楊玉路王蕾陳晟吳敬

（1.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，無錫 214122；2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，無錫 214122）

重組β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)β-環(huán)糊精的工藝條件優(yōu)化

楊玉路1，2王蕾1，2陳晟1，2吳敬1，2

（1.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，無錫 214122；2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，無錫 214122）

將來自于Bacillus circulans251的β-CGTase編碼基因克隆到表達(dá)載體pET-20b（+），轉(zhuǎn)化Escherichia coliBL21（DE3）。經(jīng)酶活檢測培養(yǎng)基上清中的β-CGTase酶活為20 U/mL。對酶轉(zhuǎn)化淀粉生成β-環(huán)糊精的反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，當(dāng)?shù)孜锺R鈴薯淀粉濃度15%，反應(yīng)初始pH5.5，溫度30℃，加酶量10 U/g干淀粉，環(huán)己烷濃度2.5%-5%（V/V），轉(zhuǎn)化周期24 h，β-環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高值75.3%，是國內(nèi)外報道的酶法生產(chǎn)β-環(huán)糊精的最高水平。

環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶 β-環(huán)糊精 酶轉(zhuǎn)化 重組表達(dá) 淀粉

環(huán)糊精（cyclodextrin，簡稱CD），是由D-吡喃葡萄糖單元通過α-1，4糖苷鍵連接而成的環(huán)狀低聚糖的總稱，常見的環(huán)糊精由6、7和8個葡萄糖單元組成，分別稱為α-、β-和γ-CD［1-4］。由于CD分子具有內(nèi)部疏水、外部親水的特性，使其能容納與其大小和形狀合適的疏水性分子或基團(tuán)而形成包合物，改變這些被包埋物質(zhì)的溶解度、揮發(fā)性及化學(xué)反應(yīng)性能等理化性質(zhì)，因而在食品［5］、醫(yī)藥、化學(xué)、農(nóng)業(yè)、分析化學(xué)以及環(huán)保［6］等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。β-環(huán)糊精因其溶解度低，較易沉淀，在3種環(huán)糊精中最容易實現(xiàn)大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)。

環(huán)糊精主要是由環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（cyclodextrin glycosyltransferase，CGTase，EC.2.4.19）作用于淀粉、糖原、麥芽寡聚糖等葡萄糖聚合物［7-10］等底物，通過環(huán)化反應(yīng)而生成。大多數(shù)情況下，CGTases進(jìn)行環(huán)化反應(yīng)可以同時產(chǎn)生α-［11］、β-［12-15］和γ-環(huán)糊精［16，17］，但通過添加不同的有機(jī)溶劑可以選擇性沉淀特定的環(huán)糊精，從而得到高純度的特定環(huán)糊精，如添加一定濃度的環(huán)己烷、甲苯、叔丁醇可以提高β-環(huán)糊精的比例和轉(zhuǎn)化率［18，19］。

本研究將來自于Bacillus circulans251［20-22］的β-CGTase基因（βcgt）連接到表達(dá)載體pET-20b（+），獲得重組質(zhì)粒pET-20b（+）-βcgt，將其轉(zhuǎn)化Escherichia coliBL21（DE3）［23］并進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，測定培養(yǎng)基上清中的β-CGTase酶活力，旨在對酶轉(zhuǎn)化工藝進(jìn)行研究，獲得高效生產(chǎn)β-環(huán)糊精的方法，開發(fā)β-環(huán)糊精用酶。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 大腸桿菌（Escherichia coli）JM109、大腸桿菌BL21（DE3）、表達(dá)載體pET-20b（+），為本實驗室保藏；大腸桿菌BL21（DE3）含pET-20b（+）空載體為對照菌種，由本實驗室構(gòu)建及保藏；目的基因βcgt為上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，氨芐青霉素0.1，pH7.0。TB培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨12，酵母粉24，甘油5，K2HPO42.34，KH2PO416.43，氨芐青霉素0.1，甘氨酸7.5，pH7.0。

