王笑顏，鄒偉華，邵圣文，錢福初，王　翔

(湖州市中心醫(yī)院檢驗科，湖州師范學院微生物與免疫學研究室，浙江湖州 313000)

丙型肝炎由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染引起。HCV可直接損傷肝細胞，同時還伴有免疫系統(tǒng)損傷和肝外病變，成人感染HCV后有60%～80%會發(fā)展為慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C，CHC)。HCV為單股正鏈RNA病毒，其基因序列呈現(xiàn)多態(tài)性和高度變異性。近年來，Simmonds等[1]根據(jù)HCV基因組序列分型法，將HCV分為6種基因型和31種亞型。初步證據(jù)表明，HCV感染與自身免疫關(guān)系密切。本文就HCV不同基因型感染與自身抗體變化的關(guān)系進行研究，有助于探討HCV發(fā)病機制和其感染對機體免疫功能的影響，為臨床治療提供依據(jù)。

資料和方法

對象及樣本分組

湖州市中心醫(yī)院2008年1月至2010年1月傳染科門診和住院患者中HCV RNA陽性患者，診斷標準符合全國病毒性肝炎防治方案[2]，所有患者排除甲、乙、丁、戊型肝炎病毒感染?？共《局委熐俺槿§o脈血3 ml，3 000 r/min離心10 min，分離血清置-70℃凍存?zhèn)溆?。對照組為本院健康體檢者，均HCV RNA<8×104/L。

血清樣本按照HCV RNA病毒載量分為3組，HCV RNA≥108/L為高病毒載量組，108～105/L為中載量組，105～8×104/L為低載量組。

試劑與方法

HCV RNA檢測：定量檢測采用實時熒光定量法，由廣東達安基因股份有限公司生產(chǎn)的HCV熒光定量PCR試劑盒檢測。HCV基因擴增采用Trizol法提取病毒RNA參考文獻[3]，以RT-nest PCR擴增HCV RNA 5′-NCR區(qū)，引物委托美國Invitrogen上海公司合成。在EPPENDORF mastecycler PCR儀上進行擴增，取10 μl RNA為反轉(zhuǎn)錄模板，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到互補cDNA，-70℃保存。第一輪PCR擴增：以5 μl互補cDNA為模板，以外引物進行擴增，參數(shù)為94℃變性10 min，94℃ 1 min，54℃ 1 min 50 s 72℃ 1 min，共25個循環(huán)，72℃ 10 min延伸。第二輪PCR擴增：取第一輪PCR產(chǎn)物2 μl為模板，以內(nèi)引物擴增，參數(shù)為94℃變性10 min，94℃ 1 min 55℃ 1 min，72℃ 1 min，共35個循環(huán)72℃ 10 min延伸。取第二輪PCR產(chǎn)物5 μl，2.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外燈下觀察鑒定。HCV序列測定及基因分型PCR產(chǎn)物測序由迪安醫(yī)學檢驗中心以ABI3130全自動測序儀完成。將測序結(jié)果輸入美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的基因分型軟件，經(jīng)比對后獲得基因分型結(jié)果(分型軟件網(wǎng)址參見www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi)。

自身抗體檢測：采用間接免疫熒光法檢測抗核抗體(anti-nuclear antibody，ANA)、抗平滑肌抗體(anti-smooth muscle antibodies，ASMA)。采用斑點免疫印跡法檢測抗線粒體抗體M2、Sm、RO52、SSA、SSB及抗著絲點抗體(centromere antibody，CENPB)。以上檢測試劑均由德國歐蒙公司提供。待測血清1∶100為起始稀釋度，檢測陽性血清分別進行1∶320、1∶1000、1∶3200稀釋度以確定最終滴度。類風濕因子(rheumatoid factor，RF)采用散射比濁法，在Beckman-Immage儀器上檢測，試劑由美國貝克曼公司提供。

統(tǒng)計學處理

采用SSPS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料采用t檢驗，率的比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)　　果

基本資料

HCV RNA陽性者94例，男55例，女39例；年齡15～79歲；CHC 89例，丙型肝炎后肝硬化5例，所有患者抗HCV-抗體均為陽性。對照組70例，男32例，女38例；年齡23～66歲。

