田維鵬，周東輝，張念章，朱興全，宋銘忻

剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲，在全球范圍內(nèi)廣泛感染人類和所有恒溫動(dòng)物。該病原能通過先天性或獲得性途徑感染宿主，是免疫抑制及免疫缺陷人群的主要致死病因之一[1-5]。由弓形蟲引起的弓形蟲病是一種重要的人獸共患寄生蟲病，可造成嚴(yán)重的公共安全問題并給畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-5]。因而對于預(yù)防和治療弓形蟲病的研究有著至關(guān)重要的意義。目前，國內(nèi)外對于弓形蟲抗原基因的研究主要集中于膜表面抗原(surface antigen，SAG)、微線體蛋白(microneme protein，MIC)、棒狀體蛋白(rhoptry protein，ROP)、致密顆粒蛋白(dense granule protein，GRA)等[6-12]，這四大類抗原均為弓形蟲入侵和毒力相關(guān)蛋白。它們雖然能夠代表弓形蟲入侵宿主階段的大部分蛋白，卻不能代表其它類型的抗原蛋白。因而對于新型抗原基因的研究能夠加快弓形蟲病診斷和疫苗方面的發(fā)展，從而減少弓形蟲病的危害。

弓形蟲胚層發(fā)育相關(guān)蛋白(Toxoplasmagondiiembryogenesis-related protein，TgERP)是弓形蟲卵囊發(fā)育階段的特有蛋白，屬于胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白(late embryogenesis abundant domain-containing proteins，LEAs)[13]。這類蛋白在弓形蟲中的功能尚不清楚，但在植物、無脊椎動(dòng)物和微生物中，關(guān)于LEAs有諸多報(bào)道[14]。LEAs具有顯著的多樣性。雖然其各自的功能尚不清楚，但LEAs被認(rèn)為在抵御各種惡劣外界環(huán)境的變化方面有著至關(guān)重要的作用[15]。TgERP是子孢子特有抗原，定位于卵囊上，推測與卵囊抵御外界環(huán)境的變化有關(guān)。同時(shí)該蛋白在卵囊上含量豐富，且免疫原性良好[16]，但目前尚未見關(guān)于該基因在不同基因型弓形蟲蟲株的遺傳變異研究報(bào)道。本研究首次從不同宿主和地理來源的15個(gè)弓形蟲蟲株中克隆了TgERP基因，并分析了其遺傳變異情況，研究結(jié)果將為進(jìn)一步評價(jià)該蛋白在弓形蟲病的血清學(xué)診斷和基因疫苗等方面的價(jià)值奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1蟲株 本試驗(yàn)所用弓形蟲樣品Prugniaud(PRU)、TgPLh、QHO、TgC7、PYS和RH，均由家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室寄生蟲功能基因課題組保存，其余蟲株的基因組DNA由美國田納西大學(xué)微生物系蘇春雷教授提供。所有蟲株的具體信息見表1。

表1 本試驗(yàn)所用弓形蟲樣品

Note: 1:Based on genotyping results of Zhou et al. (2011, 2010)[17-18]

1.2主要試劑 PremixTaqVersion2.0、DL2000 DNA Marker和pMD18-T Vector試劑盒為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品，普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技(北京)有限公司，Wizard? SV Genomic DNA Purification System購自Promega公司。

1.3引物設(shè)計(jì) 根據(jù) 網(wǎng)站中的弓形蟲VEG株(Gene ID:TGVEG_027520)TgERP基因的序列設(shè)計(jì)一對引物，上游引物(TgERP-F)序列為：5′-ATGGCGACCGAGCACTCACAC-3′，下游引物(TgERP-R)序列為：5′-CTAGCCAAGCTTTTCTTGAACCTT-3′，由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.4樣品處理及DNA提取 從液氮里取出弓形蟲TgPLh蟲株、TgC7蟲株、PYS蟲株、QHO蟲株及RH蟲株迅速置于37 ℃水浴中解凍，分別腹腔接種昆明鼠(0.5 mL/只)復(fù)蘇。連續(xù)傳3代后，分別收集感染弓形蟲TgPLh株、TgC7株、PYS株、QHO株及RH株昆明鼠的腹水置1.5 mL滅菌的EP管中，600 r/min離心10 min，棄掉上清液，-80 ℃保存。另取人工感染弓形蟲PRU株昆明鼠的腦組織，用滅菌的微型剪刀剪碎后碾磨，-80 ℃保存。將上述處理的樣品按照Wizard? SV Genomic DNA Purification System說明書操作步驟提取DNA，提取的DNA置于-20 ℃冰箱保存。

1.5目的基因的克隆 分別以15個(gè)弓形蟲蟲株的基因組DNA為模板，用引物TgERP-F/TgERP-R擴(kuò)增TgERP基因。PCR體系為：Premix Taq 12.5 μL、Primers(20 μmol/L)各 0.5 μL、DNA模板1 μL，用ddH2O補(bǔ)齊至25 μL。PCR擴(kuò)增條件簡單描述為：94 ℃ 5 min， 94 ℃ 30 s、57.3 ℃ 30 s、72℃ 1 min共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳由凝膠成像系統(tǒng)攝像。

