夏淑婷(綜述)，王 鵬，宋志忠(審校)

布魯氏菌病(Brucellosis，簡(jiǎn)稱布病)是一種全世界廣泛分布的人獸共患慢性細(xì)菌性傳染病。人間布病是我國(guó)法定乙類傳染病，人患病后，累及多種器官功能，病程較長(zhǎng)，久治不愈，嚴(yán)重者喪失勞動(dòng)和生活能力。布病防控的關(guān)鍵在于“三早”，“三早”的前提則是診斷。在布病診斷上，由于其臨床癥狀易與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、病毒性肝炎、結(jié)核、流行性感冒及各種骨關(guān)節(jié)病相混淆，僅依靠臨床癥狀的誤診率仍然較高[1-7]，只有通過(guò)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)才能確診。

傳統(tǒng)的布病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)主要依賴于細(xì)菌分離培養(yǎng)直接查到病原體，該方法耗時(shí)耗力，且實(shí)驗(yàn)室操作存在潛在的危險(xiǎn)性，并不實(shí)用；隨著技術(shù)的發(fā)展，用于人畜布病的血清學(xué)診斷方法已有試管凝集(SAT)、虎紅平板凝集(RBPT)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CFT) 、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、膠體金標(biāo)試驗(yàn)(GICA)等近十種[8-9]，血清學(xué)診斷操作較為簡(jiǎn)便，也較為快速，已逐漸成為布病診斷最為常用的手段。診斷靶點(diǎn)則是診斷方法的核心，其決定了診斷的特異性及敏感性，迄今布病的診斷靶點(diǎn)分為三類，即脂多糖(LPS)、外膜蛋白(OMPs)及其它菌體蛋白?，F(xiàn)將各診斷靶點(diǎn)做一簡(jiǎn)述。

1 脂多糖(LPS)

布魯氏菌LPS有3個(gè)區(qū)域：類脂A、核心低聚糖和O抗原或O鏈，它的O鏈部分含有布魯氏菌表面絕大多數(shù)的抗原位點(diǎn)，是布魯氏菌表面最為主要抗原，根據(jù)LPS是否含有O鏈將布魯氏菌分為粗造型(rough，R)和光滑型(smooth，S)。研究表明O鏈表面有7個(gè)不同的抗原位點(diǎn)，它們分別是A、M、C(M=A)、C(M〉A(chǔ))、C/Y(M〉A(chǔ))、C/Y(M=A)、C/Y(A〉M)等，這7種抗原決定基在所有的S型布魯氏菌中分布不均一，且沒有各自特異性特征[10]，所以在采用血清學(xué)診斷布魯氏菌病時(shí)，不能區(qū)分是自然感染還是疫苗免疫。在這7個(gè)抗原位點(diǎn)中C/Y抗原是布魯氏菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌O∶9共有的抗原[11]，其中C/Y(M=A)抗原與小腸結(jié)腸炎耶爾森菌O∶9共有最多的一種抗原決定基，因此布魯氏菌病以LPS為基礎(chǔ)的診斷與小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌O∶9存在嚴(yán)重的交叉反應(yīng)[12]；另外，布魯氏菌的LPS與沙門氏菌、土拉倫菌、假單胞菌、霍亂弧菌以及大腸桿菌O∶157等細(xì)菌也有一定的交叉反應(yīng)[13-16]。

盡管如此，LPS仍是迄今用于布病診斷最為常用的靶點(diǎn)[17]，在布病的防控中發(fā)揮著不可替代的作用。文獻(xiàn)報(bào)道的所用的全菌蛋白、粗制外膜蛋白、鹽析蛋白、酚鹽蛋白等[18-19]中，從其提取工藝上可看出，最主要的成分仍是LPS。使用LPS為靶點(diǎn)診斷時(shí)，應(yīng)充分考慮臨床癥狀及與可能交叉菌的排除檢查。

2 外膜蛋白(OMPs)