HCV基因型分布

94例HCV RNA陽性者中，1a型5例(5.3%)，1b型77例(81.9%)，2a型9例(9.6%)，3a型1例(1.1%)，6a型2例(2.1%)。

自身抗體檢出率

94例HCV RNA陽性者共檢出37例(37/94，39.4%)自身抗體陽性；其中1b型檢出36例自身抗體陽性者，檢出率為46.8%(36/77)；2a型檢出1例自身抗體陽性，檢出率為11.1%(1/9)，兩者檢出率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其他基因型未檢出自身抗體陽性。

36例自身抗體陽性1b型者ANA陽性36例次，RF陽性21例次，SSA陽性8例次，RO52陽性8例次，SSB陽性7例次，M2陽性5例次，CENPB陽性4例次，ASMA陽性3例次。1例自身抗體陽性2a型者，表現(xiàn)為ANA、RF及M2陽性。

HCV基因型與ANA的關(guān)系

94例HCV RNA陽性者中，ANA陽性者37例。滴度1∶100者占59.5%(22/37)，滴度1∶320者21.6%(8/37)，滴度1∶1000者占18.9%(7/37)。ANA熒光圖型檢測結(jié)果以顆粒型為主，占62.2%(23/37)，其次是絲點型(16.2%，6/37)，其他為核仁型和均質(zhì)型。

HCV病毒載量與ANA檢出率的關(guān)系

94例HCV RNA陽性者中，高、中、低載量組分別為20、38、36例。3個載量組分別與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(χ2分別為6.4、19.9、53.1，均P<0.05)。高載量組和低、中載量組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(χ2分別為19.5、9.8，均P<0.05)(表1)。

討　　論

多種病毒感染可誘發(fā)自身免疫反應(yīng)。1989年Esterban等[4]在自身免疫性肝炎患者血清中檢出ANA，隨后HCV感染與自身免疫的關(guān)系引起廣泛關(guān)注[5]。HCV感染可通過分子模擬現(xiàn)象激活自身免疫反應(yīng)性CD8+細胞，從而導致自身免疫[6]。

HCV基因組呈現(xiàn)高度變異性，這是HCV感染容易導致慢性化的主要原因。目前Simmonds等將HCV分為6個基因型，鄒偉華等[7]采用RT-nest PCR后直接測序法分析不同丙型肝炎患者血清HCV基因型。本研究結(jié)果顯示，湖州地區(qū)流行的HCV基因型主要為1b型，其次為2a型，與國內(nèi)主要流行趨勢相一致。本研究檢測了湖州地區(qū)不同HCV基因型患者體內(nèi)自身抗體情況，結(jié)果表明1b型患者檢出率為46.8%，與國內(nèi)已有報道[8]相近。2a型檢出率為11.1%，其他基因型均未檢出自身抗體。這與國外報道不一致，Zein等[9]報道1a型HCV感染與自身免疫的相關(guān)性較為明顯，1b型HCV感染次之。這可能是由于研究對象種族不同造成的。葛明才等[10]研究表明，1b型HCV感染確與自身免疫明顯相關(guān)，提示HCV感染可能可誘導自身免疫反應(yīng)，另外，研究還提示這種免疫反應(yīng)與疾病嚴重程度及病程長短有關(guān)。

表1　丙型肝炎病毒RNA含量與抗核抗體檢出率

本文觀察到，94例不同基因型丙型肝炎患者中，1b型可檢出ANA、RF、ASMA、M2、SSA、RO52、SSB、CENPB這8種自身抗體，2a型檢出ANA、RF和M2這3種自身抗體。有研究認為，自身免疫疾病的啟動因子是病毒感染，靶細胞中的抗原成分改變或者由于病毒蛋白正常組織成分間有同源性而誘發(fā)自身免疫，并認為HCV感染可通過分子模擬現(xiàn)象激活自身反應(yīng)性CD8+T細胞，從而誘導自身免疫[11]。本文還觀察到，1b型和2a型HCV-RNA自身抗體以低滴度為主。然而，一般認為自身抗體在高滴度時才與自身免疫病密切相關(guān)。當前，HCV治療主要應(yīng)用α-干擾素，該藥可誘導或增強自身免疫，存在高滴度自身抗體者應(yīng)用時可能會使病情惡化。另外，自身免疫性疾病可應(yīng)用糖皮質(zhì)激素類藥物治療，但該類藥物可促進病毒復制。張路等[12]認為，慢性HCV感染相關(guān)的自身免疫性疾病在臨床表現(xiàn)及實驗室檢查特征上與未合并慢性HCV感染者相比無差異，使用糖皮質(zhì)激素聯(lián)合免疫抑制劑治療仍安全有效。有學者認為，給予ANA滴度<1∶320者應(yīng)用α-干擾素治療后不會出現(xiàn)病情惡化[13]。因此，對低滴度自身抗體的HCV患者，不應(yīng)推遲干擾素的治療；而對于治療過程出現(xiàn)高滴度自身抗體的HCV患者，進行自身抗體檢測和滴度監(jiān)測有助于了解患者自身免疫狀態(tài)并指導治療，對患者治療及愈后有重要臨床意義。

