龔雋，葛京平，楊斌，孫穎浩

0 引言

ABH2為ALKBH蛋白質(zhì)家族中的一個亞型，是一個上游的癌蛋白-黏蛋白1(mucin 1，MUC1)分子，可導(dǎo)致膀胱尿路上皮癌。質(zhì)粒介導(dǎo)的RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)可抑制目標mRNA，但難以穩(wěn)定均一地下調(diào)靶基因。文中構(gòu)建了ABH2基因的慢病毒載體，提供了相關(guān)的穩(wěn)定的病毒載體系統(tǒng)。

1 材料與方法

1.1 材料Platimum HIFI Taq Polymerase高保真擴增酶，線性化U6載體，Platinum Taq DNA Polymerase，100 mmol/L dNTPs，DH5α感受態(tài)細胞，stbl3感受態(tài)細胞，包裝質(zhì)粒Packaging Mix，293T細胞，oligo dT/隨機引物/特異性引物(諾百生物);限制性內(nèi)切酶(MBI公司);T4 ligase連接酶(NEB公司);U6質(zhì)粒(諾百預(yù)制);Trizol Reagent，DEPC H2O，0.1 mol/L dTT，SYBR Green I，Rnase out(我科實驗室);慢病毒干擾載體PL/shRNA/F(Invitrogen);0.05%Trypsin、Opti-MEM、DMEM、FBS(GIBCO);Lipofectamine 2000(Invitrogen)。

1.2 方法

1.2.1 全基因合成及表達載體構(gòu)建①對ABH2基因的全序列進行分析;②根據(jù)基因序列分析的結(jié)果，進行單鏈oligo的設(shè)計及合成，并在序列的5′端添加限制性酶切位點及Kozak序列GCCGCCACC，在序列的3′端添加限制性酶切位點;③利用PCR將合成的oligo拼接成完整的基因;④將合成好的序列裝入pcDNA3.1(+)載體并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞DH5α;⑤測序驗證重組克隆中基因序列是否與要求相符。

1.2.2 shRNA干擾載體構(gòu)建設(shè)計shRNA干擾序列3對，見表1。將3對oligo(連同陰性對照鏈)退火成雙鏈。然后連接線性化的U6載體，并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞stbl3，退火、連接和轉(zhuǎn)化的具體方法如下:①oligo退火，將3對合成好的oligo用雙蒸水溶解成100 μmol/L，互補單鏈各取5 μL兩兩混合，按shRNA oligo退火體系(100 μmol/L top strand oligo 5 μL，100 μmol/L bottom strand oligo 5 μL，10×oligo annealing buffer 2 μL，雙蒸水8 μL，共計20 μL)進行退火。然后將3份oligo混合物在95℃加熱5 min，再放置室溫自然冷卻20 min，形成雙鏈oligo。②連接，將退火的雙鏈oligo繼續(xù)稀釋成10 nmol/L濃度，按酶連接體系在室溫連接30 min。酶連接體系如下:5×ligation buffer 4 μL，線性化U6載體(5 ng/μL)2 μL，ds oligo(10 nmol/L)4 μL，T4 DNA ligase(1 U/μL)1 μL，雙蒸水9 μL，共計20 μL。③轉(zhuǎn)化，取1 μL連接反應(yīng)，與100 μL感受態(tài)細胞混合，冰浴20 min，42℃熱擊1 min，冰浴2 min。加200 μL LB培養(yǎng)液，置于搖床上，37℃100 r/min孵育1 h。取50 μL涂布含AMP瓊脂平板，37℃過夜，挑選單克隆菌群接種于500 mL含AMP的LB培養(yǎng)液中，37℃搖菌16 h，按照Axygen DNA小抽試劑盒說明書抽提質(zhì)粒。

