任艷娜 才蕾 武建偉 錢偉 張榮華 王繼華 唐時幸

（廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司，廣州 510663）

重組肌紅蛋白的原核表達(dá)、純化及其凍干質(zhì)控品的制備

任艷娜 才蕾 武建偉 錢偉 張榮華 王繼華 唐時幸

（廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司，廣州 510663）

旨在為市場提供一種廉價、穩(wěn)定、特異性強、靈敏度高的肌紅蛋白質(zhì)控品；將密碼子優(yōu)化后的肌紅蛋白序列通過兩步法進行化學(xué)合成，并連接到pET-28a表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3），用0.5 mmol/L IPTG 37℃誘導(dǎo)表達(dá)；目的蛋白經(jīng)Ni Sepharose 6 Fast Flow（FF）親和層析進行純化后，對其特異性進行檢測，并研究蛋白稀釋液的配方和優(yōu)化凍干工藝，最后對凍干質(zhì)控品的穩(wěn)定性進行檢測；結(jié)果顯示目的蛋白分子量大小為20 kD左右，具有較強的特異性。蛋白凍干后具有很好的形態(tài)，37℃可以穩(wěn)定保存10 d；25℃、4℃可以穩(wěn)定保存4個月以上。該蛋白的凍干制品成本低、穩(wěn)定性好、特異性強、靈敏度高，可用于定性定量肌紅蛋白檢測試劑盒的質(zhì)控品。

重組肌紅蛋白 原核表達(dá) 純化 凍干 質(zhì)控品

急性心肌梗死（Acute myocardiac infraction，AMI）是嚴(yán)重危害人類健康的常見疾病之一。近年來，在我國該病的發(fā)病率呈明顯升高的趨勢。肌紅蛋白（Myoglobin，Myo）是AMI發(fā)生時最早升高的心肌損傷標(biāo)志物之一，在發(fā)病2 h內(nèi)血清中Myo的含量開始增加，6-9 h達(dá)到峰值。1975年，Kagen等［1］首次提出血清Myo的測定可用于急性心肌梗塞的診斷，檢測病人的Myo水平可以快速確診并及時治療，從而降低病死率［2］。此外，Myo是判斷急性心肌梗塞患者有無再灌注的最好的無創(chuàng)指標(biāo)之一。溶栓治療開始后90 min，如果肌紅蛋白升高近4倍，則可比較準(zhǔn)確判定梗死冠脈已完全開通。因此，肌紅蛋白的檢測對急性心肌梗死的診斷、預(yù)測心肌梗塞面積、指導(dǎo)溶栓治療及其預(yù)后具有重要意義［3，4］。

肌紅蛋白存在于哺乳動物肌肉中，具有在肌細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運和貯存氧的功能［5］，由一條多肽鏈構(gòu)成，有153個氨基酸殘基和一個血紅素輔基，分子量為17.8 kD［6，7］。人體心肌、骨骼肌內(nèi)含有大量肌紅蛋白，正常人的血液中很少，主要由腎臟代謝并排泄。肌紅蛋白增高見于急性心肌梗死早期、急性肌損傷、肌營養(yǎng)不良、肌萎縮、多發(fā)性肌炎、急性或慢性腎功能衰竭、嚴(yán)重充血性心力衰竭和長期休克等［8-11］。

市場上的肌紅蛋白質(zhì)控品均為進口血源型人肌紅蛋白，來源受限，價格昂貴，購買渠道難以保證。血源型人Myo不穩(wěn)定，極易降解，嚴(yán)重限制肌紅蛋白診斷試劑的發(fā)展［12］。雖然國內(nèi)外通過基因工程手段表達(dá)重組肌紅蛋白的報道很多，但所表達(dá)的Myo穩(wěn)定性有待進一步提高，其表達(dá)條件仍需優(yōu)化［6，13］。

