倪小琴，賴衛(wèi)華*

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

牛乳酪蛋白檢測(cè)方法研究進(jìn)展

倪小琴，賴衛(wèi)華*

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

牛乳含有豐富的蛋白質(zhì)，是比較理想的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，但也是常見的過(guò)敏原之一。酪蛋白是牛乳中含量最高的蛋白，常作為牛乳過(guò)敏檢測(cè)的主要參考指標(biāo)之一。其檢測(cè)方法主要包括基于免疫學(xué)的方法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（polymerase chain reaction，PCR）、毛細(xì)管電泳分析、色譜法、質(zhì)譜法等，本文就其檢測(cè)方法的原理、特性及實(shí)際應(yīng)用進(jìn)行綜述，并對(duì)未來(lái)檢測(cè)的發(fā)展方向進(jìn)行展望。

酪蛋白；過(guò)敏原；檢測(cè)方法

牛乳制品是一種營(yíng)養(yǎng)豐富的蛋白制品，同時(shí)也是常見的八大過(guò)敏物質(zhì)之一，其致敏性嚴(yán)重影響了嬰幼兒的身體健康。根據(jù)修訂后的2007/68/EC[1]，歐盟法規(guī)規(guī)定在食品的生產(chǎn)加工過(guò)程中，若原料或產(chǎn)品中的某種成分來(lái)自附件Annex Ⅲa指定的過(guò)敏物質(zhì)時(shí)，必須在食品標(biāo)簽上明確標(biāo)出這些物質(zhì)的成分。據(jù)調(diào)查[2]，在發(fā)達(dá)國(guó)家中，牛乳過(guò)敏占過(guò)敏事件的3%～7.5%，嚴(yán)重影響了嬰幼兒的健康，部分甚至導(dǎo)致兒童死亡。而目前，對(duì)于食物過(guò)敏的最好最直接的辦法是嚴(yán)格避免食用含過(guò)敏原的食物，但在食品的加工生產(chǎn)過(guò)程中，會(huì)摻雜著少量潛在的致敏物質(zhì)，所以，人們亟需研究出能夠快速檢測(cè)食物中致敏物質(zhì)的方法，達(dá)到預(yù)防的目的。

牛乳過(guò)敏原引起的過(guò)敏反應(yīng)是一種由IgE介導(dǎo)和非IgE介導(dǎo)的超敏反應(yīng)，可引起皮膚、腸胃道、呼吸系統(tǒng)的反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)?dǎo)致系統(tǒng)過(guò)敏反應(yīng)或休克。牛乳蛋白常作為一種常見的食品添加劑，應(yīng)用在食品生產(chǎn)的很多方面，這些殘留的成分可能會(huì)引起致敏反應(yīng)。本文通過(guò)總結(jié)歸納目前國(guó)內(nèi)外常見的檢測(cè)牛乳酪蛋白的方法，簡(jiǎn)述各種方法的原理及其應(yīng)用，并對(duì)未來(lái)檢測(cè)的發(fā)展方向進(jìn)行展望。

1 檢測(cè)酪蛋白的原理

牛乳中含有3%～3.5%的蛋白質(zhì)，其中酪蛋白占總蛋白的80%[3]，是牛乳中最主要的過(guò)敏原之一。由于牛乳中酪蛋白含量較高，實(shí)驗(yàn)可通過(guò)檢測(cè)酪蛋白的有無(wú)來(lái)判斷食物中是否含有牛乳成分，以此作為過(guò)敏人群判斷食品成分的一個(gè)依據(jù)。基于此，本文主要對(duì)目前應(yīng)用在酪蛋白上的檢測(cè)方法進(jìn)行總結(jié)歸納。

2 牛乳過(guò)敏原酪蛋白的檢測(cè)技術(shù)

2.1 基于免疫學(xué)的分析技術(shù)

基于免疫學(xué)原理建立的檢測(cè)方法，是借助酶標(biāo)記的抗體或抗原進(jìn)行特異性結(jié)合的抗原抗體反應(yīng)，并根據(jù)顯色顏色的深淺來(lái)進(jìn)行定量或定性的分析方法。根據(jù)標(biāo)記物的顯色物質(zhì)的類型，將免疫類型可分為酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、火箭電泳免疫技術(shù)、時(shí)間分辨熒光免疫分析這四類。

