陳作紅，胡勁松,2

鵝膏肽類毒素檢測方法的歷史與現(xiàn)狀

陳作紅1，胡勁松1,2

（1.湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖南 長沙 410081；2.南華大學(xué)生物學(xué)研究所，湖南 衡陽 421001）

每年因誤食毒蘑菇導(dǎo)致中毒死亡事件在世界各國都有發(fā)生，也是我國食物中毒事件中導(dǎo)致死亡的重要因素之一。鵝膏菌屬中某些種 類含有的肽類毒素是主要的致死原因，快速而有效地檢測樣品（包括有毒蘑菇子實(shí)體、食物剩余物、嘔吐物、中毒患者血液和尿液等）中的毒素對于食物中毒的毒源鑒定和中毒后的針對性治療具有重要意義。本文從化學(xué)顯色反應(yīng)、生物化學(xué)法、物理法、色譜法等4 個(gè)方面對鵝膏肽類毒素檢測方法的歷史和研究進(jìn)展進(jìn)行整理和總結(jié)，并對其在我國的應(yīng)用加以討論和展望。

鵝膏菌；鵝膏毒肽；鬼筆毒肽；檢測方法

每年因誤食毒蘑菇而引起的中毒死亡事件在世界各國都有發(fā)生。在我國，蘑菇中毒事件更是頻頻發(fā)生，2004—2009年全國共報(bào)告毒蘑菇中毒事件311 起，中毒1954 人，死亡409 人，病死率為20.93%，毒蘑菇中毒是我國食物中毒事件中導(dǎo)致死亡的主要原因之一[1-2]。在歐洲和北美，90%以上的蘑菇中毒死亡是由含鵝膏肽類毒素的蘑菇引起[3]，主要的劇毒種類包括有：綠蓋鵝膏（Amanita phalloides Secr.）、春生鵝膏（A. verna（Bull.）Lam.）、鱗柄鵝膏（A. virosa Secr.）、雙孢鵝膏（A. bisporigera G. F. Atk.）和赭鵝膏（A. ocreata Peck）等[4]。1993—2012年期間，我國 南方地區(qū)共報(bào)告102起蘑菇中毒事件，其 中64.69%中毒起數(shù)、78.05%中毒人數(shù)和70.49%死亡數(shù)是由含鵝膏 肽類毒素的蘑菇種類 引起，主要的劇毒種類包括有：灰花紋鵝膏菌（A. fuliginea Hongo）、致命鵝膏菌（A. exitialis Zhu L. Yang & T. H. Li）、黃蓋鵝膏白色變種（A. subjunquillea var. alba Zhu L. Yang）[5]。含有鵝膏肽類毒素的有毒蘑菇除鵝膏菌屬的一些種類外，還包括有盔孢傘屬（Galerina）和環(huán)柄菇屬（Lepiota）中的一些種類[3-4]。人們對于鵝膏肽類毒素的研究已有100多年的歷史，根據(jù)其氨基酸的組成和結(jié)構(gòu)可把鵝膏肽類毒素分為鵝膏毒肽、鬼筆毒肽和毒傘素3 類。目前已分離鑒定的天然毒素有22 種[6]，它們都是環(huán)肽化合物。其中鵝膏毒肽是一類雙環(huán)八肽，已發(fā)現(xiàn)的有9 種；鬼筆毒肽類為雙環(huán)七肽，已發(fā)現(xiàn)的有7 種；毒傘素是一類單環(huán)七肽，已發(fā)現(xiàn)的有6 種。鵝膏肽類毒素化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，耐高溫、耐干燥和酸堿，一般的烹調(diào)加工不會破壞其毒性，該類毒素易溶于甲醇、乙醇、液態(tài)氨、吡啶和水。

