覃鴻妮， 張?zhí)m蘭

(1.蘇州工業(yè)園區(qū)服務(wù)外包職業(yè)學(xué)院,江蘇蘇州 215123；2.金唯智(蘇州)生物科技有限公司，江蘇蘇州 215123)

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載體濃度和感受態(tài)對(duì)大分子載體轉(zhuǎn)化效率的影響

覃鴻妮1， 張?zhí)m蘭2

(1.蘇州工業(yè)園區(qū)服務(wù)外包職業(yè)學(xué)院,江蘇蘇州 215123；2.金唯智(蘇州)生物科技有限公司，江蘇蘇州 215123)

[目的]研究載體量和感受態(tài)對(duì)陽性克隆率的影響。[方法]利用引物拼接PCR技術(shù)，自行設(shè)計(jì)26條引物合成一個(gè)835 bp的目的基因，將該基因與約20 kb的大分子載體連接構(gòu)成重組質(zhì)粒。在1 500 ng目的基因底物量的基礎(chǔ)上，設(shè)置50、100、150、200、250、300 ng 6個(gè)梯度載體量，得到的重組反應(yīng)產(chǎn)物再轉(zhuǎn)化入Top10F′、DH5α、Stbl3、Epi400、JM108、SCSI 6種不同的感受態(tài)中， 組成36個(gè)試驗(yàn)組合。[結(jié)果] 不同載體量陽性克隆率由大到小依次為200、250、300、150、100、50 ng，200 ng的陽性克隆率最高可達(dá)75%，平均達(dá)28.5%。不同感受態(tài)細(xì)胞陽性克隆率由大到小依次為Stbl3、Top10F′、DH5α、JM108、Epi400、SCSI，Stbl3在任何載體濃度下均高于其他感受態(tài)，平均陽性克隆率為42.4%。[結(jié)論]載體量和感受態(tài)均明顯影響陽性克隆率，最佳組合為200 ng的載體分子量配合Stbl3感受態(tài)，陽性克隆率可達(dá)75%。

大分子載體；載體濃度；感受態(tài)； 轉(zhuǎn)化效率

質(zhì)粒載體是細(xì)胞中具有自主復(fù)制能力的較小DNA分子，是基因工程中重組DNA 最常見的運(yùn)載體，可以將目的DNA片段通過重組DNA技術(shù)，導(dǎo)入受體細(xì)胞中進(jìn)行繁殖和表達(dá)[1-7]。質(zhì)粒載體的DNA長度從數(shù)千堿基對(duì)到數(shù)十萬堿基對(duì)不等，相對(duì)于分子量較小的載體，大分子載體在細(xì)胞外的重組連接效率低，在感受態(tài)中轉(zhuǎn)化效率低，在宿主細(xì)胞內(nèi)的拷貝率低，傳代易產(chǎn)生目的DNA的隨機(jī)突變和缺失，表達(dá)很不穩(wěn)定[8-10]。因此需要有一個(gè)優(yōu)化的重組連接體系和一個(gè)優(yōu)化的感受態(tài)轉(zhuǎn)化體系，提高大分子載體的重組效率和轉(zhuǎn)化效率[11-13]。筆者利用引物拼接PCR(Polymerase Chain Reaction)技術(shù)，自行設(shè)計(jì)26條引物合成一個(gè)835 bp的目的基因，將該基因與約20 kb的大分子載體pCMV5連接構(gòu)成重組質(zhì)粒。在1 500 ng目的基因底物量的基礎(chǔ)上，以50、100、150、200、250、300 ng進(jìn)行6個(gè)梯度載體量的重組反應(yīng)，得到的重組反應(yīng)產(chǎn)物再轉(zhuǎn)化入Top10F′、DH5α、Stbl3、Epi400、JM108、SCSI 6種不同感受態(tài)中，交叉組成36種不同的組合，分別對(duì)這36種組合所得到的陽性克隆率進(jìn)行分析，以期得到針對(duì)大分子載體進(jìn)行重組克隆的最優(yōu)載體量和最佳感受態(tài)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料1.1.1目的基因。選定一個(gè)長835 bp的目的基因(圖1)，整體GC含量為56.17%，非高GC含量基因，且GC含量波動(dòng)較小，總體較易擴(kuò)增(圖2)。目的基因無明顯正向重復(fù)，無明顯反向重復(fù)，無明顯自身重復(fù)，引物設(shè)計(jì)無難度，PCR擴(kuò)增較易。1.1.2目標(biāo)載體。目標(biāo)載體為經(jīng)人工改造的pCMV5載體，人工加入AMP抗性，載體總長19 043 bp，屬于大分子質(zhì)粒載體(圖3)。1.2試驗(yàn)方法