1.6TgERP基因序列測定及分析 將上述PCR產(chǎn)物膠回收純化后連接pMD18-T載體，熱激法導(dǎo)入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)PCR鑒定的陽性菌液送由生工生物科技(上海)有限公司測序。將測序結(jié)果連同http://toxodb.org網(wǎng)站下載的VEG株(Gene ID:TGVEG_027520)和ME49株(Gene ID: TGME49_276850)的相應(yīng)序列，利用公式D=1-M/L計(jì)算TgERP基因的種內(nèi)變異率(M代表相同堿基數(shù)，L代表序列堿基總數(shù))[19]。利用Clustal X1.83及Mega 4.0軟件對獲得的序列進(jìn)行比對及計(jì)算遺傳距離，然后用Paup4.0程序中的鄰接法(Neighbor-joining method, NJ)繪制種系發(fā)育樹，并用Puzzle 5.2程序構(gòu)建最大似然樹(Maximum Likelihood, ML)[20-21]。鄰接法采用Tamura-Nei模型進(jìn)行分析；ML法采用Hky替代模型和Quartet puzzling搜索程序進(jìn)行分析，采用自展檢驗(yàn)(bootstrap test)估算所構(gòu)建系統(tǒng)樹的可靠性，復(fù)制數(shù)為1 000[21]。

1.7TgERP氨基酸序列的推導(dǎo)與分析 分別將獲得的15株弓形蟲的TgERP基因測序結(jié)果，利用DNAStar軟件翻譯成TgERP蛋白序列后進(jìn)行蛋白序列比對，分析其在氨基酸水平上的變異。

2 結(jié) 果

2.1PCR擴(kuò)增結(jié)果 15個(gè)弓形蟲蟲株均成功地?cái)U(kuò)增出長度約300 bp的片段，與預(yù)期目的片段長度相符，且無非特異性條帶，空白對照為陰性(圖1)。

圖1TgERP基因的PCR產(chǎn)物電泳圖

Fig.1AgarosegelelectrophoresisforPCRproductsoftheTgERPgene

M: DNA maker 2000; 1-15: PCR products of TgPLh, TgC7, PYS, QHO, PRU, RH, GT1, PTG, CTG, MAS, TgCgCa1, TgCatBr5, TgWtdSc40, TgCatBr64, and TgToucan for TgERP gene;

16: Negative control.

2.2測序結(jié)果及分析 從15個(gè)弓形蟲蟲株中擴(kuò)增的TgERP基因長度均為315 bp，A+T含量在46.67%～46.98%之間。利用DNAStar 5.0的Megalign軟件分析15個(gè)TgERP基因序列發(fā)現(xiàn)，僅在核苷酸序列的第224位發(fā)生了堿基的變異，變異率為0%～0.32%。其中TgPLh株、RH株、GT1株、MAS株、TgCatBr5株、TgCatBr64株及TgToucan株序列相同。

2.3TgERP基因系統(tǒng)發(fā)生樹 通過系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示，用ML和NJ法構(gòu)建的種系發(fā)育樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致(圖2)。其中基因型I型的RH株、TgPLh株和GT1株聚在一個(gè)分支上，基因型II型的PTG株、QHO株、PRU株和基因型Ⅲ型的弓形蟲CTG株聚在同一個(gè)分支上，其余基因型為稀有型的蟲株在兩個(gè)分支上均有出現(xiàn)。TgERP基因序列無法區(qū)分不同基因型的弓形蟲蟲株(圖2)。

圖2 TgERP基因核苷酸序列的遺傳進(jìn)化樹分析

2.4TgERP氨基酸序列的分析 將15株弓形蟲蟲株TgERP基因的ORF利用生物學(xué)軟件進(jìn)行翻譯，結(jié)果表明該段序列共編碼104個(gè)氨基酸。與弓形蟲VEG株和ME49的相應(yīng)序列進(jìn)行比對后發(fā)現(xiàn)，僅在氨基酸序列的第75位發(fā)生纈氨酸與丙氨酸的變異，變異率在0%～0.96%之間(圖3)。

圖3 TgERP氨基酸序列的比對結(jié)果

3 討 論

TgERP是卵囊階段的特有蛋白，在卵囊壁上含量豐富，具有較好的反應(yīng)原性[12]。Hill等[18]應(yīng)用該蛋白建立了ELISA診斷方法，對農(nóng)場飼養(yǎng)動(dòng)物的弓形蟲卵囊感染情況進(jìn)行了初步調(diào)查，證明卵囊污染在所檢測地區(qū)普遍存在。為了闡明TgERP基因在不同基因型弓形蟲蟲株的序列變異規(guī)律，本研究首次從不同宿主和地理來源的15個(gè)弓形蟲蟲株中克隆了TgERP基因。經(jīng)核苷酸序列比對后發(fā)現(xiàn)，該基因的變異率為0%～0.32%。對推導(dǎo)的氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，變異位點(diǎn)僅發(fā)生在氨基酸序列的第75位，說明該蛋白在不同基因型的弓形蟲蟲株中變異很小，具有高度的保守性。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，ML法和NJ法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致。TgERP基因序列雖然能夠區(qū)分弓形蟲基因型I型和基因型II/III型蟲株，但不能完全區(qū)分所有弓形蟲基因型蟲株，不適合作為遺傳標(biāo)記分子來研究弓形蟲的基因分型。

TgERP基因編碼的蛋白序列僅在第75位發(fā)生纈氨酸與丙氨酸的變異，變異率為0%～0.96%，表明該蛋白在不同弓形蟲蟲株中高度保守，可以作為血清學(xué)診斷方法的候選抗原，也可能作為疫苗研究的候選抗原，值得進(jìn)一步研究。

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