含有鵝膏肽類毒素的蘑菇引起的中毒屬于急性肝損害型，中毒癥狀明顯表現(xiàn)出潛伏期、腸胃炎期、假愈期和肝臟損害期4 個(gè)階段，最后導(dǎo)致肝、腎、心、腦、肺等器官功能衰竭，中毒患者一般在5～8 d內(nèi)死亡[3,5]。由于鬼筆毒肽不被腸道所吸收，因此在鵝膏菌中毒事件中起主要作用的是鵝膏毒肽，其中的α-鵝膏毒肽和β-鵝膏毒肽含量最高并且也是主要的致死毒素。鵝膏毒肽能抑制真核生物的RNA聚合酶Ⅱ的活性，即與RNA聚合酶Ⅱ的RBP1亞基結(jié)合形成一個(gè)復(fù)合體，使RBP1亞基降解，導(dǎo)致mRNA轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成受阻，最終導(dǎo)致細(xì)胞壞死[7-8]。Wang Dong[9]、Kaolan[10]、Brueckner[11]等利用晶體結(jié)構(gòu)分析方法，進(jìn)一步闡述了RNA聚合酶Ⅱ與α-鵝膏毒肽之間的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，表明α-鵝膏毒肽與RNA聚合酶ⅡRBP1亞基啟動環(huán)上的氨基酸殘基His1085能發(fā)生直接作用，此外α-鵝膏毒肽與啟動環(huán)、橋螺旋之間存在其他的間接作用，這種相互作用限制了啟動環(huán)和橋螺旋的運(yùn)動，從而削弱了核苷酸的結(jié)合和易位，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄的抑制。

由于鵝膏肽類毒素在蘑菇中毒死亡事件中起著重要的作用，因此快速而有效地檢測樣品（包括有毒蘑菇子實(shí)體、食物剩余物、嘔吐物、中毒患者血液和尿液或者胃抽取物等）中的毒素對于食物中毒的毒源鑒定、蘑菇中毒預(yù)防和中毒后的針對性治療具有重要意義。本文對鵝膏肽類毒素檢測方法的歷史和研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)和梳理，對其在我國的應(yīng)用加以討論，并進(jìn)一步對其未來發(fā)展做出展望。

1 早期化學(xué)檢測技術(shù)（顯色反應(yīng)）

早在1909年人們就開始試圖分離研究鵝膏毒素，但直到1941年才在德國Wieland教授的實(shí)驗(yàn)室真正獲得2種鵝膏毒素，一種是快作用毒素，被命名為鬼筆毒肽；一種是慢作用毒素，被命名為鵝膏毒肽[12]。二次大戰(zhàn)之后，隨著新的分析方法如紙層析、紙電泳、薄層層析和柱層析等的發(fā)展，一種可靈敏區(qū)分鵝膏毒肽和鬼筆毒肽的化學(xué)顯色方法隨之建立，即肉桂醛在鹽酸環(huán)境下與鵝膏毒肽反應(yīng)顯深紫色，而鬼筆毒肽呈淺藍(lán)色[13]。利用這些分析工具，在隨后的20世紀(jì)50—70年代里，Wieland[6]實(shí)驗(yàn)室陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了鵝膏菌中的22 種天然肽類毒素，之后再也沒有從鵝膏菌中發(fā)現(xiàn)新的肽類毒素。

上述的肉桂醛顯色反應(yīng)在鵝膏肽類毒素的分離與發(fā)現(xiàn)中發(fā)揮了重要作用，1955年Bl ock等[14]即利用該顯色反應(yīng)原理發(fā)明了一種快速而簡單的紙層析檢測蘑菇中毒素的方法，該方法可檢測0.1 g鮮菇組織中的毒素。除上述顯色反應(yīng)外，還有一些其他顯色反應(yīng)應(yīng)用于鵝膏肽類毒素的鑒定[6]，例如：巴豆酸與鵝膏毒肽反應(yīng)呈酒紅色，而與鬼筆毒肽反應(yīng)呈淡黃色；茴香醛和磷酸在100 ℃時(shí)遇鵝膏毒肽產(chǎn)生藍(lán)紫色，遇鬼筆毒肽產(chǎn)生淺藍(lán)紅色；1,2-二羥基環(huán)丁烯二酮在HCl存在 時(shí)，會使鵝膏毒肽產(chǎn)生藍(lán)綠色反應(yīng)；鵝膏毒肽與Ehrich試劑（二甲氨基苯甲醛）在濃硫酸作用下呈紅色，與Hopkins-Cole試劑（乙醛酸和濃硫酸）反應(yīng)顯亮藍(lán)色。但是除肉桂醛顯色反應(yīng)外，以上這些顯色反應(yīng)很少被后人采用。