在應(yīng)用免疫學(xué)方法檢測(cè)過(guò)敏物質(zhì)時(shí)，考慮到酪蛋白的種類較多，且有研究表明過(guò)敏患者中，存在著對(duì)酪蛋白的各種成分過(guò)敏的 人群，并且，發(fā)現(xiàn)人群中對(duì)β-、κ-酪蛋白過(guò)敏的同時(shí)也對(duì)α-酪蛋白過(guò)敏[4]，故在檢測(cè)食品中是否含有過(guò)敏物質(zhì)時(shí)，許多學(xué)者根據(jù)檢測(cè)特定的不同的物質(zhì)選用對(duì)應(yīng)的抗體和檢測(cè)原理，而在應(yīng)用抗體方面，主要有兩種來(lái)源：采用混合酪蛋白進(jìn)行免疫制備的多克隆抗體和購(gòu)買的針對(duì)某一種酪蛋白的單克隆抗體，本文在此基礎(chǔ)上，總結(jié)歸納了各種實(shí)驗(yàn)方法。

2.1.1 酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）

ELISA是在建立在酶標(biāo)記免疫的基礎(chǔ)上，通過(guò)酶標(biāo)記的抗體或抗原進(jìn)行特異性結(jié)合，同時(shí)根據(jù)酶反應(yīng)底物的顯色顏色深淺來(lái)進(jìn)行定量或定性分析的方法。目前，國(guó)內(nèi)外ELISA檢測(cè)的技術(shù)日益成熟，在過(guò)敏原檢測(cè)方面的研究很多。ELISA的種類有很多，應(yīng)用于食品過(guò)敏原檢測(cè)的常見方法主要有雙抗體夾心法和競(jìng)爭(zhēng)法兩類。鄧小芳[5]通過(guò)免疫BALB/c小鼠建立雙抗體夾心方法檢測(cè)到酪蛋白的最低檢出限為0.55 ng/mL，線性范圍為0.78～100 ng/mL。王碩等[6]也通過(guò)建立雙抗體夾心ELISA定量檢測(cè)牛乳中酪蛋白方法，以免疫BALB/c小鼠制備的抗酪蛋白單克隆抗體包被，HRP標(biāo)記抗酪蛋白的多抗，標(biāo)準(zhǔn)曲線在6～1 666 ng/mL范圍內(nèi)線性良好，R2=0.994 9，測(cè)得最低檢出限為7 ng/mL。在此基礎(chǔ)上，宋宏新等[7]以雞卵黃抗體為多克隆抗體包被酶標(biāo)板，封閉后，加入等量酶標(biāo)抗原和待測(cè)物進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，建立的競(jìng)爭(zhēng)ELISA最低檢出量為5.1 ?g/mL，變異系數(shù)小于5%。除此之外，也有學(xué)者采用間接ELISA來(lái)檢測(cè)。Atrick等[8]結(jié)合了十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、蛋白質(zhì)印跡、免疫染色方法和間接ELISA多種方法來(lái)檢測(cè)白葡萄酒中是否存在酪蛋白物質(zhì)，結(jié)果表明在不同的檢測(cè)樣品中，均可以檢測(cè)到酪蛋白的存在，其估計(jì)的檢測(cè)量在0.9 mg/L左右，甚至更低。同時(shí)，張濤等[9]通過(guò)制得的兔抗牛αs-酪蛋白的多克隆抗體為一抗，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗，以牛αs-酪蛋白包被抗原間接ELISA檢測(cè)方法，檢測(cè)的線性范圍是25～1 200 ng/mL，相關(guān)系數(shù)是0.982 5，回收率在91.97%～115.61%之間，從而可計(jì)算出牛乳中酪蛋白的含量。近年來(lái)，市場(chǎng)上已有多種商品化的過(guò)敏原檢測(cè)ELISA試劑盒銷售，如Tepnel、R-Biopharm、ELISA Systems等，這些試劑盒可在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)過(guò)敏原的定性和半定量檢測(cè)。李妮等[10]通過(guò)對(duì)多種品牌的酪蛋白殘留試劑盒進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，得出ELISA Systems試劑盒對(duì)檢測(cè)食品中的酪蛋白成分特異性高，并與其他幾種過(guò)敏食品均無(wú)交叉反應(yīng)，試劑盒體現(xiàn)出了較高的精密度（變異系數(shù)＜5%）和準(zhǔn)確度，定性檢測(cè)限小于1.56 mg/L，定量范圍為0.244～1.926 mg/L。