1 材料與方法

1.1 材料

DNA ExTaq酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒、DNA回收試劑盒購自Promega公司；小量質(zhì)粒提取試劑盒購自北京奇華盛；中分子量蛋白Marker、預(yù)染蛋白Marker購自Fermentas公司；甘氨酸、十二烷基磺酸鈉（SDS）、甲雙叉丙烯酰胺、考馬斯亮蘭、丙烯酰胺、IPTG購自Sigma公司；質(zhì)粒pET-28a、大腸桿菌E.coliBL21（DE3）、大腸桿菌E.coliDH5α為本實驗室保存；目的基因由Genewiz公司合成；肌紅蛋白抗體購自Hytest公司；辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；CHRIST ALPHA1-2型冷凍干燥機購自Martin Christ公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 表達(dá)載體pET28a-Myo的構(gòu)建 通過NCBI獲取人源肌紅蛋白（Myo）的編碼序列后，根據(jù)大腸桿菌偏愛性，運用密碼子優(yōu)化工具h(yuǎn)ttp：//www.jcat. de/Start.jsp對序列進行優(yōu)化；并利用化學(xué)合成的技術(shù)手段獲得目的基因片段。由Genewiz公司合成的優(yōu)化密碼子基因片段經(jīng)BamH I和Hind III雙酶切，酶切產(chǎn)物純化，取3 μL與經(jīng)同樣限制性內(nèi)切酶雙酶切后的質(zhì)粒pET-28a，16℃連接過夜。熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌株E.coliDH5α，涂布于含50 μg/mL Kan+的LB平板，挑取陽性克隆經(jīng)菌落PCR和酶切初步鑒定后，送Invitrogen公司測序。鑒定正確后得到重組表達(dá)載體命名為pET28a-Myo。

1.2.2 Myo的誘導(dǎo)表達(dá) 將測序正確并經(jīng)過酶切鑒定的陽性重組質(zhì)粒用熱激發(fā)轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，復(fù)蘇后涂布于Kan+濃度為50 μg/mL的LB瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)16 h。挑取4個單菌落接種至含50 μg/mL Kan+的5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min培養(yǎng)過夜。次日，以1∶100比例轉(zhuǎn)接于5 mL新鮮含50 μg/mL Kan+的LB培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min培養(yǎng)至OD600≈0.8時加入IPTG至終濃度0.5 mmol/L，37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4-5 h。SDS-PAGE檢測4株菌重組蛋白的表達(dá)情況，并篩選高效表達(dá)的重組菌株。挑選高效表達(dá)菌株進行表達(dá)條件優(yōu)化和擴大培養(yǎng)。

1.2.3 Myo的純化收集 擴大培養(yǎng)的菌體，在冰浴條件下超聲破碎（超聲條件為：超聲5 s，間隔12 s，共超聲15 min），12 000 r/min 4℃離心15 min，上清經(jīng)Ni Sepharose 6 Fast Flow（FF）親和層析純化。上樣緩沖液為20 mmol/L PB，5 mmol/L咪唑pH7.4；平衡緩沖液為20 mmol/L PB，250 mmol/L咪唑 pH7.4；洗脫緩沖液為20 mmol/L PB，500 mmol/L咪唑pH7.4。

1.2.4 Myo特異性檢測 為了檢測Myo的特異性和靈敏度，實驗室用購自Hytest的肌紅蛋白抗體1 000倍稀釋后做一抗，進行Western blot檢測。

在《悼亡》詩中，商景蘭對于女性的家庭責(zé)任感表達(dá)了自己的見解。另一首具有重要意義的長詩《五十自敘》中，商景蘭完成了對于自我的觀照，第一次在詩中表明了立身處世的方向。五十而知天命，意味著個人進入了豐收的年紀(jì)，也是作者回顧過往，反省一生之時：

1.2.5 Myo的活性檢測 將原濃度重組肌紅蛋白分別稀釋若干倍后（濃度H、濃度M、濃度L），用廣州萬孚生物技術(shù)公司研發(fā)的肌紅蛋白檢測試劑盒（熒光定量免疫層析法）對該蛋白的活性進行檢測，從而確定適當(dāng)?shù)南♂尡壤M行后續(xù)試驗。