1.2.1目的基因的合成。根據(jù)基因序列委托相關(guān)公司設(shè)計(jì)和合成PCR擴(kuò)增所需的26條引物(表1)，將引物稀釋到20 pmol/μL，每條引物取2 μL混勻作為引物混液，通過2輪PCR合成目的基因。1.2.2不同載體量設(shè)置。取36個(gè)分別裝有10 μL重組酶的PCR管，分成A、B、C、D、E、F 6組，每組6個(gè)，分別編號(hào)A1～A6，B1～B6，C1～C6，D1～D6，E1～E6，F(xiàn)1～F6，并按表2(以A組為例)加入不同的載體量。PCR儀50 ℃反應(yīng)1 h，-20 ℃保存。

1.2.3不同感受態(tài)設(shè)置。Top10F′感受態(tài)包括A1～A6，DH5α感受態(tài)包括B1～B5，Stb13感受態(tài)包括C1～C6，Epi400感受態(tài)包括D1～D6，JM108感受態(tài)包括E1～E6，SCSI感受態(tài)包括F1～F6。

1.2.4菌檢結(jié)果判定。36個(gè)平板，每個(gè)平板挑選24個(gè)斑進(jìn)行電泳檢測(cè)，由于電泳樣品太多，在結(jié)果中不直接顯示電泳圖，而是統(tǒng)計(jì)出每24個(gè)克隆中陽性克隆的個(gè)數(shù)除以24，得到陽性克隆率。菌檢產(chǎn)物陽性克隆的判斷方法：將電泳條帶與Ladder比對(duì)，1 149 bp即陽性克隆記為1，412 bp即空載體記為0，引物二聚體即該菌液樣品是雜斑生長記為0。

圖1　目的基因全序列Fig. 1　Sequence of objective gene

圖2　目的基因GC含量Fig. 2　GC ratio of objective gene

圖3　目標(biāo)載體結(jié)構(gòu)Fig. 3　Analysis of vector structure

序號(hào)Code序列Sequence(5'-3')堿基數(shù)Basenumber1GGGGCTGCTGACCTGGCTCATGTCCATCGATGTCAAGTACCAGATCTGGAAG522GAACGAGTTGTCCGTGAAGATGACCCCGAACTTCCAGATCTGGTACTTGACATC543TCTTCACGGACAACTCGTTCCTGTACCTGGGCTGGTACATGGTGATGTCC504CGGCAAAGAAGAAGTTGTTGTAGTGGCCCAGGAGGGACATCACCATGTACCAGC545CAACAACTTCTTCTTTGCCGCCCACCTGCTGGACATCGCCATGGGGGTCAAGA536TTGTGGGTGACAGAGGAGAGGATGGTACGCAGCGTCTTGACCCCCATGGC507CTCTCCTCTGTCACCCACAATGGGAAACAGCTGGTGATGACTGTGGGCCTCCT538AAGGCCACCACAGTGTACAGGTAGACCACGACGGCCAGGAGGCCCACAGTCATC549CTGTACACTGTGGTGGCCTTCAACTTCTTCCGCAAGTTCTACAACAAGAGCGA5310GCACTTCATGTCCGGCTCGTCCTCGTCCTCGCTCTTGTTGTAGAACTTGC5011AGCCGGACATGAAGTGCGATGACATGATGACGTGCTACCTGTTCCACATGTACGT5512TCGTCCCCGATGCCTCCGCCAGCCCGGACGCCCACGTACATGTGGAACAGGTAGC5513GGCATCGGGGACGAGATCGAGGACCCAGCGGGCGATGAATACGAGCTCTAC5114AAGAAGAAGGTGATGTCGAAGACCACCCGGTAGAGCTCGTATTCATCGCC5015GTCTTCGACATCACCTTCTTCTTCTTCGTCATTGTCATCCTGCTGGCCATC5116GGAGCTCGCCGAAGGCGGCGATAATCAGACCCTGGATGATGGCCAGCAGGATGA5417CCTTCGGCGAGCTCCGAGACCAGCAGGAGCAAGTGAAGGAAGATATGGAG5018CTGCCAATCCCGCAGATGAAGCATTTGGTCTCCATATCTTCCTTCACTTGCT5219CTGCGGGATTGGCAGTGACTACTTCGATACCACGCCGCACGGCTTCGAGACCC5320CATGTAATTGGCCAGATTGTGCTCCTCTAGCGTGTGGGTCTCGAAGCCGTG5121CACAATCTGGCCAATTACATGTTCTTCTTGATGTATCTGATAAACAAGGAC5122ACTCCTGGCCCGTGTGCTCCGTCTCGTCCTTGTTTATCAGATACATCAAGAA5223CACACGGGCCAGGAGTCCTACGTCTGGAAGATGTATCAGGAGAGGTGCTGGG5224ACTGCTTGCGGAAGCAGTCGCCGGCGGGGAAGAAGTCCCAGCACCTCTCCTGATA5525CTGCTTCCGCAAGCAGTACGAGGACCAGCTGAGCTGAGAAGCTTGCATGCCTGCA5526GTCACAGGGATGCCACCCGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT55