表1 shRNA oligo序列Table 1 Oligo sequence of shRNA

1.2.3 干擾效果篩選-QPCR根據(jù)不同的載體分為4組:siRNA-468組、siRNA-571組、siRNA-662組和對照組。每組試驗均重復(fù)3次。對于U6-ALKBH2-468、U6-ALKBH2-571、U6-ALKBH2-662載體和表達載體共轉(zhuǎn)染HEK293細胞樣品，抽提RNA，反轉(zhuǎn)錄到cDNA后，用sybr法定量目的基因ABH2的表達水平。反轉(zhuǎn)錄:取一滅菌的無酶的eppendorf管，每個樣本加入如下組分:RNA 5 μL(1 μg/μL)，引物(50 μmol/L oligo dT)0.5 μL，隨機引物0.5 μL，10 mmol/L dNTP Mix 1 μL，DEPC-treated water 5 μL，共計12 μL，得到MixⅠ。在12 μL MixⅠ里加入5x First-Strand buffer 4μL，0.1mol/L dTT 2μL，Rnaseout 40 U/μL 1 μL，SuperScriptⅢ反轉(zhuǎn)錄酶(200 U/μL)1 μL，得到MixⅡ體系。25℃處理5 min，50℃處理60 min，70℃處理15 min。立即放置到冰上。PCR擴增，引物及序列如下:ALKBH2-F:CTGTCTCCTTCGGTGCCT，ALKBH2-R:TGTTGGTCGGGTGGTTCA，Actin-F:CATTGCCGACAGGATGCAG，Actin-R:CTCGTCATACTCCTGCTTGCTG。PCR體系中各組分的體積:雙蒸水12.3 μL，10×PCR緩沖液2.0 μL，Mg2+(50 mmol/L)2.0 μL，dNTPs(10 mmol/L)0.5 μL，上游引物+下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，20×SYBR液，1.0 μL，Taq酶(5 U/μL)0.2 μL，模板cDNA 1.0 μL，共計20 μL。PCR反應(yīng)條件:95℃保持2 min;95℃保持10 s，60℃保持30 s，70℃保持45 s，循環(huán)40次;熔解(70～95℃)。

實時熒光定量核酸擴增檢測系統(tǒng)(real-time quantitative PCR detecting system，qPCR)利用熒光基團在不同條件下發(fā)出變化的熒光信號，動態(tài)即時監(jiān)測目標基因在循環(huán)擴增過程中增量產(chǎn)物的變化，并可實現(xiàn)定量分析。內(nèi)參基因和靶基因擴增效率相似時，qPCR法測定靶基因相對表達量的公式為R=2-ΔΔCt，即以實驗組靶基因的Ct值減去內(nèi)參基因的Ct值，將上述的結(jié)果取2的負冪指數(shù)。

1.2.4 選擇shRNA-ALKBH2-571構(gòu)建慢病毒載體將1對oligo退火成雙鏈。然后連接線性化的pL/shRNA/F載體，并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞stbl3，退火、連接和轉(zhuǎn)化的具體方法如下:①oligo退火:將合成好的oligo用雙蒸水溶解成100 μmol/L，互補單鏈各取5 μL兩兩混合，按shRNA oligo退火體系(100 μmol/L top strand oligo 5 μL，100 μmol/L bottom strand oligo 5 μL，10×oligo annealing buffer 2 μL，雙蒸水8μL，共計20μL)進行退火。然后將oligo混合物在95℃加熱5 min，再放置室溫自然冷卻20 min，形成雙鏈oligo。②連接:將退火的雙鏈oligo繼續(xù)稀釋成10 nmol/L濃度，按酶連接體系在室溫連接30 min。酶連接體系如下:5×ligation buffer 4 μL，線性化pL/shRNA/F載體(5 ng/μL)2 μL，ds oligo(10 nmol/L)4μL，T4 DNA ligase(1U/μL)1μL，雙蒸水9 μL，共計20 μL。③轉(zhuǎn)化:取1 μL連接反應(yīng)體系和100μL感受態(tài)細胞混合，冰浴20min，42℃熱擊1 min，冰浴2 min。加200 μL LB培養(yǎng)液，37℃100 r/min孵育1 h。取50 μL涂布含抗性LB平板。