ELISA法靈敏性高、特異性強(qiáng)、快速、費(fèi)用低，因而在過(guò)敏原檢測(cè)中得到了廣泛的應(yīng)用，特別適用于食物中少量過(guò)敏原檢測(cè)，但這種方法也有其局限性，檢測(cè)的蛋白在食品加工處理過(guò)程中可能會(huì)發(fā)生變化，導(dǎo)致ELISA法假陰性的出現(xiàn)。故對(duì)于ELISA法，學(xué)者需要進(jìn)一步的考慮食品加工處理過(guò)程中過(guò)敏原性質(zhì)的變化，克服其對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生的不良影響。

2.1.2 免疫熒光法

免疫熒光技術(shù)是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后，結(jié)合物在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光，根據(jù)熒光的強(qiáng)弱，來(lái)進(jìn)行定量分析的方法。這種方法的特異性強(qiáng)、靈敏度高、速度快，主要缺點(diǎn)是非特異性染色問(wèn)題會(huì)導(dǎo)致結(jié)果判定的客觀性不足，且技術(shù)程序比較復(fù)雜。應(yīng)用熒光標(biāo)記的方法，Young等[11]從小鼠腺體內(nèi)提取酪蛋白進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)標(biāo)記免疫熒光素來(lái)檢測(cè)標(biāo)記的抗體來(lái)檢測(cè)酪蛋白，結(jié)果表明熒光標(biāo)記的方法特異性很強(qiáng)，對(duì)今后酪蛋白檢測(cè)方法的發(fā)展具有一定的參考價(jià)值。

2.1.3 火箭電泳免疫技術(shù)（roket immunoele-ctrophoresis，RIE）

以半固態(tài)透明的瓊脂凝膠為支持介質(zhì)，使置于孔中的抗原和抗體相向擴(kuò)散，兩者相遇后，在濃度比例適當(dāng)處結(jié)合成復(fù)合物形成沉淀峰，根據(jù)形成的峰行高度來(lái)判斷抗原量的多少。Moen等[12]將RIE和ELISA兩種方法進(jìn)行了比較，選取了市場(chǎng)上的13種樣品，分別用ELISA試劑盒和RIE進(jìn)行檢測(cè)，前者只能檢測(cè)到酪蛋白在3種產(chǎn)品中的含量，而后者卻檢測(cè)到了每種產(chǎn)品中的酪蛋白含量，對(duì)比說(shuō)明RIE的檢測(cè)靈敏度比ELISA高，能檢測(cè)到含量低的過(guò)敏原產(chǎn)品，從而提高了食品的準(zhǔn)確性和擴(kuò)大其應(yīng)用范圍。

在實(shí)際操作中，RIE制膠和染色過(guò)程操作過(guò)程復(fù)雜，穩(wěn)定性不好，故需要進(jìn)一步提高其準(zhǔn)確性。

2.1.4 時(shí)間分辨熒光免疫分析（time resolved fluoroisnmunoassay，TRFIA）

TRFIA是一種非同位素免疫分析技術(shù)，用鑭系元素標(biāo)記抗原或抗體，根據(jù)鑭系元素螯合物的發(fā)光特點(diǎn)，用時(shí)間分辨技術(shù)測(cè)量熒光，同時(shí)檢測(cè)波長(zhǎng)和時(shí)間兩個(gè)參數(shù)，進(jìn)行信號(hào)分辨，由于鑭系元素發(fā)射熒光效應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，可通過(guò)延遲檢測(cè)時(shí)間而將標(biāo)本或環(huán)境中的非特異熒光扣除，極大地提高了分析靈敏度。Sletten等[13]用TRFIA、Indirect TRFI、ELISA 3種不同的方法去檢測(cè)不同食品中的酪蛋白的含量，對(duì)比發(fā)現(xiàn)三者都能在1～1.5 mg/kg范圍內(nèi)做定量的檢測(cè)，其中，TRFIA和i-TRFIA（60～68 ng/mL）的檢測(cè)結(jié)果相近，敏感度和特異性比ELISA（30～38 ng/mL）低，為進(jìn)一步找到與ELISA互補(bǔ)的方法提供了借鑒。