1.2.6 Myo凍干工藝的篩選 為了增加蛋白的穩(wěn)定性，篩選蛋白的凍干工藝。分別用小牛血清和健康人血漿作為稀釋液，加入賦形劑和保護劑后，分別將蛋白稀釋上述確定的3個濃度（濃度H、濃度M、濃度L）進行凍干，并通過凍干外觀、活性收率和37℃ 1周破壞試驗（在37℃恒溫培養(yǎng)箱中，每天取出一支進行活性檢測）篩選最佳凍干工藝。

1.2.7 Myo凍干樣品穩(wěn)定性檢測 為進一步驗證凍干工藝，評價該質(zhì)控品的穩(wěn)定性，同一批凍干樣品分別于25℃、4℃放置4個月，檢測凍干蛋白的實時穩(wěn)定性。此外，通過37℃加速破壞試驗預(yù)測凍干蛋白的長期穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)載體的鑒定

將重組質(zhì)粒pET28a-Myo送到Invitrogen公司進行測序，結(jié)果（圖1）表明連接正確，與預(yù)期結(jié)果一致。同時對提取的重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，電泳結(jié)果可觀察到一條500 bp左右的條帶，說明目的片段已成功插入到表達(dá)載體pET-28a中（圖2）。

2.2 Myo的誘導(dǎo)表達(dá)及純化結(jié)果

按正交試驗進行表達(dá)因素篩選，包括溫度、誘導(dǎo)劑量、誘導(dǎo)時間、宿主菌OD值以及培養(yǎng)基pH值等。結(jié)果（圖3）顯示，以BL21（DE3）為宿主菌體，在37℃，OD600≈0.8時，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，37℃誘導(dǎo)4 h表達(dá)量最大。菌液裂解后，用Ni Sepharose 6 Fast Flow（FF）親和層析進行純化，上樣緩沖液為20 mmol/L PB，5 mmol/L咪唑pH7.4；平衡緩沖液為20 mmol/L PB，250 mmol/L咪唑 pH7.4；洗脫緩沖液為20 mmol/L PB，500 mmol/L咪唑 pH7.4。洗脫得到的目的蛋白純度大于95%，分子量大小正確。

2.3 Myo特異性檢測結(jié)果

用購自Hytest的抗肌紅蛋白抗體為一抗，以辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG為二抗進行Western blot檢測該重組蛋白的特異性。結(jié)果（圖4）表明，表達(dá)的重組Myo可與特異性的抗肌紅蛋白抗體結(jié)合，特異性良好。

2.4 Myo活性檢測結(jié)果

將重組肌紅蛋白原液若干倍稀釋以后，用廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)的肌紅蛋白（Myo）定量檢測試劑對稀釋的3個不同濃度（濃度H、濃度M、濃度L）重組肌紅蛋白活性進行檢測，每個濃度平行檢測10支，CV值均小于10%（表1）。

2.5 Myo凍干工藝的優(yōu)化

為保證蛋白運輸保存的穩(wěn)定性，對凍干工藝進行了初步探索。最終確定小牛血清中加3%乳糖、0.04%人血清白蛋白、20 mmol/L NaCl作為蛋白稀釋液。將蛋白稀釋到適當(dāng)濃度，-80℃預(yù)凍4 h后，真空凍干12 h，取出加蓋密封保存，其外觀呈白色疏松餅狀。

在此凍干方案下，活性收率（溶液凍干后活性/溶液凍干前活性）可達(dá)85%以上；37℃穩(wěn)定保存10 d，凍干樣品的外觀仍為白色疏松餅狀，活性在±25%參考范圍以內(nèi)。

