梅玲玲,龔 璞,占 利,張俊彥,張云怡

副溶血性弧菌為沿海地區(qū)引發(fā)食物中毒的主要病原菌[1-2]，日本每年由副溶血性弧菌引起的食源性病例約為2萬例[3]。我國臺灣地區(qū)由副溶血性弧菌引起的疾病占細菌性食源性疾病的半數以上[4]，內陸1992-2001年間的微生物性食源性疾病暴發(fā)事件中由副溶血性弧菌引起的占31.1%[5]。2007年浙江省77起食物中毒事件中，由副溶血性弧菌引發(fā)的為35起，792例，占發(fā)病總起數和總人數的45.45%和55.00%，占微生物性食物中毒的68.6%、69.3%[6]。副溶血性弧菌引發(fā)的食源性疾病對社會穩(wěn)定、人民健康造成了比較大的危害。

多位點測序分型技術(Multi locus sequence typing，MLST)是為研究菌群基因結構而設計的一種高分辨率分型技術[7]。該方法通過對多個管家基因核酸序列的分析，依據等位基因的多樣性，確定菌株的序列型，非常適用于流行病學研究，并可通過互聯(lián)網上的數據庫對不同國家、地區(qū)分離的菌株進行比較，至今已成功應用于多種病原體的研究。本文針對浙江省不同來源樣品中分離的副溶血性弧菌O3∶K6血清型菌株進行多位點序列分型，通過與PubMLST數據庫中菌株基因型比對，分析不同來源分離菌株間的親緣關系，以掌握浙江省不同來源的副溶血性弧菌O3∶K6血清型菌株在遺傳進化間的關系，為開展副溶血性弧菌分子分型研究，制定有針對性的預防控制措施提供理論依據。

1 材 料

1.1菌種來源 62株副溶血性弧菌O3∶K6血清型菌株為本中心保存菌株，其中30株分離于不同地區(qū)的門診腹瀉病人，21株分離于15起食物中毒事件的病人，7株分離于食品污染物，4株分離于市售食品。11株分離于2005年，2株分離于2007年，35株分離于2008年，12株分離于2009年，2株分離于2010年。所有菌株經VITEK全自動微生物鑒定分析系統(tǒng)鑒定符合副溶血性弧菌的生化特性。用日本生研株式會社生產的抗血清鑒定為O3∶K6血清型。神奈川試驗結果均為陽性。

1.2實驗儀器、試劑 5331型梯度PCR儀為德國Eppendorf公司產品； BIO-RAD T2A型全自動數碼成像儀分析系統(tǒng)由美國 BIO-RAD科技公司生產；高保真TaqDNA聚合酶PCR試劑盒購自寶生物工程有限公司。

2 方 法

2.1MLST目標基因的選擇和引物的設計與合成 選擇副溶血性弧菌dnaE、gyrB、recA、dtdS、pntA、pyrC及tnaA7個管家基因作為MLST分析基因。PCR擴增和測序引物引用http://pubmlst網站上發(fā)表的副溶血性弧菌PCR引物序列(表1)，由上海生工生物工程有限公司合成。引物在使用前將其稀釋到25 μmol/L，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 用于MLST分析的7對引物實驗參數

*：上游引物中tgtaaaacgacggccagt部分，下游引物中caggaaacagctatgacc部分為通用測序引物序列部分。

Note: Universal sequencing primer sequences fortgtaaaacgacggccagtin forward primers andcaggaaacagctatgaccin the reverses.

2.2DNA提取 挑取單個菌落懸浮于3 mL 無菌ddH2O中，用麥氏濁度儀調至1個麥氏單位，吸取1 mL轉移至Eppendorf管，12 000 r/min離心5 min，棄上清，加1 mL 無菌ddH2O，振蕩均勻，100 ℃煮沸15 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液作為反應模板， 4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3MLST分型

2.3.1PCR擴增靶基因片段 50 μL的PCR反應體系包括：ddH2O 33.25 μL， Premix Ex TaqTM(10×) 5 μL，TaKaRa Taq DNA聚合酶(5 U/μL) 0.5 μL、MgCl2(25 mmol/L) 3.25 μL，dNTP 4 μL，上、下游引物 (25 μmol/L)各0.5 μL，模板DNA 2.0 μL；PCR反應條件：96 ℃預變性5 min； 96 ℃變性1 min，59 ℃～57 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30次循環(huán)后72 ℃延伸10 min。擴增產物在加入EB(溴化乙錠)的1.5 %瓊脂糖凝膠上電泳，紫外燈下觀察擴增效果。recA、gyrB、dnaE、dtdS、pntA、pyrC及tnaA基因對應的擴增片段長度分別為773 bp、629 bp、596 bp、497 bp、 470 bp、533 bp、463 bp。