1.1.3 試劑 質(zhì)粒小量提取試劑盒、氨芐青霉素購自上海生工生物工程公司；膠回收試劑盒、NcoI、Hind III、T4連接酶購自TaKaRa公司；α-，β-，γ-環(huán)糊精標(biāo)樣購自Sigma公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.4 主要儀器 凝膠成像儀，蛋白電泳儀購自美國Bio-Rad公司；DYY-6C型電泳儀購自北京六一儀器廠；高效液相色譜儀購自Agilent公司；細(xì)胞破碎儀購自北京科實興業(yè)科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工程菌的構(gòu)建 將攜帶目的基因βcgt的質(zhì)粒pGE-βcgt經(jīng)NcoⅠ和Hind Ⅲ雙酶切后，將目的基因片段割膠回收，采用T4連接酶將目的基因和同樣酶切處理的表達(dá)載體pET-20b（+）連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞中，在平板培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜后，挑取單克隆液體培養(yǎng)，然后提取質(zhì)粒得到重組表達(dá)載體pET-20b-βcgt。將表達(dá)載體pET-20b-βcgt進(jìn)行雙酶切驗證，驗證正確后轉(zhuǎn)入E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，涂布LB平板培養(yǎng)基，挑選單克隆，培養(yǎng)過夜，-80℃甘油管保存。

1.2.2 搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)β-CGTase 種子培養(yǎng)：從-80℃保存的甘油管接一定量的菌液至LB培養(yǎng)基，37℃、200 r/min，培養(yǎng)8 h。

搖瓶發(fā)酵：將種子液以5%的接種量接入TB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至OD600約為1.5時，加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG同時降溫至25℃進(jìn)行重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，轉(zhuǎn)速200 r/min，培養(yǎng)60 h。離心收集上清，即為β-CGTase粗酶液。

超聲破壁：用25 mmol/L，pH5.5的Na2HPO4-KH2PO4緩沖液將細(xì)胞沉淀復(fù)溶到OD600為5，用細(xì)胞破碎儀進(jìn)行破壁處理，離心收集破壁上清檢驗β-CGTase胞內(nèi)表達(dá)情況。

1.2.3 β-CGTase環(huán)化活性測定 利用環(huán)糊精可以包埋酚酞的性質(zhì)，采用比色法測定酶活［10，22，24］。用25 mmol/L，pH5.5的Na2HPO4-KH2PO4緩沖液配制1%的可溶性淀粉作為底物，取2 mL底物溶液，50℃孵育10 min，加入0.1 mL適當(dāng)稀釋的粗酶液，以緩沖液為空白對照，精確反應(yīng)10 min，加入0.2 mL 0.6 mol/L HCl終止反應(yīng)，然后加入0.5 mL 0.6 mol/L Na2CO3調(diào)pH至10.0，25℃條件下，加入0.2 mL 1.2 mmol/L酚酞溶液顯色15 min，在550 nm處測定吸光值。一個酶活單位（U）定義為在上述測定條件下1 min內(nèi)生成1 μm β-環(huán)糊精所需要的酶量。

1.2.4 β-CGTase酶學(xué)性質(zhì)檢測 最適溫度和溫度穩(wěn)定性：采用25 mmol/L檸檬酸-Na2HPO4（pH5.5）緩沖液，在30-75℃范圍內(nèi)每隔5℃測定β-CGTase酶活，確定酶的最適溫度，將酶活最高的計為100%，計算各溫度下的相對酶活；在25 mmol/L檸檬酸-Na2HPO4（pH5.5）緩沖液中，將酶置于上述溫度下保溫6 h，測定殘留酶活以確定酶的熱穩(wěn)定性。

最適pH和pH穩(wěn)定性：在50℃，pH4.0-8.0范圍內(nèi)每隔0.5個pH測定β-CGTase酶活，確定酶的最適pH，以酶活最高的計為100%，計算其它pH條件下酶的相對酶活；將酶在上述pH緩沖液中于4℃放置12 h，測定殘留酶活以確定酶的pH穩(wěn)定性。

