許 敏， 韓玉林,①， 原海燕， 趙文進， 張繼露， 付佳佳

〔1. 江西財經(jīng)大學藝術學院園林系 江西省生態(tài)環(huán)境實驗教學示范中心， 江西 南昌 330032;2. 江蘇省·中國科學院植物研究所(南京中山植物園)， 江蘇 南京 210014； 3. 南昌工學院， 江西 南昌 330108〕

銅是生物必需的營養(yǎng)元素之一，適量的銅對人和動植物都有益，但過量的銅對生物的生長和代謝均具有毒害作用[1]。銅礦開采過程中產(chǎn)生的銅尾礦礦砂及其滲出液中均含有過量的銅及其他重金屬元素，而其中的氮、磷及有機質含量卻極端貧瘠，pH值也較低。因此，用于改良和修復銅尾礦礦砂的植物除應具有較強的抗重金屬脅迫能力外，還應具備較強的耐貧瘠能力。

研究結果表明：部分豆科植物對銅污染土壤具有一定的耐受能力和修復作用。如：在安徽省的銅陵銅礦廢棄地及甘肅省的白銀銅礦廢棄地上均自然生長著較多的豆科(Leguminosae)植物[2]；而豆科植物苜蓿(MedicagosativaLinn.)對重金屬污染土壤也具有一定的修復作用[3]。黃花苜蓿(M.falcataLinn.)也是一種豆科植物，具有耐低溫、耐干旱及耐鹽堿能力，是優(yōu)良的綠肥及牧草種質資源之一[4]，然而，目前有關黃花苜蓿對銅的耐性及其對銅污染土壤修復作用的研究尚未見報道。

鑒于此，作者采用盆栽實驗方法，將黃花苜蓿幼苗栽植于添加了銅尾礦礦砂的栽培基質中，對黃花苜蓿幼苗生長以及部分生理指標的變化進行分析，以期探討豆科植物對重金屬銅的耐性機制，并為利用黃花苜蓿修復Cu污染環(huán)境提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗用黃花苜蓿種子購于江蘇省沭陽種苗市場；供試銅尾礦礦砂取自江西省德興銅尾礦礦壩，園土取自江西財經(jīng)大學麥廬校區(qū)。采用Han等[5-6]的方法播種并培養(yǎng)黃花苜蓿幼苗，選擇株高約10 cm且生長一致的幼苗進行脅迫實驗。

1.2 方法

1.2.1 脅迫處理方法 將銅尾礦礦砂與園土按比例混合制成栽培基質，其中銅尾礦礦砂的體積分數(shù)分別為0%(對照)、25%、50%、75%和100%。將各栽培基質分別裝入直徑15 cm、高10 cm的塑料盆中，每處理3盆(每盆視為1次重復)，每盆栽植5株幼苗，共15盆。置于室外自然光照條件下培養(yǎng)，并根據(jù)土壤濕度狀況及時補充適量水分。處理30 d后將各處理組幼苗全部取出，沖洗干凈并吸干表面水分，用于各項生長和生理指標的測定。

1.2.2 各指標測定方法 每處理隨機選取3株幼苗，用直尺分別測量株高和根長，結果取平均值，并按照公式“耐性指數(shù)=(處理組幼苗平均根長/對照組幼苗平均根長)×100%[5]”計算耐性指數(shù)。將植株的地上與地下部分分開后，分別置于105 ℃干燥箱內殺青0.5 h，然后于60 ℃條件下干燥至恒質量，分別稱取地上和地下部分的干質量。

1.3 數(shù)據(jù)計算和統(tǒng)計分析

應用EXCEL 2007數(shù)據(jù)處理軟件和SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和方差分析，并采用鄧肯氏(Duncan’s)新復極差法對實驗數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。

2 結果和分析

2.1 添加銅尾礦礦砂的栽培基質對黃花苜蓿幼苗生長的影響

在添加銅尾礦礦砂的栽培基質中黃花苜蓿幼苗的生長狀況見表1。由表1可以看出：隨著銅尾礦礦砂體積分數(shù)的提高，黃花苜蓿幼苗的株高和根長均呈不斷下降的趨勢。栽培基質中銅尾礦礦砂體積分數(shù)為50%、75%和100%時，幼苗株高均與對照差異顯著(P<0.05)，但根長與對照差異不顯著(P>0.05)。銅尾礦礦砂體積分數(shù)為100%時，幼苗的株高和根長均最低，分別較對照下降了23.44%和12.34%。