應(yīng)用此方法具有檢測(cè)范圍寬、對(duì)標(biāo)記物分子生物活性影響小、無(wú)放射性污染、標(biāo)記物保存時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，尤其是能夠同時(shí)檢測(cè)不同的食品，節(jié)省時(shí)間。

2.1.5 生物免疫傳感器（immunosensor）

生物免疫傳感器是使用光敏元件作為信息轉(zhuǎn)換器，將生物識(shí)別分子固化在傳感器，通過(guò)與光學(xué)器件的光的相互作用，產(chǎn)生變化的光學(xué)信號(hào)，通過(guò)檢測(cè)變化的光學(xué)信號(hào)來(lái)檢測(cè)免疫反應(yīng)。這種方法具有快速靈敏、選擇性高、操作簡(jiǎn)單、便于自動(dòng)化等特點(diǎn)。目前應(yīng)用在過(guò)敏原檢測(cè)的免疫傳感器有光纖表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）、電化學(xué)免疫傳感器等。

SPR技術(shù)是指當(dāng)樣品與芯片表 面的生物分子識(shí)別膜相互作用時(shí)，會(huì)引起金膜表面折射率的變化，導(dǎo)致SPR角度的變化，通過(guò)檢測(cè)SPR角的變化，獲得被分析物的濃度、親和力、動(dòng)力學(xué)常數(shù)和特異性等信息。SPR傳感器是將SPR技術(shù)與免疫傳感器結(jié)合，通過(guò)獲取抗原抗體反應(yīng)過(guò)程中SPR角的動(dòng)態(tài)變化，得到生物分子之間相互作用的特異性信號(hào)，來(lái)檢測(cè)各種蛋白質(zhì)抗原的方法。Hiep等[14]將標(biāo)記了酪蛋白抗體的膠體金顆粒固化在表面等離子體共振傳感器上，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件，在最適條件下檢測(cè)到的酪蛋白最低質(zhì)量濃度為10 ng/mL。應(yīng)用新型傳感器檢測(cè)時(shí)，不需要對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)雜繁瑣的前處理，節(jié)省大量的時(shí)間，并且便于攜帶，敏感度高。應(yīng)用不同的設(shè)備，研究者研制了基于不同材料的傳感器。Cao等[15]通過(guò)電聚化改造電極，形成了具有聚精氨酸復(fù)合薄膜的新型電極，該電極能夠吸附納米金，使其固定在電極表面，將其置于抗酪蛋白溶液中，抗體就能固化在這種新型電極上。上述方法構(gòu)造的傳感器，在最適的條件下，其檢測(cè)限在1×10-7～1×10-5g/mL范圍內(nèi)，R2=0.993，最低檢測(cè)值為5×10-8g/mL，這種方法已經(jīng)成功的應(yīng)用到奶酪中的酪蛋白的檢測(cè)中。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)一些研究者也開始了這一方面的研究，研究人員正在開發(fā)新型的耦合材料石墨烯等，將會(huì)進(jìn)一步的改進(jìn)傳感器的性能，提高檢測(cè)準(zhǔn)確性。

2.1.6 免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)（lateral flow assay，LFA）

LFA作為一種以膠體金為標(biāo)記物，再利用抗原抗體的特異性反應(yīng)以達(dá)到檢測(cè)目的的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)，已得到了廣泛的應(yīng)用，如致病菌[16]、瘦肉精[17]、黃曲霉毒素[18]的檢測(cè)等。這種層析試紙條具有快速、方便、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，具有廣闊的應(yīng)用前景。在此原理基礎(chǔ)上，Tepnel、R-Biopharm、ELISA Systems等生物公司已經(jīng)推出相應(yīng)的產(chǎn)品，而在國(guó)內(nèi)，有關(guān)過(guò)敏原的研究起步較晚，相關(guān)的研究和產(chǎn)品還很少[19]，需要學(xué)者做進(jìn)一步的研究。