2.3.2管家基因位點的測序及數據分析 將PCR擴增產物委托杭州華大基因公司進行雙向測序。測序結果經Chromas軟件和DNA Star軟件處理后，上傳至http://pubmlst副溶血性弧菌數據庫(V.parahaemolyticusDatabase Profiles)比對，獲得各管家基因位點的等位基因數值，并形成相應的等位基因譜，提交MLST網站，確定副溶血性弧菌O3∶K6血清型菌株的序列分型(Sequence Type，ST)，并與數據庫中的國內或國際分離菌株做進化關系分析。

3 結 果

3.1管家基因擴增片段結果 采用經過優(yōu)化的退火溫度、分別擴增副溶血性弧菌基因組上的7 個管家基因位點(recA、gyrB、dnaE、dtdS、pntA、pyrC和tnaA基因)目標片段結果，62株菌株均擴增出7 個管家基因片段，擴增產物的核酸濃度及純度均符合測序要求(圖1)。

圖1 7個管家基因PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖

Fig.1AgarosegelelectrophoresisofPCRamplificationproductofsevenhousekeepinggenes

1:08-江干-Y-72;2:05-紹-Y-34；3：09-W-367；4：08-寧-Y-4；5：09-安-毒-54;M：DNA marker

3.2副溶血性弧菌MLST分型 將等位基因譜提交MLST網站結果，62株副溶血性弧菌中59株為ST-3型(3，4，19，4，29，4，22)克隆群株，1株菌株MLST序列型為ST-121(3，2，82，52，4，78，66)，編號為09-W-114的菌株為新發(fā)現(xiàn)的序列型(5，10，34，27，77，49，23)，編號為08-江干-Y-75的菌株gyrB基因序列與AP4(Allelic profile)有很大的相似度，僅在第562位點上由T堿基突變?yōu)镃堿基，其余基因等位基因圖譜與ST-3型相同。

3.3副溶血性弧菌系統(tǒng)進化關系 通過在線軟件Start2，根據UPGMA法[10]繪制基因系統(tǒng)發(fā)生樹，分析結果顯示：62株副溶血性弧菌及數據庫中引用的菌株的序列型分為5個基因群(圖2，從上到下依次命名為A群，B群，C群，D群，E群)。

由圖2可見，ST-3序列型和ST-121序列型同屬C群，但在不同的分枝點上。09-W-114菌株為新發(fā)現(xiàn)的序列型，屬于D群。ST-3序列型與ST-121序列型的菌株的親緣關系較近，與09-W-114菌株在進化樹上的距離較遠。

圖2 副溶血性弧菌UPGMA系統(tǒng)發(fā)生樹

4 討 論

副溶血性弧菌是浙江省主要食源性病原菌，近十年來，由副溶血性弧菌引起的食物中毒事件居細菌性食物中毒的首位，開展副溶血性弧菌遺傳進化關系及其群體遺傳學特征研究對副溶血性弧菌病的預防和控制具有重要意義。多位點序列分型利用所測定的管家基因的核苷酸序列組合進行編碼分型，可有效分析不同時間不同地區(qū)臨床分離株的遺傳相關性，特別是多地域相關性微生物的流行病學、種內微進化、來源追蹤和抗生素耐受研究，并且其克服了不同實驗室數據重復性及可比性差的缺點，可進行數據共享[7-9]。本次通過對不同來源樣品中分離的副溶血性弧菌O3∶K6血清型菌株進行多位點序列分型研究發(fā)現(xiàn)：浙江省副溶血性弧菌分離株管家基因的等位基因數僅有3～4個，95.16%(59/62)菌株為ST-3克隆群，從分離對象來看，59株ST-3克隆群副溶血性弧菌29株分離自不同地區(qū)門診腹瀉病人，21株分離自15起食物中毒病人，7株分離自食物中毒病人所食用的食物，2株分離自市售食品。表明ST-3克隆群是浙江省高致病性O3∶K6血清型副溶血性弧菌的主要ST克隆群，這與國外Gonzalez-Escalona[10]等的相關研究報導一致。因此，作者認為浙江省在公共衛(wèi)生監(jiān)測工作中應重點關注ST-3克隆群副溶血性弧菌，加大對食品，尤其是對海產品的副溶血性弧菌的監(jiān)測力度，并引導公眾形成健康的飲食習慣(食用煮熟的食物)，防制由此類病原菌引起的食源性疾病的暴發(fā)流行。

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