由表1還可以看出：隨栽培基質中銅尾礦礦砂體積分數(shù)的提高，黃花苜蓿幼苗地上和地下部分干質量也呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。銅尾礦礦砂體積分數(shù)為75%和100%時，幼苗的地上部分干質量均與對照有顯著差異，其余處理組的地上和地下部分干質量均與對照無顯著差異。在銅尾礦礦砂體積分數(shù)100%的條件下，黃花苜蓿幼苗的地上和地下部分干質量均最低，分別較對照下降了39.06%和12.50%。

統(tǒng)計結果(表1)表明：各處理組黃花苜蓿幼苗的耐性指數(shù)均低于對照，且隨栽培基質中銅尾礦礦砂體積分數(shù)的提高呈逐漸降低的趨勢。在銅尾礦礦砂體積分數(shù)100%的條件下，幼苗的耐性指數(shù)降幅最大，說明在高濃度銅脅迫條件下，黃花苜蓿幼苗對銅脅迫的耐性降低，植株生長受到抑制。

表1 添加銅尾礦礦砂的栽培基質對黃花苜蓿幼苗生長的影響

2.2 添加銅尾礦礦砂的栽培基質對黃花苜蓿幼苗部分生理指標的影響

2.2.1 對葉片光合色素含量的影響 在添加銅尾礦礦砂的栽培基質中黃花苜蓿幼苗葉片光合色素(包括葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素)含量的變化見表2。從表2可以看出：各處理組黃花苜蓿幼苗葉片中葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量的變化趨勢與其生長指標的變化趨勢較一致，均隨銅尾礦礦砂體積分數(shù)的提高而逐漸下降，且各處理組幼苗葉片的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的含量均與對照差異顯著(P<0.05)。在銅尾礦礦砂體積分數(shù)100%的條件下，黃花苜蓿幼苗葉片中的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的含量均最低，分別較對照下降了64.71%、65.08%和54.89%。

表2 添加銅尾礦礦砂的栽培基質對黃花苜蓿幼苗葉片光合色素含量的影響

由表3還可見：在銅尾礦礦砂體積分數(shù)不同的栽培基質中，黃花苜蓿幼苗地上部分的MDA含量均高于對照但變化趨勢無明顯規(guī)律性，并且在銅尾礦礦砂體積分數(shù)100%的條件下，其地上部分的MDA含量較對照顯著增加，增加幅度達19.05%；而地下部分的MDA含量則呈現(xiàn)在銅尾礦礦砂體積分數(shù)25%和50%的條件下上升、在銅尾礦礦砂體積分數(shù)75%和100%的條件下下降的趨勢，并且在銅尾礦礦砂體積分數(shù)25%和50%的條件下顯著高于對照，而在銅尾礦礦砂體積分數(shù)75%和100%的條件下與對照無顯著差異(P>0.05)。

表3 添加銅尾礦礦砂的栽培基質對黃花苜蓿幼苗地上和地下部分超氧陰離子自由基和丙二醛(MDA)含量的影響

2.2.3 對過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)及過氧化氫酶(CAT)活性的影響 在添加銅尾礦礦砂的栽培基質中黃花苜蓿幼苗地上和地下部分POD、SOD和CAT活性的變化見表4。從表4可以看出：隨栽培基質中銅尾礦礦砂體積分數(shù)的提高，黃花苜蓿幼苗地上和地下部分的POD活性呈逐漸增加的趨勢，并在銅尾礦礦砂體積分數(shù)100%的條件下達到最高，且與對照差異顯著(P<0.05)，分別較對照增加了38.87%和35.61%。

從表4還可以看出：在添加體積分數(shù)25%、50%和75%銅尾礦礦砂的栽培基質中，黃花苜蓿幼苗地上和地下部分的SOD活性均高于對照且逐漸增加，而在銅尾礦礦砂體積分數(shù)100%的栽培基質中則低于對照，并在銅尾礦礦砂體積分數(shù)75%的條件下達到最高。各處理組幼苗地上和地下部分的SOD活性均與對照有顯著差異。