1.2.5 β-環(huán)糊精的生產(chǎn)以及含量測定 用0.2 mol/L，pH5.5的醋酸鈉-醋酸緩沖溶液配制15%（W/V）淀粉溶液，沸水浴中加熱糊化10 min，冷卻至反應(yīng)溫度后添加一定量的β-CGTase和有機(jī)溶劑，充分混勻后在30℃、150 r/min水浴搖床中反應(yīng)24 h。轉(zhuǎn)化后的液體加熱滅酶后，蒸餾除去有機(jī)溶劑，蒸餾液與95%乙醇1∶1混勻，靜置2 h，12 000 r/min離心20 min，除去未轉(zhuǎn)化的糊精，取10 μL上機(jī)分析。采用HPLC進(jìn)行產(chǎn)物分析的色譜條件是：Agilent1200 HPLC色譜儀，Agilent自動進(jìn)樣器，色譜柱250×4.6 mm 5 μm Hypersil APS-2 Column，Agilent示差檢測器；流動相為乙腈∶水（65∶35），流速0.8 mL/min；柱溫40℃。轉(zhuǎn)化率定義為生成的β-環(huán)糊精的質(zhì)量比上底物的質(zhì)量乘以100%。

1.2.6 β-環(huán)糊精的提取及分析 轉(zhuǎn)化之后的反應(yīng)液經(jīng)加熱滅酶后進(jìn)行水蒸氣蒸餾，除去其中的有機(jī)溶劑，水蒸氣蒸餾液經(jīng)過濾以后加熱蒸發(fā)，濃縮至飽和狀態(tài)，晶體析出，采用冷凍干燥法獲得β-環(huán)糊精的粉末，然后進(jìn)行紅外光譜鑒定分析。

2 結(jié)果

2.1 高產(chǎn)β-CGTase重組菌的構(gòu)建

2.1.1 重組質(zhì)粒pET-20b-βcgt 的構(gòu)建 攜帶有目的基因的質(zhì)粒pGE-βcgt和本實驗室質(zhì)粒pET-20b（+）分別經(jīng)NcoⅠ和Hind Ⅲ雙酶切后，將目的基因片段和pET-20b（+）膠回收、連接，轉(zhuǎn)入E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞，抽提質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)NcoⅠ和HindⅢ雙酶切驗證，結(jié)果（圖1）顯示，在約3 700 bp和2 000 bp處有條帶，分別和載體及基因大小一致，表明重組表達(dá)載體pET-20b-βcgt構(gòu)建成功。

2.1.2 重組菌E.coliBL21（DE3）/ pET-20b-βcgt的構(gòu)建和培養(yǎng) 表達(dá)載體pET-20b-βcgt轉(zhuǎn)化進(jìn)入E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，在LB平板培養(yǎng)基培養(yǎng)，挑取單菌落接種至LB培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，轉(zhuǎn)接TB培養(yǎng)基，經(jīng)0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，發(fā)酵60 h后離心取上清，得到粗酶液，經(jīng)檢測，β-CGTase胞外酶活為20 U/mL，破壁上清的酶活僅為1.38 U/mL，表明90%以上的β-CGTase都分泌到胞外，而攜帶空載體的對照菌未檢測到酶活。SDS-PAGE電泳條帶（圖2）顯示，試驗菌株發(fā)酵上清液蛋白（泳道1）顯示大約在70 kD處出現(xiàn)一條蛋白條帶，與理論β-CGTase分子量相符，而對照菌株發(fā)酵上清液蛋白（泳道2）處無條帶，表明β-CGTase在E.coliBL21（DE3）中成功表達(dá)。

2.2 重組β-CGTase酶學(xué)性質(zhì)初步研究

2.2.1 溫度對β-CGTase活性和穩(wěn)定性的影響 溫度對酶活影響（圖3）顯示，重組β-CGTase的最適溫度為60℃，在50-65℃酶活可保持在85%以上，當(dāng)溫度升高到70℃時，酶活下降至原來的50%。熱穩(wěn)定性結(jié)果（圖4）顯示，在不同溫度下保溫6 h以后，隨著溫度升高，殘留酶活越來越低，在30℃和40℃時，殘留酶活高達(dá)90%，穩(wěn)定性良好，但是高于50℃，殘留酶活降至30%以下，表明該酶對高溫的耐受性不好。