表2　連接體系

2　結(jié)果與分析

2.1目的基因的合成由圖4可知，目的基因的PCR產(chǎn)物在750～1 000 bp，與其理論值大小855 bp相符。

圖4　PCR產(chǎn)物電泳圖Fig. 4　Electrophoretogram of PCR products

2.2載體線性化由圖5可知，酶切后理論大小為19 043和98 bp，由于5 000 Ladder最小值為100 bp，因此,98 bp在圖中無法顯示，酶切結(jié)果與理論值相符。

2.3轉(zhuǎn)化后菌落生長情況在6種感受態(tài)中，A1～F6共36個(gè)平板，分別為加入載體量50、100、150、200、250、300 ng的菌落生長情況。由圖6～10可知，36個(gè)平板菌落均生長良好。

注：1、2、3分別為5 000 bp Ladder、酶切樣品、10 kb Ladder。Note:1,2,3 bands were 5 000 bp Ladder,enzyme digestion sample and 10 kb Ladder,respectively.圖5　載體酶切電泳圖Fig.5　Electrophoretogram of restriction enzyme digestion products

2.4菌檢陽性克隆率由表4和圖12可知，不同載體濃度對(duì)大分子載體的陽性克隆率有明顯影響，平均陽性克隆率由大到小依次為200、250、300、150、100、50 ng，在所有感受態(tài)中，200 ng的陽性克隆率均最大，最高可達(dá)75%，平均達(dá)28.5%。載體濃度低于100 ng轉(zhuǎn)化效率不到10%。

不同感受態(tài)對(duì)大分子載體的陽性克隆率有明顯影響，平均陽性克隆率由大到小依次為Stbl3、Top10F′、DH5α、JM108、Epi400、SCSI，最好的感受態(tài)是Stbl3，在任何載體濃度下均高于其他感受態(tài)，平均陽性克隆率為42.4%。JM108、Epi400、SCSI 3種感受態(tài)的平均陽性克隆率均低于10%。