1.2.5 包裝慢病毒用構(gòu)建的慢病毒干擾載體和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞，包裝病毒，收集病毒原液，超速離心濃縮，并測定滴度。具體如下:①取細胞狀態(tài)良好的293T細胞，細胞計數(shù)后，每個培養(yǎng)皿接種6×106個細胞，37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜;第2天轉(zhuǎn)染前移去培養(yǎng)液，換5 mL Opti-MEM培養(yǎng)液;取9μg Packaging Mix和3μg慢病毒表達質(zhì)粒加入1.5 mL Opti-MEM(經(jīng)37℃預(yù)熱)中，輕輕混勻;取36 μL lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑加入1.5 mL Opti-MEM中，輕輕混勻，室溫放置5 min;輕輕混合質(zhì)粒溶液和lipofectamine 2000稀釋液，置室溫20 min;將3 mL質(zhì)粒脂質(zhì)體復(fù)合物加入到細胞培養(yǎng)皿中，輕輕混勻，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育6 h后，更換完全培養(yǎng)液DMEM+10%FBS;48 h后收集細胞培養(yǎng)上清，離心半徑12.5 cm，3000 r/min離心10min，去除細胞和碎片，并用0.45μm的濾器過濾;將病毒原液在50000×g下超速離心2 h，去除上清，重懸于1 mL DMEM培養(yǎng)液中，分裝小管，放置于-80℃保存?zhèn)溆?。②慢病毒液滴度測定:將HEK293細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，病毒稀釋用培養(yǎng)液為含8 μg/mL polybrene和2%胎牛血清的細胞培養(yǎng)基。第1天，細胞胰酶消化計數(shù)后，按照每孔8000細胞接種96孔板，37℃培養(yǎng)過夜，感染時細胞長至30%～50%的融合密度;第2天，將保存于-80℃冰箱中病毒液冰水浴融化，用含有8 μg/mL polybrene和2%FBS的細胞培養(yǎng)液進行梯度稀釋。吸去96孔板中的原先的培養(yǎng)基，然后在每孔中加入50 μL慢病毒稀釋用培養(yǎng)基，輕輕混勻各管慢病毒稀釋液，再各取50 μL慢病毒稀釋液加入每孔細胞中，每個稀釋度3個重復(fù)。放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。第3天，去除含慢病毒的培養(yǎng)基，加入100 μL的完全培養(yǎng)基;第5-6天，在熒光顯微鏡下觀察各孔中熒光細胞數(shù)量，病毒滴度為表達熒光的細胞數(shù)除以該孔加入的稀釋的病毒液相當于原病毒的體積。

1.2.6 鑒定干擾效果vshRNA-ALKBH2-571慢病毒與表達載體共轉(zhuǎn)染腎癌細胞株ACHN，抽提RNA，反轉(zhuǎn)錄到cDNA后，用sybr法定量目的基因ABH2的表達水平。具體方法同1.2.3干擾效果篩選。

1.3 統(tǒng)計學分析采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，定量資料以均數(shù)±標準差(x±s)表示，多組均數(shù)間的比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法;2組均數(shù)的比較采用兩獨立樣本t檢驗。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

合成基因及表達載體構(gòu)建經(jīng)測序驗證正確。shRNA干擾載體序列驗證無誤。ABH2數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，對照組、siRNA-468組、siRNA-571組、siRNA-662組ABH2 mRNA相對表達量分別為0.783±0.086、0.369±0.046、0.153±0.026和0.154±0.028。siRNA-571組和siRNA-662組與對照組和siRNA-468組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。shRNA對目的基因ABH2的干擾效率為:ShR-571(84.7%)＞ShR-662(84.6%)＞ShR-468(63.1%)。選擇對ABH2干擾效果最佳的ALKBH2-571構(gòu)建慢病毒載體及包裝慢病毒。轉(zhuǎn)染實驗48 h后，在熒光顯微鏡下的可見熒光，證實轉(zhuǎn)染成功，見圖1。包裝的慢病毒滴度為1.1×108TU/mL。ABH2基因由慢病毒介導(dǎo)的RNAi后的表達豐度:陰性對照組ABH2 mRNA相對表達量為0.785±0.082，siRNA-571組為0.078±0.006，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，慢病毒PL/shRNA/F-ALKBH2-571對目的基因ABH2的干擾效率為92.2%。

圖1 慢病毒轉(zhuǎn)染后熒光顯微鏡示意圖(×100)Figure 1 Microscopic observation of the cells after lentiviral transfection(×100)

3 討論

ABH2在DNA損傷修復(fù)機制具有重要作用［1-4］，與人類各種腫瘤的發(fā)生發(fā)展及治療領(lǐng)域有密切的關(guān)系［5-7］。有研究表明，ABH2基因在人尿路上皮癌細胞株KU7的發(fā)展中的作用和功能可能是:抑制黏蛋白的跨膜蛋白MUC1的表達，誘導(dǎo)G1期細胞周期阻滯。此外，抑制ABH2可增加上皮細胞鈣黏蛋白和降低波形蛋白表達，從而阻滯上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化［8］。