外膜蛋白(OMPs)是革蘭氏陰性細(xì)菌的一類非常獨(dú)特但又非常重要的蛋白質(zhì)，它們具有為外膜提供通透性，維持外膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定等作用，同時(shí)有些OMPs又是一類重要的免疫原性物質(zhì)，能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，因此成為免疫學(xué)中一種重要的診斷靶點(diǎn)。在布魯氏菌中，已有十幾種外膜蛋白被研究作為診斷靶點(diǎn)，主要的有BCSP31、BP26、Omp10、Omp25及Omp31等，它們與布魯氏菌病診斷存在交叉反應(yīng)細(xì)菌中同源蛋白的氨基酸同源性大都在50%以下(BCSP31與沙門氏菌的同源蛋白氨基酸相似性達(dá)57%～58%)，詳見表1。下面就幾種主要的蛋白分述如下。

表1布魯氏菌免疫原性外膜蛋白與存在交叉反應(yīng)細(xì)菌中同源蛋白的氨基酸相似性

Tab.1AminoacidsimilaritybetweenimmunogenicityoutermembraneproteinofBrucellaandthehomologousproteinofitscross-reactionbacteria

細(xì)菌(Bacteria)氨基酸相似性Amino acid similarity/%布魯氏菌(Brucella)BCSP31(330 aa)BP26(250 aa)Omp10(126 aa)Omp25(230 aa)Omp31(240 aa)耶爾森氏菌(Yersiniaa)26-2728-30﹨25-2624-36沙門氏菌(Salmonellab)57-5827-313825-3424-33弧菌(Vibrioc)36-3730-83﹨﹨23-69弗朗西斯菌(Francisellad)53﹨﹨﹨﹨

Note: a--Yersiniapestis,Yersiniapseudotuberculosis,Yersiniaenterocolitica;b--Salmonellaenterica,Salmonellatyphimurium;c--Vibriocholerae,Vibrioparahaemolyticus,Vibriovulnificus;d--Francisellatularensis.

2.1BCSP31該蛋白分子量大小約31 kD，為布魯氏菌細(xì)胞外膜蛋白，它抗原性強(qiáng)，具有保守性及多態(tài)性，且種間同源性較高，經(jīng)證實(shí)牛、羊、豬布魯氏菌BCSP31基因同源性可達(dá)100%[20]。不同研究團(tuán)隊(duì)的免疫蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果顯示，該蛋白既有良好的免疫反應(yīng)性，又有較高的特異性[21-22]。在布魯氏菌的基因診斷中，BCSP31的編碼基因也被作為PCR診斷的主要靶點(diǎn)[23]。但有研究者利用蛋白芯片進(jìn)行布魯氏菌蛋白免疫學(xué)檢測(cè)時(shí)，BCSP31的抗體只存在于感染的山羊血清中，而被測(cè)定的62份確認(rèn)感染布病的人血清中并未發(fā)現(xiàn)其抗體[24]，這也提示該外膜蛋白作為診斷靶點(diǎn)在人群的檢測(cè)中并不適用。

2.2Omp10 該蛋白分子量大小為10 kDa，屬于菌體外膜脂蛋白，是布魯氏菌重要的免疫原性蛋白，存在于所有已知的布魯氏菌的種和生物型之中[25-26]。Omp10與布魯氏菌的毒力相關(guān)，有研究表明編碼基因的3′端具有138 bp的核酸序列與HemH亞鐵螯合酶相同，因此推測(cè)其與細(xì)菌對(duì)鐵的利用和生物合成有關(guān)，其具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步的研究[27]。有關(guān)其作為診斷靶點(diǎn)進(jìn)行研究的報(bào)道較少，且主要是國(guó)內(nèi)的一些報(bào)道，在布魯氏菌相關(guān)免疫蛋白質(zhì)組的報(bào)道中[21-22]，也找不到Omp10有關(guān)的信息。