圖6　Top10F′ 感受態(tài)菌落生長情況Fig. 6　The growth of colonies cultured in Top10F′

圖7　DH5α感受態(tài)菌落生長情況Fig. 7　The growth of colonies cultured in DH5α

圖8　Stbl3 感受態(tài)菌落生長情況Fig. 8　The growth of colonies cultured in Stbl3

圖9　Epi400 感受態(tài)菌落生長情況Fig. 9　The growth of colonies cultured in Epi400

圖10　JM108 感受態(tài)菌落生長情況Fig. 10　The growth of colonies cultured in JM108

圖11　Scsi感受態(tài)菌落生長情況Fig. 11　The growth of colonies cultured in Scsi

%

3　討論

對(duì)于一般的重組試驗(yàn)，載體加樣量遠(yuǎn)低于200 ng，以最為普通的puc57系列載體為例，重組反應(yīng)的載體加樣量僅30 ng左右[1，3-4]。這就導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室在遇到較大的載體時(shí)，陽性克隆率低甚至為0的現(xiàn)象。不同感受態(tài)由于基因型的不同，對(duì)不同大小、不同類型質(zhì)粒的拷貝率相差較大[14-18]。該研究選用的載體接近20 kb，較常用的3～4 kb的載體更有克隆難度。大分子載體由于具有重組效率低、轉(zhuǎn)化效率低、拷貝率低、表達(dá)不穩(wěn)定、不易提取、分離純化困難等特點(diǎn)[8-10]，國內(nèi)很多DNA服務(wù)公司都不愿意接受大分子載體的克隆，即使有相應(yīng)的服務(wù)，由于失敗率高，試驗(yàn)成本高，服務(wù)相應(yīng)的價(jià)格也很高。該研究以約20kb的載體為例，選取6個(gè)梯度的載體量和6種不同的感受態(tài)進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，載體量和感受態(tài)對(duì)陽性克隆率均有很大影響，并得到了最優(yōu)組合，為提高大分子載體的克隆效率提供參考和借鑒。

4　結(jié)論

該研究針對(duì)約20 kb的大分子載體，在1 500 ng目的基因底物量的基礎(chǔ)上，設(shè)置50、100、150、200、250、300 ng 6個(gè)梯度載體量，得到的重組反應(yīng)產(chǎn)物再轉(zhuǎn)化入Top10F′、DH5α、Stbl3、Epi400、JM108、SCSI 6種不同感受態(tài)中， 組成36個(gè)試驗(yàn)組合。結(jié)果表明，載體量和感受態(tài)均明顯影響陽性克隆率。

當(dāng)反應(yīng)體系中的載體量過低時(shí)，重組反應(yīng)無法得到足夠多的陽性克隆，篩選效率很低。當(dāng)反應(yīng)體系的載體量過高時(shí)，挑斑篩選時(shí)又會(huì)篩選到較多的空載體，影響陽性克隆率。針對(duì)20 kb左右的載體，載體的分子量在200 ng左右陽性克隆率最高。相對(duì)于其他感受態(tài)，Stbl3對(duì)于大載體的拷貝能力遠(yuǎn)高于其他感受態(tài)。最佳組合為200 ng的載體分子量配合Stbl3感受態(tài)，陽性克隆率可達(dá)75.0%。

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Effects of Vector Density and Competent Cells on the Large Vector Transformation Efficiency

QIN Hong-ni1, ZHANG Lan-lan2

(1.Suzhou Industrial Park Institute of Services Outsourcing, Suzhou, Jiangsu 215123; 2.Genewiz (Suzhou) Biotechnology Co.,Ltd.,Suzhou, Jiangsu 215123)

[Objective] To research the effects of vector quantity and competence on the positive cloning rate. [Method] With a known gene sequence but in the absence of DNA template, we artificially designed 26 primers to synthesize a target gene of 835 bpinvitrousing overlapping PCR technique. The whole experiment design with two factors and six levels (36 combinations) was applied to study the effects of the vector density and competent cells on the large vector transformation efficiency. Based on the 1 500 ng target gene, the vector density grades were designed (50, 100, 150, 200, 250,300 ng), and then the recombinant plasmids were transformed into Top10F’, DH5α, Stbl3, Epi400, JM108, SCSI. [Result] The positive cloning rates of different vector amounts from big to small were in the order of 200, 250, 300, 150, 100 and 50 ng. The maximum positive cloning rate of 200 ng reached 75%; and the average value was 28.5%. The positive cloning rates of different competent cells from big to small were in the order of stbl3, Top10F′, DH5α, JM108, Epi400 and SCSI. Stbl3 was higher than other competent cells under any vector density. And its average positive cloning rate was 42.4%.[Conclusion] Both the vector density and competent cells have significant effects on the large vector transformation efficiency. The optimal combination is C4 with 200 ng vector density and Stbl3, the positive cloning rate of which could reach 75%.

MacromoIecular vector; Vector density; Competent cells; Transformation efficiency

A

0517-6611(2016)17-181-06

蘇州工業(yè)園區(qū)服務(wù)外包職業(yè)學(xué)院教研教改研究課題(JG-201601)。

覃鴻妮(1983- )，女，湖北長陽人，講師，博士，從事分子生物學(xué)研究。

2016-05-06

Q 81