）[10]。已有研究證實，AMPK催化亞基的激活和失活能夠通過胰島素信號通路調(diào)控肌細胞中蛋白質(zhì)的合成和降解，進而影響肌細胞的形態(tài)和功能[11-15]，而骨骼肌收縮是維持正常血流 的 重要 因 素之 一[16,17]，因此 AMPK 可能通 過調(diào)控 肌細胞形態(tài)與功能來調(diào)節(jié)DVT的形成。體內(nèi)研究表明，AMPKα2參與血小板的活化，并能夠影響血塊的吸收和穩(wěn)定性[18]，因此 PRKAA2 基因變異可能導致血小板和肌細胞的功能異常，進而導致DVT的發(fā)生。目前，PRKAA2基因單核苷酸多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn)rs2143749與胰島素水平相關(guān)[19]，而尚未有關(guān)于 PRKAA2 基因單核苷酸多態(tài)性與骨科術(shù)后DVT的相關(guān)研究報道。本研究分析我院收治的828例骨科手術(shù)患者PRKAA2基因單核苷酸多態(tài)性（rs2143749）與術(shù)后DVT的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

共收集828例骨科手術(shù)患者，其中DVT組255例（女189例，男66例），術(shù)后發(fā)生DVT；非DVT組573例（女354例，男219例），術(shù)后未發(fā)生DVT。所有患者均于術(shù)后3～7 d內(nèi)進行下肢靜脈血管造影以明確DVT的診斷，造影觀察的靜脈包括：股靜脈、股淺靜脈、腘靜脈、脛前靜脈、脛后靜脈、腓靜脈等。DVT形成的診斷標準是靜脈管腔充盈缺損。

1.2 基因型分析

采 用 NucleoSpin Blood QuickPure 試 劑 盒（ 德 國Macherey-Nagel公司提供）抽提患者的 DNA，-20℃保存。使用 TaqMan 單核苷酸多態(tài)性基因分型檢測技 術(shù) 獲 取 不 同 患 者 PRKAA2 單 核 苷 酸 多 態(tài) 性（rs2143749）的基因型，結(jié)果由兩位研究者采用雙盲法獨立分析。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用 SPSS 12.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，卡方檢驗分析 PRKAA2 單核苷酸多態(tài)性（rs2143749）的基因型和等位基因頻率是否符合Hardy-Weinberg 平衡，采用Fisher的精確檢驗或卡方檢驗分析 DVT 組與非 DVT組的基因型和等位基因頻率之間的差異。按照性別和手術(shù)類型分層后，采用卡方檢驗分析PRKAA2單核苷酸 多 態(tài) 性（rs2143749）與術(shù)后 DVT 的相關(guān)性，P＜0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

DVT組和非DVT組患者的基本資料詳見表1。兩組患者 PRKAA2 單核苷酸多態(tài)性（rs2143749）的基因 型 和 等 位 基 因 頻 率 均 符 合 Hardy-Weinberg 平 衡（P=0.79 和 P=0.40，表 2）。相關(guān)性分析結(jié)果提示兩組患者的基因型和等位基因頻率之間無統(tǒng)計學差異（P=0.64 和 P=0.38，表 2）。此 外，GG 基因 型與 GC+ CC 基因型在兩組間相比無統(tǒng)計學差異（P=0.53，表3），CC基因型與GC+GG基因型在兩組間相比亦無統(tǒng) 計 學 差 異（P=0.39，表 3）。 因 此 ，在 DVT 組 和 非DVT組中未發(fā)現(xiàn)該位點基因型及等位基因頻率存在顯著性差異。

將所有患者進一步按性別進行分層：女性組中，DVT組和非DVT組患者的基因型和等位基因頻率之間無統(tǒng)計學差異（P=0.41 和 P=0.34，表 2），GG 基因型與GC+CC基因型在兩組間相比無統(tǒng)計學差異（P= 0.71，表3），CC基因型與GC+GG 基因型在兩組間相比亦無統(tǒng)計學差異（P=0.18，表3）；男性組中，DVT組和非DVT組患者的基因型和等位基因頻率之間無統(tǒng)計學差異（P=0.81 和 P=0.66，表 2），GG 基因型與 GC+ CC 基因型在兩組間相比無統(tǒng)計學差異（P=0.53，表3），CC基因型與GC+GG基因型在兩組間相比亦無統(tǒng)計學差異（P=0.97，表 3）。因此按性別分層后，女性組和男性組中未發(fā)現(xiàn)該位點基因型及等位基因頻率存在顯著性差異。