2.2.2 pH對β-CGTase活性和穩(wěn)定性的影響 pH對β-CGTase活性影響結(jié)果（圖5）顯示，重組β-CGTase的最適pH值為5.5，pH在5.5-7.0之間酶活可保持在80%以上，高于7.0和低于5.5酶活都降至60%以下。pH對酶活穩(wěn)定性（圖6）顯示，經(jīng)過12 h保溫后，pH在5.5-7.0之間殘留酶活都保持在80%以上，表明該酶的活性在此pH范圍內(nèi)穩(wěn)定性良好；而在其他pH條件下，殘留酶活降至30%以下，表明該酶在過酸或過堿條件下耐受性不好。

2.3 重組β-CGTase制備β-環(huán)糊精轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化

2.3.1 反應(yīng)溫度對酶轉(zhuǎn)化的影響 以15%馬鈴薯淀粉為底物，加酶量為每克干淀粉5 U，5%（V/V）環(huán)己烷，分別在30、40、50和60℃水浴搖床中轉(zhuǎn)化24 h，蒸餾除去環(huán)己烷，HPLC檢測β-環(huán)糊精生成量。如表1所示，低溫條件下，副產(chǎn)物比率明顯下降，轉(zhuǎn)化率也明顯上升，最高值為71.8%。這是因為低溫有利于酶的穩(wěn)定及β-環(huán)糊精的特異性包埋沉淀，而高溫時酶的熱穩(wěn)定性較差，反應(yīng)過程中酶已失活，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率較低，所以30℃為最佳轉(zhuǎn)化溫度。以下試驗都將溫度定為30℃。

2.3.2 有機(jī)試劑及濃度對酶轉(zhuǎn)化的影響 以15%馬鈴薯淀粉為底物，加酶量為每克干淀粉5 U，分別加入2.5%、5%、7.5%和10%（V/V）環(huán)己烷、甲苯以及無水乙醇，置于30℃水浴搖床，轉(zhuǎn)化24 h，蒸餾除去有機(jī)試劑，HPLC檢測β-環(huán)糊精生成量。如表2所示，環(huán)己烷和甲苯可以顯著提高β-環(huán)糊精的比例，分別比不加有機(jī)溶劑的轉(zhuǎn)化率提高了40.4%和39.3%，并且從產(chǎn)物的特異性方面來看，環(huán)己烷比甲苯更有利于β-環(huán)糊精的生產(chǎn)；而乙醇對β-環(huán)糊精產(chǎn)量的提高不是很明顯，雖然總轉(zhuǎn)化率有所提升，但是特異性效果較差。對于環(huán)己烷和甲苯，加入不同的濃度對轉(zhuǎn)化率影響不大，而環(huán)己烷的毒性和沸點都低于甲苯，所以應(yīng)該選擇2.5%-5%的環(huán)己烷。

2.3.3 底物種類對酶轉(zhuǎn)化的影響 分別配制15%的馬鈴薯、木薯、蠟質(zhì)玉米淀粉，加酶量為每克干淀粉5 U，5%（V/V）環(huán)己烷，置于30℃水浴搖床，轉(zhuǎn)化24 h，蒸餾除去環(huán)己烷，HPLC檢測β-環(huán)糊精生成量。如表3所示，馬鈴薯淀粉作為底物時，環(huán)糊精總轉(zhuǎn)化率為71.9%，比蠟質(zhì)玉米淀粉和木薯淀粉分別提高了10%和10.7%，而生產(chǎn)β-環(huán)糊精的特異性也稍高于另外兩種淀粉。結(jié)果表明，馬鈴薯淀粉作為底物最合適。