2.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)

PCR操作類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，由于DNA分子在加工過(guò)程中性質(zhì)穩(wěn)定，可對(duì)特定過(guò)敏原的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。目前PCR檢測(cè)已成為一種可靠、準(zhǔn)確的檢測(cè)過(guò)敏原的方法，廣泛地應(yīng)用到了花生[20]、芝麻[21]、堅(jiān)果類[22]等過(guò)敏原的檢測(cè)。PCR檢測(cè)方法可以克服蛋白含量低而被食品基質(zhì)掩蓋的缺點(diǎn)，同時(shí)DNA的特異性也較高，但易受食品基質(zhì)的影響，而檢測(cè)不出過(guò)敏原，且操作過(guò)程復(fù)雜，設(shè)備昂貴，容易產(chǎn)生 假陽(yáng)性的結(jié)果。Schulmeister等[23]已從牛乳腺中分離出編碼酪蛋白的基因，將其在合適的條件下進(jìn)行重組，將重組后的基因植入大腸桿菌體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，結(jié)果顯示表達(dá)的基因能夠引起過(guò)敏反應(yīng)，這為以后過(guò)敏原引物的設(shè)計(jì)和應(yīng)用PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)做好了鋪墊。目前，此方法應(yīng)用在牛乳過(guò)敏檢測(cè)上的文章還尚未見報(bào)道，但它將是檢測(cè)過(guò)敏物質(zhì)的一個(gè)具有前瞻性的發(fā)展方向。

2.3 毛細(xì)管電泳技術(shù)

毛細(xì)管電泳技術(shù)是以毛細(xì)管為分離通道，高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，根據(jù)樣品的多種特性（電荷、大小、等電點(diǎn)、極性、親和行為、相分配特性等）的不同，實(shí)現(xiàn)液相微分離分析技術(shù)。毛細(xì)管電泳的技術(shù)有很多，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)建立了基于毛細(xì)管區(qū)帶電泳、毛細(xì)管凝膠電泳、毛細(xì)管等速聚焦電泳方法的研究。張東送等[24]運(yùn)用毛細(xì)管電泳技術(shù)對(duì)牛乳中的蛋白組分進(jìn)行了快速分析，并根據(jù)不同牛乳的毛細(xì)管區(qū)帶電泳圖譜，利用32Karat Software軟件計(jì)算出牛乳中酪蛋白的含量，該方法具有快速、高效、用樣少、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)。但由于毛細(xì)管電泳設(shè)備昂貴，操作人員需要一定的訓(xùn)練，制約了此項(xiàng)技術(shù)普及。王麗娜等[25]用毛細(xì)管電泳技術(shù)來(lái)分離南方水牛奶酪蛋白，并對(duì)其成分進(jìn)行定量分析，實(shí)驗(yàn)測(cè)得α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白在0.5～5.0 g/L范圍內(nèi)，具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均不低于0.998 0，且加標(biāo)回收率為98%～106%。Mayer等[26]將等電點(diǎn)聚集電泳技術(shù)與HPLC方法聯(lián)合使用來(lái)檢測(cè)奶酪中酪蛋白的含量，以此來(lái)判斷是否適應(yīng)于生產(chǎn)奶酪，實(shí)驗(yàn)根據(jù)不同乳制品中酪蛋白含量的不同，對(duì)比不同的校正曲線來(lái)判斷乳制品中是否摻假了羊乳的酪蛋白。應(yīng)用這種方法可以測(cè)定到酪蛋白的含量，可適用于過(guò)敏物質(zhì)的檢測(cè)。