Wieland[6]1949年還報(bào)道了一個(gè)簡便的檢測鵝膏毒肽的顯色反應(yīng)方法。該方法通過將一片鮮菇的汁液壓在一張報(bào)紙上，待印跡干后，在印跡處滴上一滴濃HCl溶液，如鮮菇含有 鵝膏毒肽，5～10 min后便產(chǎn)生藍(lán)綠色反應(yīng)。這一顯色反應(yīng)不僅可檢測鮮菇而且也可檢測干菇中的鵝膏毒肽，其檢測限可達(dá)50～100 ng。由于該方法操作簡便易行，因此特別適宜于野外采集時(shí)對毒菇的初步鑒別。

2 生物化學(xué)檢測技術(shù)

2.1 放射免疫檢測法

鵝膏毒肽的放射免疫（rad ioimmunoassay，RIA）檢測方法最早由Fiume[15]和Faustich[16]等于1975年建立。Fiume等[15]首先從大鼠中獲得了抗體，F(xiàn)aulstich等[16]于用同樣的結(jié)合體，但經(jīng)過戊二醛交聯(lián)改造，從兔中也獲得了抗體，毒素采用木炭吸附或者利用硫酸銨沉淀獲得，用3H作放射性標(biāo)記，2 種方法的檢出限可達(dá)到0.5 ng/mL。Faulstich等[17]通過將α-鵝膏毒肽與胎球蛋白的結(jié)合體用作（制備）兔的抗體，該抗原具有更低毒性和更高的免疫原性，此外，利用α-鵝膏毒肽衍生物獲得的抗體不會與其他鵝膏 毒肽產(chǎn)生交叉反應(yīng)，獲得的免疫球蛋白IgG組分以共價(jià)鍵結(jié)合在尼龍纖維網(wǎng)上，該網(wǎng)再結(jié)合上帶有放射性活性的鵝膏 毒肽一起制成小片，即可用于檢測， 檢出限達(dá)3 ng/mL。該方法已用于鵝膏中毒病人的血漿、尿液、十二指腸和胃液中鵝膏毒肽的檢測。

Andres等[18]1986年報(bào)道了一種新的檢測尿和血漿中鵝膏毒肽的放射免疫檢測方法。該方法采用無毒的α-鵝膏毒 肽衍生物作抗原，用125I 作放射性標(biāo)記，整個(gè)檢測時(shí) 間只需100 min。其檢出限為：尿液1 mg/L、血漿0.1 mg/L。這種125I標(biāo)記方法在速度、簡便性和抗干擾方面相對3H的RIA均有顯著的改進(jìn)。

RIA雖然靈敏度高、特異性強(qiáng)，但由于涉及放射性核素，在很大程度上已經(jīng)被酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）所取代。

2.2 鵝膏毒肽的ELISA

ELISA具有方便快速、靈敏度高、特異性好等優(yōu)點(diǎn)，在生命科學(xué)各領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。瑞士Bühlmann Laboratories公司于2000年開發(fā)生產(chǎn)出鵝膏毒肽ELISA試劑盒，Staak等[19]最先用該方法檢測了100份尿液中的鵝膏毒肽。Abuknesha等[20]報(bào)道了用ELISA檢測中毒患者體液中的β-鵝膏毒肽的方法，其檢出限約為8 0 pg/mL。近年來該試劑盒廣泛用于鵝膏毒肽中毒的臨床檢驗(yàn)[21-22]。