表1 表1患者的基本資料

表 2 PRKAA2 單核苷酸多態(tài)性（rs2143749）基因型和等位基因頻率分布

表3 按年齡、手術(shù)類型分層后PRKAA2單核苷酸多態(tài)性（rs2143749）基因型和等位基因頻率在兩組間的比較

將所有患者進一步按手術(shù)類型進行分層：膝關(guān)節(jié)組中，DVT組和無DVT組患者的基因型和等位基因頻率之間無統(tǒng)計學差異（P=0.63 和 P=0.47，表 2），GG基因型與GC+CC基因型在兩組間相比無統(tǒng)計學差異（P=0.76，表3），CC基因型與 GC+GG 基因型在兩組間相比亦無統(tǒng)計學差異（P=0.34，表 3）；髖關(guān)節(jié)組中，DVT組和無DVT組患者的基因型和等位基因頻率之間無統(tǒng)計學差異（P=0.50 和 P=0.35，表 2），GG基因型與GC+CC基因型在兩組間相比無統(tǒng)計學差異（P=0.66，表 3），CC 基因型與 GC+GG 基因型在兩組間相比亦無統(tǒng)計學差異（P=0.24，表 3）。因此按手術(shù)類型分層后，膝關(guān)節(jié)組和髖關(guān)節(jié)組中未發(fā)現(xiàn)該位點基因型及等位基因頻率存在顯著性差異。

3 討論

本研究首次探索了PRKAA2單核苷酸多態(tài)性（rs2143749）與骨科術(shù)后 DVT的相關(guān)性。DVT 組和非DVT組的基因型和等位基因頻率無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。將所有患者按性別、手術(shù)類型分層統(tǒng)計后，兩組的基因型和等位基因頻率亦無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），因 而 認 為 PRKAA2 單 核 苷 酸 多 態(tài) 性（rs2143749）與骨科術(shù)后DVT無相關(guān)性。

已有研究證實PRKAA2基因編碼的AMPKα2亞基參與調(diào)控血小板活化[18]。AMPKα2 亞基可以通過調(diào)節(jié)β3整合素的磷酸化來調(diào)節(jié)血小板活化和血栓形成后血凝塊的穩(wěn)定性，AMPKα2基因敲除將導致血塊 吸 收 能 力 缺 陷 和 血 凝 塊 穩(wěn) 定 性 降 低[18]。 此 外 ，AMPKα2 亞基還與全身胰島素敏感性相關(guān)[20]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，PRKAA2單核苷酸多態(tài)性（rs2143749）與胰島素水平和胰島素分泌相關(guān)[19]。由胰島素介導的蛋白信號通路參與調(diào)節(jié)平滑肌細胞的大小和功能[11-15]，胰島素同時能夠通過激活PI3-K 和AMPK 信號通路刺激血小板中一氧化氮（NO）的合成[21]，而肌肉正常收縮和NO生成分泌對維持正常的血流、抑制血栓形成起重要作用[16-17,21]。綜上所述，AMPKα2 亞基可能通過影響肌肉正常收縮和NO生成分泌參與血栓的發(fā) 生 、發(fā) 展 過 程 ，PRKAA2 單 核 苷 酸 多 態(tài) 性（rs2143749）則可能與 DVT 的發(fā)生相關(guān)。而本研究并未找到 PRKAA2 單核苷酸多態(tài)性（rs2143749）與骨科術(shù)后DVT的相關(guān)性，其有兩種可能：①PRKAA2單核苷酸多態(tài)性（rs2143749）確實與骨科術(shù)后 DVT 無相關(guān)性；②PRKAA2單核苷酸多態(tài)性（rs2143749）可能與骨科術(shù)后DVT有相關(guān)性，但由于樣本量過少，不足以檢測到兩者之間的相關(guān)性。

本研究指出，DVT組與非DVT組患者的基因型和等位基因頻率無統(tǒng)計學差異，PRKAA2單核苷酸多態(tài)性（rs2143749）與骨科術(shù)后 DVT 無相關(guān)性。本研究的不足之處：①本研究的樣本量過少，這可能是未發(fā)現(xiàn)PRKAA2單核苷酸多態(tài)性（rs2143749）與骨科術(shù)后DVT相關(guān)性的主要原因。②PRKAA2在體內(nèi)的表達和活性非常復(fù)雜，其調(diào)控能力可能與多種因素相關(guān)，這些因素很可能影響陽性結(jié)果的可見性。為明確PRKAA2單核苷酸多態(tài)性（rs2143749）與血栓疾病的相關(guān)性，需進一步探索PRKAA2單核苷酸多態(tài)性（rs2143749）與骨科術(shù)后 DVT 及其他類型靜脈栓塞性疾病的相關(guān)性，擴大中國人群樣本量，并在不同種 族 人 群 中 檢 測 PRKAA2 單 核 苷 酸 多 態(tài) 性（rs2143749）與骨科術(shù)后 DVT 的相關(guān)性。③深入研究PRKAA2編碼的AMPKα2亞基功能將有助于闡明PRKAA2 單核苷酸多態(tài)性（rs2143749）與骨科術(shù)后DVT的相關(guān)性，有助于闡明骨科術(shù)后DVT發(fā)病的具體機制。

[1]Bates SM,Ginsberg JS.Clinical practice.Treatment of deepvein thrombosis.N Engl J Med,2004,351(3):268-277.