2.3Omp25 該蛋白分子量大小為25 kDa，在維持布魯氏菌菌外膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性中發(fā)揮著重要作用。其編碼基因在布魯氏菌種、生物型及各菌株中是一個(gè)高度保守(除綿羊附睪種布魯氏菌外同源性都在98%以上)。Omp25的氨基酸序列在與布病有交叉的細(xì)菌中又是最為特異。Boigegrain等[28]在分析布魯氏菌受到酸刺激分泌的蛋白質(zhì)時(shí)發(fā)現(xiàn)， Omp25 也被分泌到了細(xì)胞外；這提示這種蛋白與布魯氏菌的膜分泌系統(tǒng)相關(guān)，其可分泌的特征一方面說(shuō)明其可能在菌相關(guān)蛋白中占有較高的豐度，相關(guān)蛋白質(zhì)組分析顯示其在2D圖譜上出現(xiàn)多個(gè)蛋白點(diǎn)[21]；另一方面，當(dāng)布魯氏菌感染宿主時(shí)，其可游離的特性使其更易激發(fā)機(jī)體發(fā)生抗體。

2.4BP26又稱Omp28，分子量大小為26 kDa，為布魯氏菌細(xì)胞周質(zhì)蛋白，BP26存在于所有的布魯氏菌菌株中，在布魯氏菌感染牛、綿羊、山羊和人中均為優(yōu)勢(shì)免疫原，許多報(bào)道顯示其可以用來(lái)作為血清學(xué)檢測(cè)的靶蛋白，并有較高的準(zhǔn)確率[29-31]；且有研究者采用蛋白芯片的方法發(fā)現(xiàn)，該蛋白在所的布魯氏菌蛋白質(zhì)組中唯一可與感染的人及羊血清特異反應(yīng)的靶點(diǎn)[24]。近來(lái)，BP26上兩個(gè)線性表位已經(jīng)確認(rèn)(93DRDLQTGGI101及104QPIYVYPD111)[32]，為進(jìn)一步對(duì)該蛋白的免疫學(xué)分析提供了基礎(chǔ)。綜合上述信息，該蛋白在布病檢測(cè)上有較好的應(yīng)用前景。

2.5Omp31 該蛋白分子量大小為25 kDa，該蛋白暴露于細(xì)菌表面，常以寡聚體形式存在，當(dāng)溫度低于60 ℃時(shí)，具有SDS變性的能力。它在布魯氏菌不同種屬間非常保守，除流產(chǎn)布魯氏菌(B.Abortus)外，其它所有布魯氏菌種株都有表達(dá)[33-34]。Omp31可以誘導(dǎo)針對(duì)布魯氏菌感染的細(xì)胞免疫作用，同時(shí)布魯氏菌的Omp31有3個(gè)親水性氨基酸殘基片段，它還能引起保護(hù)性體液免疫反應(yīng)[35]。已有以O(shè)MP31為基礎(chǔ)建立的免疫學(xué)檢測(cè)方法檢測(cè)布病的相關(guān)報(bào)道[36]，但在最近的蛋白芯片對(duì)感染人及山羊檢測(cè)的報(bào)道中，均未發(fā)現(xiàn)針對(duì)該蛋白抗體[24]，因此對(duì)該蛋白作為檢測(cè)靶點(diǎn)需進(jìn)一步研究。

3 其它蛋白

除OMPs外，布魯氏菌中還有核蛋白L7/L12，伴侶蛋白GroEL及GroES，熱休克蛋白DnaK，以及超氧貨物歧化酶SOD等具有免疫原性，也是潛在的診斷靶點(diǎn)而被關(guān)注，但這些蛋白其它交叉細(xì)菌同源蛋白的氨基酸相似性大都達(dá)60%以上(表2)，這會(huì)一定程度上影響其作為布魯氏菌診斷的特異性。

表2布魯氏菌免疫原性菌體蛋白與存在交叉反應(yīng)細(xì)菌中同源蛋白的氨基酸相似性

Tab.2AminoacidsimilaritybetweenimmunogenicitymycoproteinofBrucellaandthehomologousproteinofitscross-reactionbacteria