2.6 Myo凍干樣品穩(wěn)定性試驗結(jié)果

用廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)的肌紅蛋白檢測試劑盒（熒光定量免疫層析法）對同一凍干批次的3個不同濃度（H、M、L）的凍干樣品的穩(wěn)定性進行跟蹤。研究發(fā)現(xiàn)，凍干樣品在25℃、4℃可以穩(wěn)定保存4個月以上（表2，表3）；37℃可以穩(wěn)定保存10 d以上（表4），所測得的蛋白濃度均在起始濃度±25%參考范圍之內(nèi)。

3 討論

目前，肌紅蛋白測定方法很多，其敏感性和特異性不同。有放射免疫方法（RIA）、高效液相色譜法（HPLC）、滴金免疫測定法（DIGFA）、速率散射濁度法（RAN）、酶聯(lián)免疫方法（ELISA）、熒光免疫法和膠乳凝集試驗等［14-17］，而以上各檢測方法的建立，首先都必須獲得優(yōu)質(zhì)的肌紅蛋白抗原。但目前人源肌紅蛋白來源受限，重組肌紅蛋白穩(wěn)定性差，已成為制約肌紅蛋白檢測技術(shù)發(fā)展的巨大障礙［6，7，13］。張欣等［13］發(fā)表了關(guān)于基因工程重組肌紅蛋白的表達(dá)的相關(guān)研究，其純度、特異性等方面能滿足要求，但穩(wěn)定性僅做了重組抗原在-20℃環(huán)境中保存3個月，并沒有做長途運輸相關(guān)的4℃和25℃，及使用時37℃穩(wěn)定性研究。安星蘭［5］和崔大偉等［6］也發(fā)表了關(guān)于重組肌紅蛋白的研究，但該研究表達(dá)的重組肌紅蛋白主要用于下一步的免疫獲得單克隆抗體，并未對穩(wěn)定性及抗原反應(yīng)靈敏度做任何研究。

本研究在NCBI查詢得到Myo氨基酸序列的基礎(chǔ)上，對Myo密碼子經(jīng)過優(yōu)化得到大腸桿菌慣用的密碼子序列，參照Young等［18］提出的兩步法進行全基因合成的方法得到Myo基因序列。雙酶切后與pET-28a連接，通過熱激法將重組質(zhì)粒pET-28a-Myo轉(zhuǎn)入到BL21（DE3）后進行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)Western blot及商品化檢測試劑盒檢測，該重組蛋白活性很高。大量發(fā)酵后，進行Ni Sepharose 6 Fast Flow（FF）親和層析純化，其純度大于95%，滿足生產(chǎn)濃度及純度的需求。并根據(jù)實際需求研究了肌紅蛋白最佳保護劑和凍干工藝，凍干樣品37℃穩(wěn)定性、25℃穩(wěn)定性、4℃穩(wěn)定性，以確保該蛋白凍干制品在常規(guī)儲存及運輸條件下的穩(wěn)定性。

真空干燥，又名解析干燥，是一種將物料置于負(fù)壓條件下，并適當(dāng)通過加熱達(dá)到負(fù)壓狀態(tài)下的沸點來干燥物料的干燥方式，是目前用于微生物、蛋白質(zhì)等生物制品干燥保存的一種最常用、最有效的方法［19］。目前，常用的蛋白凍干保護劑包括糖類及多元醇、聚合物、無水溶劑、表面活性劑、氨基酸以及某些鹽和胺［20］。在低溫下干燥，各有效成分活性喪失少；復(fù)溶性好，能很快地吸水還原成干燥前的鮮活狀態(tài)；脫水徹底，保存期長，儲存運輸、銷售方便。但是，在真空冷凍干燥過程中，冷凍和干燥不可避免地會造成部分蛋白的損傷及降解［21，22］。為了減少凍干過程中Myo活性成分的損失，根據(jù)Myo本身的結(jié)構(gòu)，通過37℃加速破壞試驗對Myo的保護劑、賦形劑、緩沖液進行篩選。同時對凍干壓強、濕度、凍干時間、儀器最適凍干量等進行優(yōu)化，初步確定Myo的最佳凍干工藝。