2.3 鵝膏毒肽的RNA聚合酶Ⅱ抑制檢測法

鵝膏毒肽在很低的質(zhì)量濃度時(shí)（5 ng/mL）能專一性地抑制RNA聚合酶Ⅱ的作用，從而影響轉(zhuǎn)錄中尿苷三磷酸摻入RNA的能力。Preston等[23]依據(jù)這一理論建立了定量檢測鵝膏毒肽的方法，即在變性DNA和RNA聚合酶Ⅱ存在條件下，測定10 min內(nèi)3H標(biāo)記的尿苷三磷酸并入合成RNA的能力，100～2 000的液閃計(jì)數(shù)對應(yīng)于20～2 ng/mL的鵝膏毒肽。在20世紀(jì)70—80年代該方法被應(yīng)用于檢測幾種鵝膏菌的毒素含量。

張志光等[24]依據(jù)鵝膏毒肽能專一性地抑制RNA聚合酶Ⅱ的作用，從而影響RNA的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的合成、抑制種子萌發(fā)的原理，建立了一種“抑芽法”檢測鵝膏毒肽的方法：水提法提取粗毒液（質(zhì)量濃度為0.025～0.05 g/mL），綠豆種子在28 ℃培養(yǎng)24～72 h時(shí)，其下胚軸生長被抑制率在95%以上時(shí)，可能是劇毒鵝膏菌；當(dāng)被抑制率在60%～80%，可能為微毒鵝膏菌；當(dāng)被抑制率在30%以下時(shí)可能是無毒鵝膏菌。該方法簡便、實(shí)用、準(zhǔn)確。

2.4 鬼筆毒肽的絲狀肌動蛋白結(jié)合測定法

Schafer等[25]依據(jù)鬼筆毒肽能專一性地與絲狀肌蛋白（F-actin）結(jié)合的原理，建立了鬼筆毒肽的肌動蛋白結(jié)合測定法。

將放射性標(biāo)記的鬼筆毒肽與兔肌F-actin混合于待檢測鬼筆毒肽的溶液中，待反應(yīng)平衡后，用活性炭吸附并離心去除沒有結(jié)合的鬼筆毒肽。如果含有F-actin上清液中放射性比較弱，說明待測樣品中鬼筆毒肽與F-actin競爭結(jié)合的能力比較強(qiáng)，其濃度比較高。該方法的檢出限為160 ng/mL。

利用鬼筆毒肽可以調(diào)節(jié)保護(hù)牛胰腺脫氧核糖核酸酶Ⅰ（DNaseⅠ）不受F-actin的抑制這一特性，Mullersman等[26]發(fā)展了一個(gè)更為靈敏的檢測鬼筆毒肽的方法。DNaseⅠ在G-actin與F-actin共同存在條件下，鬼筆毒肽會專一性的與F-actin結(jié)合，使F-actin競爭性抑制DNaseⅠ作用減輕，DNase活性增強(qiáng)，檢測DNaseⅠ的活性即可對鬼筆毒肽進(jìn)行定量分析。這一方法的檢測靈敏度達(dá)到6.3 ng/mL。然而以上2 種方法很少得到實(shí)際應(yīng)用。

3 物理檢測技術(shù)

3.1 紫外吸收光譜檢測技術(shù)

早在20世紀(jì)50年代就發(fā)現(xiàn)鵝膏毒肽的紫外吸收最大峰位于300 nm波長處，鬼筆毒肽的最大吸收峰在290 nm波長處，該特性廣泛用于薄層層析、液相色譜和高效液相色譜法檢測毒素中。

3.2 熒光檢測技術(shù)

Vlaskin[27]、Gulikova[28]等分別報(bào)道了一種利用熒光光譜快速檢測鵝膏毒肽的方法，發(fā)現(xiàn)將鵝膏毒肽加入到溴化乙啶中，會有新的熒光波段產(chǎn)生。溴化乙啶最大吸收峰波長為610 nm，加入α-、β-鵝膏毒肽后，會分別在560 nm和525 nm波長處出現(xiàn)新的波峰，穩(wěn)定性可保持15～30 min，其檢 出限達(dá)1 ?mol/L。