統(tǒng)計結果(表4)表明：隨著銅尾礦礦砂體積分數(shù)的提高，黃花苜蓿幼苗地上和地下部分的CAT活性均呈逐漸下降的趨勢；并且除銅尾礦礦砂體積分數(shù)25%處理組外，其余3個處理組黃花苜蓿幼苗地上和地下部分的CAT活性均顯著低于對照。在銅尾礦礦砂體積分數(shù)100%的栽培基質中，黃花苜蓿幼苗地上和地下部分的CAT活性分別較對照下降了47.97%和48.84%。

2.2.4 對谷胱甘肽(GSH)和抗壞血酸(AsA)含量的影響 在添加銅尾礦礦砂的栽培基質中黃花苜蓿幼苗地上和地下部分GSH和AsA含量的變化見表5。 從表5可以看出：隨栽培基質中銅尾礦礦砂體積分數(shù)的提高，幼苗地上和地下部分的GSH含量基本呈逐漸增加的趨勢，且均高于對照。在銅尾礦礦砂體積分數(shù)100%的條件下，幼苗地上和地下部分的GSH含量均顯著高于對照，增幅分別為19.64%和16.13%。

從表5還可以看出：隨栽培基質中銅尾礦礦砂體積分數(shù)的提高，黃花苜蓿幼苗地上和地下部分的AsA含量變化無明顯規(guī)律性。在銅尾礦礦砂體積分數(shù)25%的栽培基質中，黃花苜蓿幼苗地上和地下部分的AsA含量均達到最高值且與對照差異顯著，分別較對照增加了11.36%和2.47%。在銅尾礦礦砂體積分數(shù)100%的條件下，黃花苜蓿幼苗地下部分的AsA含量則顯著低于對照，降幅為12.99%；而幼苗地上部分的AsA含量則較對照略有增加，但增幅并不大，僅為3.57%。

表4 添加銅尾礦礦砂的栽培基質對黃花苜蓿幼苗地上和地下部分過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性的影響

表5 添加銅尾礦礦砂的栽培基質對黃花苜蓿幼苗地上和地下部分谷胱甘肽(GSH)和抗壞血酸(AsA)含量的影響

3 討論和結論

在受到重金屬脅迫時，植物的生長狀況能夠直接反映出植物對重金屬脅迫的抗性[6]。因此，植物的生長指標是分析植物對重金屬抗性的重要依據(jù)之一。研究結果表明：在銅尾礦礦砂體積分數(shù)不同的栽培基質中，黃花苜蓿幼苗的株高、根長以及地上部分和地下部分的干質量均低于對照，且隨銅尾礦礦砂體積分數(shù)的提高呈逐漸降低的趨勢。說明在銅尾礦礦砂的脅迫下黃花苜蓿幼苗的生長受到一定程度的影響。

光合色素含量的變化在一定程度上反映了植物的光合作用強度，從而影響植物的生長[11]。隨栽培基質中銅尾礦礦砂體積分數(shù)的提高，黃花苜蓿幼苗葉片的光合色素(包括葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素)含量呈逐漸下降的趨勢，并且在銅尾礦礦砂體積分數(shù)100%的栽培基質中幼苗的光合色素含量降至最低。說明銅脅迫條件下黃花苜蓿幼苗的葉綠體膜受到破壞、光合色素含量降低，植株的光合作用受到明顯抑制。

在通常情況下，植物可通過啟動抗氧化酶系統(tǒng)有效清除體內產(chǎn)生的活性氧、維持活性氧的代謝平衡并保護細胞膜結構，這在一定程度上使植物能夠抵御逆境脅迫[14]。在添加銅尾礦礦砂的栽培基質中，黃花苜蓿幼苗地上和地下部分的過氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性基本上均顯著高于對照，說明在銅脅迫條件下黃花苜蓿幼苗體內的抗氧化酶系統(tǒng)被啟動，對黃花苜?？广~脅迫有重要作用。