RNAi是一項基因沉默技術(shù)，在癌癥的研究中得到了廣泛的應(yīng)用［9-10］。質(zhì)粒介導(dǎo)RNAi的局限性在于其效率較低，作用時間較短，且作用弱，不能有效抑制基因表達，穩(wěn)定性較差。慢病毒載體可轉(zhuǎn)染分裂期及非分裂期細胞，能將目標基因整合至宿主基因組，可應(yīng)用于腫瘤的分子生物學水平研究和基因治療［11-13］。與其他病毒載體相比，有較大的穩(wěn)定性，并且作用持久，感染的細胞范圍較廣泛［14-15］。因此，應(yīng)用慢病毒載體介導(dǎo)的RNAi在腫瘤的分子生物學研究領(lǐng)域中，具有很大的價值。

本研究構(gòu)建了ABH2基因的慢病毒載體，為進一步研究ABH2沉默后相關(guān)的泌尿系腫瘤生物學功能的影響，提供穩(wěn)定、高效，可靠的技術(shù)平臺。

［1］Fu D，Samson LD.Direct repair of 3，N(4)-ethenocytosine by the human ALKBH2 dioxygenase is blocked by the AAG/MPG glycosylase［J］.DNA repair，2012，11(1):46-52.

［2］Chen B，Liu H，Sun X，et al.Mechanistic insight into the recognition of single-stranded and double-stranded DNA substrates by ABH2 and ABH3［J］.Mol BioSyst，2010，6(11):2143-2149.

［3］Nay SL，Lee DH，Bates SE，et al.Alkbh2 protects against lethality and mutation in primary mouse embryonic fibroblasts［J］.DNA repair，2012，11(5):502-510.

［4］Gilljam KM，F(xiàn)eyzi E，Aas PA，et al.Identification of a novel，widespread，and functionally important PCNA-binding motif［J］.J Cell Biol，2009，186(5):645-654.

［5］Gao W，Li L，Xu P，et al.Frequent down-regulation of hABH2 in gastric cancer and its involvement in growth of cancer cells［J］.J Gastroenterol Hepatol，2011，26(3):577-584.

［6］Wu S，Xu W，Liu S，et al.Down-regulation of ALKBH2 increases cisplatin sensitivity in H1299 lung cancer cells［J］.Acta Pharmacol Sin，2011，32(3):393-398.

［7］Johannessen TC，Prestegarden L，Grudic A，et al.The DNA repair protein ALKBH2 mediates temozolomide resistance in human glioblastoma cells［J］.Neuro Oncol，2013，15(3):269-278.

［8］Fujii T，Shimada K，Anai S，et al.ALKBH2，a novel AlkB homologue，contributes to human bladder cancer progression by regulating MUC1 expression［J］.Cancer Sci，2013，104(3):321.

［9］Wang Q，Lü Y，Gong Y，et al.Double-stranded Let-7 mimics，potential candidates for cancer gene therapy［J］.J Physiol Biochem，2012，68(1):107-119.

［10］胡波，吳蘇稼.微小RNA在骨肉瘤中的研究進展［J］.醫(yī)學研究生學報，2013，26(5):524-527.

［11］陳帥，李浩博，李牧，等.靶向樹突狀細胞的腫瘤疫苗OVA慢病毒載體構(gòu)建及其體外抗腫瘤效應(yīng)［J］.同濟大學學報(醫(yī)學版)，2012，33(1):13-18，23.

［12］陳偉，曹罡，董震，等.人Notch4基因RNAi慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定［J］.醫(yī)學研究生學報，2013，26(2):116-121.

［13］姚偉，李凱，徐挺，等.慢病毒介導(dǎo)的shRNA靶向干擾β-catenin神經(jīng)母細胞瘤穩(wěn)定細胞株的建立［J］.中華小兒外科雜志，2013，34(4):290-294.

［14］孫懿，曾思聰，盧光琇，等.利用慢病毒載體構(gòu)建穩(wěn)定干擾β-catenin的人胚胎干細胞系［J］.南方醫(yī)科大學學報，2012，32(8):1088-1092.

［15］陳立，鐘國強，涂榮會，等.Cx43基因shRNA慢病毒載體的構(gòu)建及其對大鼠心肌細胞Cx43基因的作用［J］.山東醫(yī)藥，2013，53(21):1-3.