為了使該肌紅蛋白凍干品穩(wěn)定性和凍干品復(fù)溶后穩(wěn)定性達(dá)到最佳，在初步凍干工藝的基礎(chǔ)上對保護劑、賦形劑、鹽濃度進行深入研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，保護劑人血清白蛋白濃度為0.04%時達(dá)到最佳凍干效果，降低人血清白蛋白的濃度會導(dǎo)致活性收率降低，提高人血清白蛋白濃度對活性收率沒有明顯影響，但成本明顯增加；賦形劑乳糖的濃度為3%時外觀形態(tài)最好，提高乳糖濃度對活性和外觀無明顯影響，但降低乳糖濃度凍干制品嚴(yán)重變形，呈玻璃狀；鹽濃度對肌紅蛋白穩(wěn)定性的影響比較大，隨著NaCl濃度的升高（0-100 mmol/L），凍干制品的37℃穩(wěn)定性逐漸降低，肌紅蛋白凍干制品的復(fù)溶穩(wěn)定性逐漸提高。隨著NaCl濃度的降低（100-0 mmol/L），肌紅蛋白凍干制品的37℃穩(wěn)定性逐漸提高，凍干制品復(fù)溶穩(wěn)定性逐漸降低。綜合考慮各種因素，最終確定凍干方案（3%乳糖、0.04%人血清白蛋白、20 mmol/L NaCl）。按照此凍干工藝，凍干樣品在25℃、4℃和-20℃可以穩(wěn)定保存4個月以上；在37℃可以穩(wěn)定保存10 d以上；復(fù)溶后在4℃和25℃分別能穩(wěn)定保存6 d。

4 結(jié)論

本研究將人源肌紅蛋白（Myo）的基因片段連接到表達(dá)載體pET-28a、轉(zhuǎn)入BL21（DE3）后，37℃誘導(dǎo)表達(dá)得到活性高、特異性好的目的蛋白Myo。將純化后的Myo按一定比例稀釋后，加入賦形劑乳糖3%、保護劑人血清白蛋白0.04%、增加蛋白水化程度的中性鹽NaCl 20 mmol/L，-80℃預(yù)凍4 h后，真空凍干12 h得到外觀呈白色疏松餅狀凍干制品。該凍干制品在25℃、4℃和-20℃可以穩(wěn)定保存4個月以上；在37℃可以穩(wěn)定保存10 d以上；復(fù)溶后在4℃和25℃分別能穩(wěn)定保存6 d。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

The Expression and Purification of Recombinant Myoglobin and Preparation of Its Quality Control Samples

Ren Yanna Cai Lei Wu Jianwei Qian Wei Zhang Ronghua Wang Jihua Tang Shixing
（Guangzhou Wondfo Biotech Co.，Ltd，Guangzhou 510663）

We intended to provide a cheap, stable, highly specific and sensitive lyophilized protein as quality control for diagnositic kits. The myoglobin gene code was optimized and two-step methods were used in this study for the synthesis of myoglobin gene. The DNA fragment of myoglobin was inserted into pET-28a vector forming a recombination plasmid, then, transformed into BL21（DE3）bacteria. Protein expression was induced by 0.5 mmol/L IPTG and purified by Ni Sepharose 6 Fast Flow（FF）. After confirming its specificity, we studied the stability of the lyophilized protein at different storage temperatures（37℃, 25℃, 4℃）. Results showed that the target protein is approximately 20 kD with high specificity, good morphology and stability after freeze-drying under the optimized conditions and protein diluting solution. The lyophilized myoglobin protein with low cost, good stability, high specificity and sensitivity, canbe used as quality control for both qualitative and quantitative myoglobin testing kits.

Recombinant Myoglobin Prokaryotic expression Purification Lyophilized Quality control samples

2013-12-18

任艷娜，女，碩士研究生，研究方向：獸醫(yī)藥理學(xué)與毒理學(xué)；E-mail：yanna052267213@163.com

唐時幸，男，博士，研究方向：生物醫(yī)學(xué)；E-mail：tang.shixing@wondfo.com.cn