谷胱甘肽(GSH)和抗壞血酸(AsA)是普遍存在于植物體內的水溶性抗氧化劑，在植物抗氧化脅迫及清除活性氧等方面都有重要作用[9]。在添加銅尾礦礦砂的栽培基質中，黃花苜蓿幼苗地上和地下部分的GSH含量均高于對照，說明銅脅迫能夠促進黃花苜蓿體內GSH的合成，這對增強黃花苜蓿耐銅性有重要作用。栽培基質中添加體積分數(shù)25%的銅尾礦礦砂對黃花苜蓿幼苗地上和地下部分AsA的合成有促進作用，而栽培基質中添加體積分數(shù)100%的銅尾礦礦砂則抑制了幼苗體內AsA的合成，使幼苗生長受到抑制。

總體上而言，雖然在栽培基質中添加不同體積分數(shù)的銅尾礦礦砂對黃花苜蓿幼苗的生長及光合色素含量均有一定的影響，對幼苗的抗氧化系統(tǒng)也有一定的損傷，但在純銅尾礦礦砂(體積分數(shù)100%)中栽植30 d，黃花苜蓿幼苗依然能夠生長，說明黃花苜蓿具有一定的抗銅脅迫能力，可用于銅尾礦礦砂的綠化固著和銅污染環(huán)境的植物修復。

參考文獻：

[1] 吳 雪, 楊曉婷, 王 冰, 等. 外源乙酸和EDTA對銅尾礦礦砂中蘆葦幼苗生長及部分金屬元素積累的影響[J]. 植物資源與環(huán)境學報, 2011, 20(4): 29-34.

[2] 黃銘洪. 環(huán)境污染與生態(tài)恢復[M]. 北京: 科學出版社, 2003: 168-169.

[3] JADIA C D, FULEKAR M H. Phytotoxicity and remediation of heavy metals by Alfalfa (Medicagosativa) in soil-vermicompost media[J]. Advances in Natural and Applied Sciences, 2008, 2(3): 141-151.

[4] 王俊杰, 云錦鳳, 呂世杰. 黃花苜蓿種質的優(yōu)良特性與利用價值[J]. 內蒙古農業(yè)大學學報: 自然科學版, 2008, 29(1): 215-219.

[5] HAN Y L, HUANG S Z, YUAN H Y, et al. Organic acids on the growth, anatomical structure, biochemical parameters and heavy metal accumulation ofIrislacteavar.chinensisseedling growing in Pb mine tailings[J]. Ecotoxicology, 2013, 22(6): 1033-1042.

[6] HAN Y L, HUANG S Z, YUAN H Y, et al. Effect of Pb and Zn combined stress on the growth and elements accumulation of two different ecotype species ofIrisL. in artificial contaminated soils[J]. Fresenius Environmental Bulletin, 2013, 22(5): 1548-1555.

[7] 李合生. 植物生理生化實驗原理和技術[M]. 北京: 高等教育出版社, 2000: 134-168．

[8] KAMPFENKEL K, Van MONTAGU M, INZé D. Extraction and determination of ascorbate and dehydroascorbate from plant tissue[J]. Analytical Biochemistry, 1995, 225(1): 165-167.

[9] MA F W, CHENG L L. The sun-exposed peel of apple fruit has higher xanthophyll cycle-dependent thermal dissipation and antioxidants of the ascorbate—glutathione pathway than the shade peel[J]. Plant Science, 2003, 165(4): 819-827.

[10] 王愛國, 羅廣華. 植物的超氧物自由基與羥胺反應的定量關系[J]. 植物生理學通訊, 1990(6): 55-57.

[11] 高 霽, 郝興宇, 居 煇, 等. 自由大氣CO2濃度升高對夏大豆光合色素含量和光合作用的影響[J]. 中國農學通報, 2012, 28(6): 47-52.

[12] 李國婧. 超氧陰離子的產(chǎn)生及其在植物體內作用的研究[J]. 生物技術世界, 2012(4): 24-25.

[13] 張麗麗, 趙九洲, 趙婷婷, 等. 重金屬鉛和鎘對溪蓀生理特性的影響[J]. 濕地科學, 2011, 9(2): 198-202.

[14] LIANG Y C, CHEN Q, LIU Q, et al. Exogenous silicon (Si) increases antioxidant enzyme activity and reduces lipid peroxidation in roots of salt-stressed barley (HordeumvulgareL.) [J]. Journal of Plant Physiology, 2003, 160(10): 1157-1164.