另外，也有研究表明，高滴度(≥1∶320)自身抗體常提示自身免疫性肝炎的存在[14]。本文檢測出的A-SMA和M2也是自身免疫性肝病的特征抗體，提示HCV患者可能合并自身免疫性肝炎。

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著HCV病毒載量增加，ANA陽性率也隨之增加，說明ANA陽性率與HCV病毒復制有關(guān)。Yuki等[15]檢測了71例HCV攜帶者，發(fā)現(xiàn)ANA在高病毒血癥(108～109copies/ml)中為陽性，提出自身抗體的出現(xiàn)可能與病毒的高水平復制有關(guān)。因此，當HCV患者自身抗體陽性，可能提示肝臟和免疫系統(tǒng)同時受累，此時病毒可能處于高復制狀態(tài)，應(yīng)選擇合理治療方案，做到既能控制病毒復制，也不累及免疫系統(tǒng)?？傊?，丙型肝炎患者自身抗體與HCV基因型有關(guān)，對其開展自身抗體檢測有利于HCV治療。

[1]Simmonds P，McOmish F，Yap PL，et al.Sequence variabilityin the 5′non-coding region of hepatitis C virus：identification of a new virus type and restrictions on sequence diversity[J].J Gen Virol，1993，74：661-668.

[2]中華醫(yī)學會傳染病與寄生蟲病分會，肝病學分會.病毒性肝炎防治方案[J].中華肝臟病雜志，2000，8：324-329.

[3]胡斌，張孝文，程鋼，等. 廣東地區(qū)丙型肝炎患者的 HCV 基因分型研究[J].熱帶醫(yī)學雜志，2006，6：1071-1072.

[4]Esteban JI， Esteban R， Viladomiu L， et al. Hepatitis C virus antibodies among risk groups in Spain[J].Lancet，1989，2：294-297.

[5]Squadrito G， Previti M， Lenzi M，et al. High prevalence of non-organspecific autoantibodies in hepatitis C virus-infected cirrhotic patients from southern Italy[J].Dig Dis Sci，2003，48：349-353.

[6]彭道榮，余妍，王宇，等.丙型肝炎病毒感染患者血清肝特異性自身抗體的檢測及臨床研究[J].實用預防醫(yī)學，2007，14：1699-1671.

[7]鄒偉華，錢福初，秦基取，等.浙江省湖州地區(qū)丙型病毒肝炎病毒基因型分布[J].疾病監(jiān)測，2012，27：25-27.

[8]李穎，徐鑫，劉佩，等.慢性丙型肝炎患者自身抗體檢測的臨床意義[J].肝臟，2007，1：17-19.

[9]Zein NZ， Persing DH， Czaja AJ. Viral genotypes as determinants of autoimmune expression in chronic hepatitis C[J].Mayo Clin Proc， 1999，174：454-460.

[10] 葛明才，陳洪才，楊希菊，等.不同基因型丙型肝炎患者自身免疫抗體的研究[J].中國誤診學雜志，2006，6：3072-3074.

[11] 張悅，宋玉琨，王惠，等.慢性丙型肝炎患者自身抗體檢測的臨床分析[J].西南國防醫(yī)藥，2004，14：166.

[12] 張路，冷曉梅，劉正印，等.丙型肝炎病毒慢性感染相關(guān)的系統(tǒng)性自身免疫病分析[J].中華臨床免疫和變態(tài)反應(yīng)雜志，2012，6：24-29.

[13] 胡國齡.HCV感染者肝外相關(guān)的疾病及干擾素治療[J].中華傳染病雜志，1999，17：5-6.

[14] 王宵偉，王江濱，孟祥偉.自身免疫性肝炎與丙型肝炎伴自身免疫現(xiàn)象者抗體水平的比較與臨床分析[J].中華肝臟病雜志，2004，12：176-177

[15] Yuki N， NorioH， Hicdeki H， et al. IgG and IgM core antibodies and viral replication in hepatitis C virus carries[J].J Hepat，1994，21：110-114.