[2]Kearon C.Epidemiology of venous thromboembolism.SeminVasc Med,2001,1(1):7-26.

[3]Rosendaal FR.Venous thrombosis:a multicausal disease. Lancet,1999,353(9159):1167-1173.

[4]Kearon C.Natural history of venous thromboembolism.Circulation,2003,107(23 Suppl 1):I22-130.

[5]Stein PD,Henry JW.Prevalence of acute pulmonary embolism among patients in a general hospital and at autopsy. Chest,1995,108(4):978-981.

[6]Peterson KL.Acute pulmonary thromboembolism:has its evolution been redefined?Circulation,1999,99(10):1280-1283.

[7]Ruf W,Disse J,Carneiro-Lobo TC,et al.Tissue factor and cell signalling in cancer progression and thrombosis.J ThrombHaemost,2011,9(Suppl 1):306-315.

[8]Wells PS,Anderson JL,Scarvelis DK,et al.Factor XIII Val34Leu variant is protective against venous thromboembolism:a HuGE review and meta-analysis.Am J Epidemiol,2006,164(2):101-109.

[9]De Stefano V,Rossi E,Paciaroni K,et al.Different circumstances of the first venous thromboembolism among younger or older heterozygous carriers of the G20210A polymorphism in the prothrombin gene.Haematologica,2003,88 (1):61-66.

[10]Steinberg GR,Kemp BE.AMPK in health and disease. Physiol Rev,2009,89(3):1025-1078.

[11]Tong JF,Yan X,Zhu MJ,et al.AMP-activated protein kinase enhances the expression of muscle-specific ubiquitin ligases despite its activation of IGF-1/Akt signaling in C2C12 myotubes.J Cell Biochem,2009,108(2):458-468.

[12]Mounier R,Lantier L,Leclerc J,et al.Important role for AMPKalpha1 in limiting skeletal muscle cell hypertrophy. FASEB J,2009,23(7):2264-2273.

[13]Lantier L,Mounier R,Leclerc J,et al.Coordinated maintenance of muscle cell size control by AMP-activated protein kinase.FASEB J,2010,24(9):3555-3561.

[14]Scott PH,Brunn GJ,Kohn AD,et al.Evidence of insulinstimulated phosphorylation and activation of the mammalian target of rapamycin mediated by a protein kinase B signaling pathway.ProcNatlAcadSci USA,1998,95(13): 7772-7777.

[15]Kimball SR,Horetsky RL,Jefferson LS.Signal transduction pathways involved in the regulation of protein synthesis by insulin in L6 myoblasts.Am J Physiol,1998,274(1 Pt 1):C221-228.

[16]Boushel R.Muscle metaboreflex control of the circulation during exercise.ActaPhysiol(Oxf),2010,199(4):367-383.

[17]Di Nisio M,Di Iorio A,Porreca E,et al.Obesity,poor muscle strength,and venous thromboembolism in older persons:the InCHIANTI study.J Gerontol A BiolSci Med Sci, 2011,66(3):320-325.

[18]Randriamboavonjy V,Isaak J,Fr?mel T,et al.AMPK α2 subunit is involved in platelet signaling,clot retraction,and thrombus stability.Blood,2010,116(12):2134-2140.

[19]Sproul K,Jones MR,Azziz R,et al.Association study of AMP-activated protein kinase subunit genes in polycystic ovary syndrome.Eur J Endocrinol,2009,161(3):405-409.

[20]Viollet B,Andreelli F,Jorgensen SB,et al.The AMP-activated protein kinase α2 catalytic subunit controls wholebody insulin sensitivity.J Clin Invest,2003,111(1):91-98.

[21]Fleming I,Schulz C,Fichtlscherer B,et al.AMP-activated protein kinase(AMPK)regulates the insulin-induced activation of the nitric oxide synthase in human platelets.Thromb Haemost,2003,90(5):863-871.

Association of a single nucleotide polymorphism in PRKAA2with deep vein thrombosis after orthopedic surgery*

QIN Jizheng,XU Zhihong,SHI Dongquan,CHEN Dongyang,DAI Jin,JIANG Qing**
（The Center of Diagnosis and Treatment for Joint Disease,Drum Tower HospitalAffiliated to Medical School of Nanjing University, Nanjing 210008,China）

deep vein thrombosis;protein kinase,AMP-activated,alpha 2 catalytic subunit;adenosine monophosphate-activated protein kinase α2 subunit;orthopedic surgery

國家杰出青年基金（81125013）；國家自然科學基金面上項目（30973046，81271945）

**通信作者：蔣青，E-mail:qingj@nju.edu.cn