2.4 儀器分析

儀器分析是指采用比較復(fù)雜或特殊的儀器設(shè)備，通過(guò)測(cè)量物質(zhì)的某些物理或物理化學(xué)性質(zhì)的參數(shù)及其變化來(lái)獲取物質(zhì)的化學(xué)組成、成分含量及化學(xué)結(jié)構(gòu)等信息的一類方法，主要包括色譜法和質(zhì)譜法等。在實(shí)際應(yīng)用中，往往將兩者結(jié)合來(lái)為提高準(zhǔn)確性，具有靈敏度高，準(zhǔn)確性好，檢出限低，專一性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。但是其儀器設(shè)備較復(fù)雜，需要專門的培訓(xùn)人才，且價(jià)格昂貴，不便于普通操作。

2.4.1 色譜法

色譜法是一種分離分析法，利用混合物中各組分在不同的兩相中溶解、解析、吸附、脫附或其他親和作用性能的差異而互相分離的現(xiàn)象，對(duì)此現(xiàn)象進(jìn)行分析的方法。反相高效液相色譜（reversed phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）是將不同的有機(jī)官能團(tuán)通過(guò)化學(xué)反應(yīng)共價(jià)鍵結(jié)合到硅膠載體表面的游離基上，而生成不同極性的化學(xué)鍵合固定相，使其選擇性得到提高。基于分離的基礎(chǔ)上，Wang Juan等[27]通過(guò)特定的分析柱對(duì)樣品進(jìn)行分離，在波長(zhǎng)240 nm、45℃條件下，定量檢測(cè)到牛乳中的6種蛋白質(zhì)，包括酪蛋白、乳清蛋白等，檢測(cè)的峰值在74.8%～132.5%范圍內(nèi)波動(dòng)，應(yīng)用此種方法具有很好的準(zhǔn)確性，可操作性和重復(fù)性。王浩等[28]通過(guò)此種方法對(duì)牛奶及其乳制品進(jìn)行了定量分析，分離出7種主要蛋白成分（包括酪蛋白），各組分分離度均大于1，達(dá)到基線分離，回收率達(dá)88.9%～97.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.8%～5.1%，具有準(zhǔn)確、靈敏、快速等特點(diǎn)，可用于牛奶及其乳制品的質(zhì)量控制盒定量檢測(cè)。色譜檢測(cè)法的重現(xiàn)性好，具有良好的選擇性，并可用于梯度洗脫操作。

2.4.2 質(zhì)譜法

質(zhì)譜法是用電場(chǎng)和磁場(chǎng)將運(yùn)動(dòng)的離子按它們的質(zhì)荷比分離后進(jìn)行檢測(cè)的方法，測(cè)出的離子準(zhǔn)確質(zhì)量即可確定離子的化合物組成。質(zhì)譜法的檢測(cè)需要對(duì)樣品進(jìn)行前處理，提高其純度，所以，在實(shí)際應(yīng)用中，質(zhì)譜法多與色譜儀等聯(lián)用，來(lái)提高其準(zhǔn)確性。目前，在檢測(cè)生物蛋白大分子方面，基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（matrix-assisted laser desorption/ ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-MS）具有很大的應(yīng)用前景。MALDI-MS是指用一定強(qiáng)度的激光照射樣品和基質(zhì)，使得樣品分子電離，電離的樣品在電場(chǎng)作用下加速飛過(guò)飛行管道，依據(jù)樣品的質(zhì)荷比（m/z）的不同來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，并測(cè)得樣品分子的分子質(zhì)量。此方法具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高、分辨率高、圖譜簡(jiǎn)明、質(zhì)量范圍廣及速度快等特點(diǎn)，在操作上制樣簡(jiǎn)便、可微量化、大規(guī)模、并行化和高度自動(dòng)化處理待檢生物樣品，而且在測(cè)定生物大分子和合成高聚物應(yīng)用方面有特殊的優(yōu)越性。Mamone等[29]通過(guò)建立的方法鑒定酪蛋白成分，并分析得到酪蛋白多肽的多糖的排列順序。向明霞等[30]通過(guò)利用雙向電泳和MALDI-MS聯(lián)用技術(shù)對(duì)水牛乳酪蛋白與其他乳源蛋白的差異性進(jìn)行了研究。根據(jù)Image Master 2D Platinum圖像分析軟件對(duì)不同乳源酪蛋白的雙向電泳（2-DE）圖譜進(jìn)行蛋白斑點(diǎn)的匹配分析，獲得21個(gè)水牛乳中主要分布在低豐度蛋白區(qū)的差異蛋白點(diǎn)，經(jīng)質(zhì)譜分析，得到4個(gè)屬于水牛乳酪蛋白的主要組分，另外發(fā)現(xiàn)兩個(gè)與水牛乳中的蛋白有較高同源性的新組分。在實(shí)際應(yīng)用中，這兩種方法通常共同來(lái)檢測(cè)食品中的物質(zhì)。Heick等[31]從食品基質(zhì)中提取到的蛋白，在胰蛋白酶的水解下，經(jīng)過(guò)LC-MS儀器進(jìn)行分析，同時(shí)檢測(cè)包括牛乳在內(nèi)的7種過(guò)敏原，檢測(cè)的濃度范圍從10 ?g/g到1 000 ?g/g，被證實(shí)是一種可以的用于進(jìn)行定量檢測(cè)的方法。