2.3.4 馬鈴薯淀粉濃度對酶轉(zhuǎn)化的影響 分別配制5%、10%、15%和20%馬鈴薯淀粉，加酶量為每克干淀粉5 U，5%（V/V）環(huán)己烷，置于30℃水浴搖床，轉(zhuǎn)化24 h，蒸餾除去環(huán)己烷，HPLC檢測β-環(huán)糊精生成量。如表4所示，隨著馬鈴薯淀粉濃度的增大，環(huán)糊精總轉(zhuǎn)化率雖然越來越低，但是β-環(huán)糊精在產(chǎn)物中所占比例越來越高。綜合考慮產(chǎn)品中β-環(huán)糊精比例和產(chǎn)率，本著節(jié)省資源，降低工業(yè)成本的原則，應(yīng)選擇15%-20%濃度為宜。

2.3.5 反應(yīng)時間對酶轉(zhuǎn)化的影響 以15%馬鈴薯淀粉為底物，加酶量為每克干淀粉5 U，5%（V/V）環(huán)己烷，置于30℃水浴搖床，定時取樣，檢測β-環(huán)糊精生成量。如表5所示，隨著轉(zhuǎn)化時間的延長，β-環(huán)糊精的特異性有所提高，在18 h之后轉(zhuǎn)化率提高的幅度不大，總轉(zhuǎn)化率在24 h時達(dá)最高值，為71.1%，所以可將轉(zhuǎn)化時間定為24 h。

2.3.6 反應(yīng)初始pH對酶轉(zhuǎn)化的影響 分別用pH4.0-7.0的醋酸緩沖液配制15%馬鈴薯淀粉，加酶量為每克干淀粉5 U，5%（V/V）環(huán)己烷，置于30℃水浴搖床，轉(zhuǎn)化24 h，蒸餾除去環(huán)己烷，HPLC檢測β-環(huán)糊精生成量。如表6所示，當(dāng)初始pH為5.5時，環(huán)糊精總轉(zhuǎn)化率最高，為72.5%。但初始pH在5.0-7.0 內(nèi)對環(huán)糊精的特異性和轉(zhuǎn)化率影響不是很大，可能是因為酶在上述pH范圍內(nèi)比較穩(wěn)定，能夠保持較高的活性。

2.3.7 加酶量對酶轉(zhuǎn)化的影響 以15%馬鈴薯淀粉為底物，在30℃水浴條件下，加入不同量的β-CGTase，加酶量分別為每克干淀粉2.5、5.0、7.5和10.0 U，5%（V/V）環(huán)己烷，轉(zhuǎn)化24 h，蒸餾除去環(huán)己烷，HPLC檢測β-環(huán)糊精生成量。如表7所示，隨著加酶量的增多，環(huán)糊精總轉(zhuǎn)化率逐漸增大，β-環(huán)糊精的特異性也有所提高，但是在加酶量為5.0 U/g干淀粉之后，轉(zhuǎn)化率增大的不明顯，最高為10 U/g，此時總轉(zhuǎn)化率高達(dá)76.8%，而β-CD所占比例也達(dá)到最高值，為98.1%。綜合考慮特異性、轉(zhuǎn)化率及經(jīng)濟(jì)性因素，可以選擇加酶量為每克干淀粉5 U。

3 討論

早在1994年，荷蘭的Catherine等［25］就克隆表達(dá)了來自于Bacillus circulans251的CGTase，并研究了此重組酶的結(jié)構(gòu)，該酶顯示出了與來自于Bacillus circulans8的CGTase 75%的同源性。隨后，Ronald等［21］又對該酶的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了詳細(xì)的解析，Penninga等［22］則是在195位酪氨酸處做了定點突變，從而考察該位點對形成特定產(chǎn)物的重要作用。在上述研究的基礎(chǔ)上，本研究重點考察該酶的工業(yè)化應(yīng)用，在E.coliBL21（DE3）中成功表達(dá)了來源于Bacillus circulans251的CGTase，酶活為20 U/mL，胞外表達(dá)量達(dá)90%以上。下一步研究重點是將該重組菌在3 L發(fā)酵罐中進(jìn)行優(yōu)化，獲得更高表達(dá)量的酶液。