細(xì)菌(Bacteria)氨基酸相似性Amino acid similarity/%布魯氏菌(Brucella)DnaK637 aaGroEL546 aaSOD199 aaL7/L12124 aaGroES98 aa耶爾森氏菌(Yersiniaa)65606348-6945沙門氏菌(Salmonellab)66614943﹨弧菌(Vibrioc)62-6561-6250-5363-6642-43弗朗西斯菌(Francisellad)63596050﹨

Note: a--Yersiniapestis,Yersiniapseudotuberculosis,Yersiniaenterocolitica;b--Salmonellaenterica,Salmonellatyphimurium;c--Vibriocholerae,Vibrioparahaemolyticus,Vibriovulnificus;d--Francisellatularensis.

3.1L7/L12 該蛋白分子量大小為10 kDa左右，為布魯氏菌胞漿核蛋白，它是核糖體的重要組成部分，在細(xì)菌蛋白質(zhì)合成過(guò)程中與延長(zhǎng)因子相互作用，在布魯氏菌中它的基因同源性高達(dá)97.1%以上，免疫原性分析L7/L12只有第15至第35個(gè)氨基酸屬于疏水性氨基酸，剩余親水性氨基酸殘基占整個(gè)蛋白序列的80%以上[35]，且作為抗原決定簇構(gòu)成了蛋白的主要部分，是T細(xì)胞優(yōu)勢(shì)抗原。以其為基礎(chǔ)構(gòu)建的疫苗對(duì)感染具有最顯著的抵抗作用[37-38]。因此該蛋白是一個(gè)潛在的診斷靶點(diǎn)。

3.2GroEL 該蛋白分子量大小為60 kDa左右，是微生物中參與蛋白損傷修復(fù)的重要蛋白，同時(shí)在壓力條件下保持蛋白的正常折疊中發(fā)揮重要作用。有研究者通過(guò)構(gòu)建的布魯氏菌納米小體抗體文庫(kù)，發(fā)現(xiàn)文庫(kù)可特異性的識(shí)別伴侶蛋白GroEL，從而認(rèn)為該蛋白是布魯氏菌的免疫主要蛋白[39]。其它研究者也發(fā)現(xiàn)，GroEL在對(duì)人及牛的感染中是一種重要的毒力因子，可與受布氏菌感染的人、牛及綿羊的血清反應(yīng)[21-22,40]。但該蛋白進(jìn)化中具有較高的保守性，因此單獨(dú)將此作為診斷靶點(diǎn)，可能影響診斷的特異性。

綜上所述，由于布魯氏菌是革蘭氏陰性菌，存在O特異性抗原，因此LPS仍然是布魯氏菌病診斷的最為重要的靶點(diǎn)，只是在做出診斷結(jié)論時(shí)要充分考慮交叉反應(yīng)的問(wèn)題，可以結(jié)合臨床癥狀與排除試驗(yàn)加以確認(rèn)。布魯氏菌蛋白為靶點(diǎn)的診斷是布病診斷的重要補(bǔ)充，是發(fā)展特異性診斷的努力方向。在蛋白靶點(diǎn)中外膜蛋白更是重點(diǎn)，而其它蛋白則又是補(bǔ)充。外膜蛋白中，從目前國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展看，BP26為首選靶點(diǎn)，BCSP31次之，后續(xù)為OMP25，OMP10，OMP31，其中OMP25與OMP31各一布魯氏菌的一個(gè)生物型中缺失。當(dāng)然由于同一蛋白不同研究者不同的實(shí)驗(yàn)條件，有些結(jié)果往往是相悖的，因此在研制診斷試劑時(shí)，全面的評(píng)價(jià)所有靶點(diǎn)，從中篩選實(shí)驗(yàn)所得的較好靶點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步研究是比較可靠的途徑。

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