4 色譜檢測技術(shù)

4.1 早期的紙層析、薄層層析、柱層析法

早期的紙層析、薄層層析和柱層析法多用于鵝膏肽類毒素的分離純化，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的22 種鵝膏肽類毒素都是20世紀(jì)50—70年代采用這些方法分離獲得。Wie lan d等[29]首次采用紙層析技術(shù)分離檢測毒素，用正丁醇∶丙酮∶水（20∶2∶5，V/V）作層析系統(tǒng)，后來于1960年被改進(jìn)為正丁醇∶丙酮∶水（30∶3∶5）作為適宜的層析系統(tǒng)[30]。Block等[14]發(fā)明了 一種快速而簡單的利用紙層析法檢測蘑菇中毒素 的方法，可檢測0.1 g鮮菇組 織中的毒素，其所使用的層析溶液為甲基乙基酮∶丙酮∶水∶丁醇（20∶6∶5∶1）。以上層析結(jié)果都采用顯色反應(yīng)來檢測。

在20世紀(jì)60年代中期，Sullivan等[31]首次用硅 膠薄層層析分離檢測α-、β-、γ-鵝膏毒肽，流動相系統(tǒng)為甲醇∶甲基乙基酮（1∶1）。之后有大量的溶劑系統(tǒng)被使用，Wieland[6]以硅膠作固定相，用A液（正丁醇∶乙酸乙酯∶水（14∶12∶4））、B液（氯仿∶甲醇∶水（65∶25∶4））作流動相，建立了一個(gè)有效的雙向薄層層析系統(tǒng)，并采用該方法檢測了歐洲的綠蓋鵝膏中的鵝膏毒肽含量[32]。

Stijve等[33]發(fā)明了快速、靈敏的高效薄層層析檢測綠蓋鵝膏粗提取液中鵝膏毒素的方法。這個(gè)方法是在薄層層析的基礎(chǔ)上，應(yīng)用紫外吸收光譜與標(biāo)樣進(jìn)行比較進(jìn)行測定的，檢出限達(dá)到50 ng。

相對于紙層析及薄層層析，柱層析法，尤其是以葡聚糖凝膠Sephadex G25、Sephadex LH20為固定相的柱層析系統(tǒng)，在分離純化和發(fā)現(xiàn)含量低的鵝膏毒素方面起到了重要作用，例如從鱗柄鵝膏（A. virosa）分離出的毒傘素都是通過Sephadex LH20分離獲得而發(fā)現(xiàn)[34]。

Yocum等[35]利用Sephadex LH20柱系統(tǒng)結(jié)合紫外光譜和薄層層析分析方法對美國東北部的幾種劇毒鵝膏菌中的鵝膏毒肽和鬼筆毒肽進(jìn)行了定量分析，認(rèn)為該方法的檢出限達(dá)到0.03 mg/g干子實(shí)體。

4.2 高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法

Beutler等[36]首次利用HPLC檢測鵝膏菌的肽類毒素，但其采用的是硅膠柱。Pastorello等[37]采用Spherisorb ODS柱進(jìn)行反相HPLC，檢測了中毒患者血清中α-鵝膏毒肽的含量，檢出限達(dá)50 ng/mL。在20世紀(jì)80年代主要利用HPLC檢測中毒病人的體液以及子實(shí)體中鵝膏毒肽的含量，直至1992年Enjalbert等[38]用反相HPLC建立了一種可以同時(shí)檢測綠蓋鵝膏子實(shí)體中8 種鵝膏 毒肽和鬼筆毒肽的方法，提取液中每種毒素的檢出限達(dá)10 ng/mL。此后，HPLC法廣泛應(yīng)用于不同采集地點(diǎn)的各種劇毒鵝膏菌子實(shí)體不同部位、不同發(fā)育時(shí)期以及中毒患者體液中肽類毒素 的檢測[39-42]，其檢出限可達(dá)2 ng/mL[43]。同時(shí)也用于鵝膏肽類毒素的分離純化和制備[44-45]。HPLC法具有速度快、靈敏度高、分辨率好、用量少等優(yōu)點(diǎn)，但是它主要依據(jù)被檢測成分紫外吸收峰與毒素標(biāo)樣的保留時(shí)間來確定毒素的種類，如果樣品的吸收峰比較多，就有可能存在不確定性。