3 結(jié) 語(yǔ)

近年來(lái)，隨著人們的生活水平日漸提高，以及牛乳制品的廣泛普及，其引起的過(guò)敏問(wèn)題得到了人們的廣泛關(guān)注。牛乳蛋白作為一種常用的食品添加劑，在食品加工中會(huì)有部分殘留，給過(guò)敏人群帶來(lái)潛在的致敏危害，故需要找到一種快速準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。

目前，在應(yīng)用免疫學(xué)方法檢測(cè)方面，抗體的質(zhì)量與反應(yīng)模式是影響檢測(cè)結(jié)果的關(guān)鍵因素。應(yīng)用此種方法時(shí)，需要獲得高質(zhì)量的抗體，選取合適的反應(yīng)模式和有效的提取過(guò)敏原方法。而作為具有高靈敏性和低檢測(cè)值的PCR技術(shù)，因其在食品中獲得相關(guān)的基因片段有一定的難度，再加上需要更加昂貴的設(shè)備和專業(yè)人才，在應(yīng)用方面受到一定的約束。同樣，毛細(xì)管電泳技術(shù)雖然具有高效，需要少量的樣品和緩沖液等特點(diǎn)，但在定量分析的精確性方面需要進(jìn)一步的改善。為彌補(bǔ)以上檢測(cè)值低，易受食品基質(zhì)影響的不足，學(xué)者采用了精密的儀器分析方法，能夠精確檢測(cè)過(guò)敏物質(zhì)的含量，在獲得純度足夠高的樣品時(shí)，會(huì)有更好的檢測(cè)效果。但由于設(shè)備昂貴和操作復(fù)雜，不適用于快速檢測(cè)中。新技術(shù)的開發(fā)應(yīng)用促使過(guò)敏原的檢測(cè)向高靈敏度、簡(jiǎn)便快速、準(zhǔn)確性高方向發(fā)展，為我國(guó)食物過(guò)敏原的快速檢測(cè)和食物過(guò)敏原標(biāo)簽標(biāo)示制度的實(shí)施提供重要的技術(shù)支撐，以便早日開發(fā)出具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的產(chǎn)品。

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Research Progress in Methods for Detecting Cow’s Milk Allergen Casein

NI Xiao-qin, LAI Wei-hua*
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Cow’s milk is rich in proteins, and an ideal nutritional substance, but it is also a common allergen in foods. Casein is the highest content of protein in milk, and is often used as a major index for detecting the allergenicity of cow’s milk. The currently available detection methods include mainly immunological techniques, polymerase chain reaction (PCR), capillary electrophoresis, chromatography, and mass spectrometry. This article reviews the principles, characteristics and applications of these detection methods, and proposes future trends in the development of new detection methods.

casein; allergen; detection methods

TS207.3

A

1002-6630（2014）03-0290-05

10.7506/spkx1002-6630-201403057

2012-12-07

倪小琴（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量安全。E-mail：xychun555@163.com

*通信作者：賴衛(wèi)華（1968—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩-mail：talktolaiwh@163.com