我國對于CGTase轉(zhuǎn)化淀粉生成環(huán)糊精的研究還不是很多，王雁萍［7］以5%馬鈴薯淀粉為底物，加入10%乙醇，轉(zhuǎn)化24 h，環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率可達(dá)57.97%。王俊英等［26］用嗜堿芽孢桿菌來源CGTase轉(zhuǎn)化5%的可溶性淀粉，β-CD的轉(zhuǎn)化率僅為40%。國外的研究相對多一些，Jemli等［27］以10%馬鈴薯淀粉作為底物，用Paenibacillus pabuliUS132來源的CGTase進(jìn)行催化，環(huán)糊精總產(chǎn)量達(dá)42 g/L，β-CD占63%；Sian等［28］用alkalophilicBacillussp. G1來源的CGTase轉(zhuǎn)化木薯淀粉，環(huán)糊精總產(chǎn)量達(dá)4.25 g/L，β-CD比例高達(dá)89%；對于Bacillus circulans251來源的CGTase，Blackwood等［18］也只將β-CD的比例提高到82%。本研究在考察了溫度對酶轉(zhuǎn)化的影響的基礎(chǔ)上，對其他的影響條件，如有機(jī)溶劑、轉(zhuǎn)化時間、加酶量等進(jìn)一步考察，最終把β-CD的轉(zhuǎn)化率提高到75.3%，而β-CD占總環(huán)糊精的比例也高達(dá)98.1%，均高于上述研究。同時，該工藝流程簡單，操作方便，這為β-CD的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了堅實的基礎(chǔ)，具有廣闊的實際應(yīng)用前景。

此外，段續(xù)果等［11］通過異淀粉酶與α-CGTase復(fù)配，將環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化率由60.36%提高到84.63%，Rendleman等［29］嘗試不同的底物和脫支酶，環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化率最高可達(dá)90%以上。鑒于該重組酶轉(zhuǎn)化的pH范圍比較寬，在后續(xù)的工作中考慮將脫支酶與CGTase進(jìn)行復(fù)配，以此提高產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率。

4 結(jié)論

本研究成功獲得了能夠分泌表達(dá)β-CGTase的重組E.coliBL21（DE3）菌株，初步試驗表明重組菌發(fā)酵上清液中β-CGTase酶活可達(dá)20 U/mL。采用該重組β-CGTase優(yōu)化了酶法生產(chǎn)β-CD的工藝條件。結(jié)果表明，最優(yōu)條件為底物馬鈴薯淀粉濃度15%，反應(yīng)pH5.5，溫度30℃，加酶量10 U/g干淀粉，環(huán)己烷濃度2.5%-5%（V/V），轉(zhuǎn)化時間24 h，β-CD總轉(zhuǎn)化率可達(dá)75.3%，且β-CD占總環(huán)糊精的比例高達(dá)98.1%。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Optimization of β-cyclodextrin Production by Recombinant β-cyclodextrin Glycosyltransferase

Yang Yulu1，2Wang Lei1，2Chen Sheng1，2Wu Jing1，2
（1. State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122；2. School of Biotechnology and Key Laboratory of Industrial Biotechnology Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122）

The βcgtgene encoding β-CGTase fromBacillus circulansstrain 251 was cloned into the expression vector pET-20b（+）. The vector was then transformed intoEscherichia coliBL21（DE3）for extracellular production of β-CGTase. The activity in the supernatant of recombinantE. coliBL21（DE3）was 20 U/mL. Furthermore, the condition for β-cyclodextrin（β-CD）preparation by this recombinant β-CGTase was optimized. At 15% potato starch, pH5.5, 30℃, 2.5%-5%（V/V）cyclohexane, 10 U β-CGTase per gram substrate incubated for 24 hours, 75.3% of the starch was transformed into β-CD. This is the highest level of β-CD conversion by enzyme method at home and abroad.

Cyclodextrin glycosyltransferase β-cyclodextrin Enzymatic conversion Recombinant expression Starch

2014-01-20

國家自然科學(xué)基金項目（31100048）

楊玉路，女，碩士研究生，研究方向：環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶；E-mail：llyang08k3232@163.com

吳敬，女，博士生導(dǎo)師，研究方向：食品與發(fā)酵；E-mail：jingwu@jiangnan.edu.cn