4.3 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）法

隨著LC-MS聯(lián)用，尤其是串聯(lián)質(zhì)譜（tandem mass spectrometry，MS-MS）新技術(shù)的出現(xiàn)和不斷改進(jìn)，LCMS-MS已成為現(xiàn)代分析化學(xué)中的重要方法，這些檢測技術(shù)需要的樣品量更少、具有更高的靈敏度。Maurer等[46]首先報(bào)道了應(yīng)用LC- MS檢測經(jīng)免疫親和提取的尿液中α-和β-鵝膏毒肽的方法，其檢出限達(dá)2.5ng/mL。Filigenzi等[47]采用液相色譜-多級線性離子阱質(zhì)譜聯(lián)用法，以MSMS-MS模式測定了中毒病人血清和肝臟中α-鵝膏毒肽，其檢出限分別為0.25 ng/g和0.5 ng/g。Ahmed等[48]采用液相色譜與電噴霧離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測了有毒蘑菇中的α-、β-鵝膏毒肽和二羥鬼筆毒肽，其檢出限分別為30、30 ng/g和10 ng/g。Gonmori等[49]利用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)檢測了尿液中的以上3 種毒素，其檢出限達(dá)5 ng/g。

Nomura[50]和Leite[51]等分別報(bào)道了利用超高壓液相色譜與MS-MS檢測體液和肝組織中的α-和β-鵝膏毒肽，其在尿液中的檢出限分別為0.22 ng/g和0.20 ng/g，在肝組織中的檢出限分別為10.9 ng/g和9.7 ng/g。柳潔[52]、張秀堯[53]等也分別采用超高壓液相色譜與MS-MS檢測了有毒蘑菇子實(shí)體、血漿和尿液中的鵝膏肽類毒素。

Helfer等[54]建立了一種新型的基于渦流色譜（turbulent flow chromatography，TFC）的在線萃取技術(shù)，并結(jié)合LC-MS-MS技術(shù)直接檢測了人體尿液中的鵝膏毒肽，TFC技術(shù)可以在線處理生物樣品，速度快、選擇性好、靈敏度高、易于實(shí)現(xiàn)自動化。

4.4 毛細(xì)管區(qū)帶電泳法

該方法與HPLC相比效率更高、樣品和試劑耗量更少且其儀器結(jié)構(gòu)也簡單，紫外、熒光、電化學(xué)、質(zhì)譜、激光等多種類型檢測器均可結(jié)合用于該方法的檢測。Brüggemann等[55]首次利用毛細(xì)管區(qū)帶電泳法結(jié)合光電二極管陣列檢測器檢測了綠蓋鵝膏提取液和中毒病人尿液中的α-和β-鵝膏毒肽的含量，但其檢出限只達(dá)到1 ?g/mL；Robinson-Fuentes等[56]通過利用硼酸鹽緩沖液代替磷酸鹽緩沖液做背景電解質(zhì)并優(yōu)化主要參數(shù)，極大地提高了靈敏度，其檢出限可達(dá)1.5 ng/mL。Rittgen等[57]也報(bào)道了利用毛細(xì)管電泳結(jié)合質(zhì)譜法檢測鵝膏菌子實(shí)體中α-、β-、γ-鵝膏毒肽的含量，其檢出限可達(dá)13～79 ng/mL。

5 鵝膏肽類毒素檢測方法在我國的應(yīng)用及展望

在20世紀(jì)90年代中期之前，盡管我國的毒蘑菇中毒事件每年都有發(fā)生，但有關(guān)鵝膏肽類毒素的認(rèn)識僅僅停留在一些有毒蘑菇種類識別及其毒素的知識傳播方面[58-60]，從未有過實(shí)驗(yàn)室分析檢測毒素的報(bào)道。直到1997年，李東屏等[61]首次報(bào)道利用反相HPLC從黑鵝膏（現(xiàn)在稱為灰花紋鵝膏）子實(shí)體中分離鑒定6 種鵝膏肽類毒素。2 000年之后，我國在有毒蘑菇，尤其是鵝膏菌屬的資源分類和中毒事件調(diào)查及毒素研究方面開展了一些研究并取得了很好的進(jìn)展，在毒素檢測方面主要利用HPLC開展了我國各地不同種類的鵝膏菌子實(shí)體、不同部位、不同發(fā)育時(shí)期的肽類毒素檢測[40,62-63]；龔慶芳等[64]利用HPLC檢測了中毒患者體液（血清液和尿液）中的α-鵝膏毒肽，其檢出限可達(dá)0.1 ?g/mL。并且其研究表明中毒病人早期（前3 d）血液中α-鵝膏毒肽濃度明顯要高于第6天；同時(shí)也利用HPLC開展了鵝膏肽類毒素的分離純化和制備[44-45]。此外，近年來在我國也采用超高壓液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜檢測了有毒蘑菇子實(shí)體、血漿和尿液中的鵝膏肽類毒素，檢出限達(dá)0.01 ?g/mL[52-53]。

由于含鵝膏肽類毒素的毒蘑菇所引起的中毒明顯表現(xiàn)出潛伏期、腸胃炎期、假愈期和肝臟損害期4個(gè)階段，在進(jìn)入肝損害期的前幾天內(nèi)，中毒病人和沒有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)療機(jī)構(gòu)容易輕估其嚴(yán)重性，而耽誤了最佳治療時(shí)期，第4～5天后導(dǎo)致嚴(yán)重的肝腎等器官損害，一般在5～8 d后死亡。因此如果能夠在假愈期之前及時(shí)的診斷出中毒類型并加以正確的治療方法可大大降低死亡率。蘑菇中毒后的早期診斷在很多情況下難以獲得毒蘑菇標(biāo)本或者剩余物，此時(shí)可以通過檢測中毒病人的嘔吐物、血液和尿液中的鵝膏肽類毒素來確定。歐洲和北美的一些治療機(jī)構(gòu)就是利用ELISA試劑盒或者HPLC方法通過檢測早期中毒病人血液和尿液中的α-鵝膏毒肽而得以診斷[21,65]。但是在我國沒有一例這樣的臨床病例報(bào)告，因此，建議疾病預(yù)防控制中心和醫(yī)療機(jī)構(gòu)在條件具備的情況下能開展鵝膏肽類毒素的早期檢測工作，為毒蘑菇中毒診斷和治療提供強(qiáng)有力的依據(jù)，減少我國因誤食毒蘑菇而導(dǎo)致死亡的食物中毒事件。

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Historical Development and Present Situation of Detection Methods for Amanita Peptide Toxins

CHEN Zuo-hong1, HU Jin-song1,2
(1. College of Life Sciences, Hunan Normal University, Changsha 410081, China; 2. Biology Institute, University of South China, Hengyang 421001, China)

Fatal mushroom poisoning incidents occur annually all over the world and it is one of the important causes of human death due to food poisoning in China. The peptide toxins in some Amanita species are mainly responsible for the mortality. Rapid and effective detection of toxins from samples of p oisonous mushroom, food residue, vomit, b lood a nd urine has important significance for the identification of toxic sources and the development of targeted thera pies. This paper reviews the historical development and present situation of detection methods for Amanita peptide toxins including chemical color reaction, biochemical, physical and chromatographic methods. The application and prospects of these detection methods in China are also discussed.

Amanita; amatoxins; phallotoxins; detection methods

Q949.32

A

1002-6630（2014）08-0011-06

10.7506/spkx1002-6630-201408003

2014-03-17

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31372118；30972073）

陳作紅（1964—），男，教授，博士，研究方向?yàn)橛卸灸⒐郊捌涠舅亍-mail：chenzuohong@263.net