蘭金榮，葉文斌

（隴南師范高等專(zhuān)科學(xué)校 農(nóng)林技術(shù)學(xué)院，甘肅 成縣 742500）

黃瑞香（Daphne giraldii nitsche）為瑞香科植物，主要分布于陜西、甘肅、四川、青海，生于海拔1 600 m山地。莖皮及根皮入藥，能止痛、散血、補(bǔ)血，其莖皮和根皮為祖師麻藥材的來(lái)源之一，祖師麻辛、苦、溫，有小毒，歸肝經(jīng)。黃瑞香還可以作為純中藥制劑注射液，臨床上用于消炎鎮(zhèn)痛療效顯著，對(duì)風(fēng)濕和類(lèi)風(fēng)濕性疼痛療效很好，對(duì)癌癥晚期的止痛效果亦較滿(mǎn)意，而且黃瑞香注射液與甲氨喋呤有同等療效[1]。其主要含有香豆素類(lèi)、二萜類(lèi)、木質(zhì)素類(lèi)、黃酮類(lèi)、蒽醌類(lèi)等成分[2]。其中瑞香素（祖師麻甲素）為其指標(biāo)成分之一[3-4]，由其開(kāi)發(fā)的制劑有祖師麻片、祖師麻注射液、黃瑞香注射液、祖師麻膏藥、祖師麻關(guān)節(jié)止痛膏等，臨床和制劑使用量很大，但由于其藥用部位為皮部，采收主要以毀滅性的方式進(jìn)行，不但對(duì)主產(chǎn)地植被造成嚴(yán)重破壞，而且對(duì)其種質(zhì)資源的保護(hù)也受到了嚴(yán)重的威脅。為節(jié)約藥用植物材料，減少資源浪費(fèi)，開(kāi)發(fā)所含其它活性成分。目前，關(guān)于黃瑞香提取物對(duì)植物病原菌抑菌活性的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)利用黃瑞香提取物對(duì)小麥病原菌進(jìn)行深入研究，以研發(fā)出新型的抗植物病原菌制劑，為豐富植物源的生防制劑品種、合開(kāi)發(fā)利用小麥病害防治以及植物源農(nóng)藥開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

黃瑞香采自甘肅省隴南市成縣。供試植物病原菌為小麥赤霉病病原菌(Fusarium graminearumSchw.)、小麥根腐病原菌(Helminthosporium sorokinanumSacc.)、小麥紋枯病原菌(Rhizoctonia cerealisVander Hoeven)，這3種病原菌均購(gòu)自甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，病原菌培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 黃瑞香提取物制備 將黃瑞香全株洗去表面雜質(zhì)，剪成1 cm的小段自然陰干后，以不同溶劑、不同提取時(shí)間、不同提取溫度、不同料液比、不同溶劑濃度，水浴回流提取3次，之后用循環(huán)式真空泵進(jìn)行抽濾，收集濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮得膏狀物，50℃真空干燥，研磨即得到提取物粉末，保存于4℃的冰箱中待用。

1.2.2 病原菌活化

保存的菌種接種與PDA斜面，25℃恒溫培養(yǎng)，然后接種到含PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，第7天進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 提取物抑菌活性測(cè)定 取黃瑞香提取物粉末用水配成25 mg/mL供試液。取配制的供試液0.5 mL于滅菌的10 mL試管中，加入9.5 mL 50℃左右的PDA培養(yǎng)基，搖勻，倒入滅菌培養(yǎng)皿中后，選取長(zhǎng)勢(shì)整齊的菌落圈，以打孔器制得菌餅，并挖出孔內(nèi)培養(yǎng)基，倒置于上述加藥培養(yǎng)基的平皿上，每皿3個(gè)。28℃恒溫倒置培養(yǎng)43 h。用十字交叉法量取菌落圈直徑，取其平均值作為試驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算抑制率[5-6]。同時(shí)以蒸餾水為對(duì)照（CK）。

抑制率＝對(duì)照菌落直徑－處理菌落直徑對(duì)照菌落直徑×100%。

參考美國(guó)臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)的推薦標(biāo)準(zhǔn)，以抑菌圈直徑＞20 mm為極敏，抑菌圈直徑在15～20 mm為高敏，抑菌圈直徑在10～14 mm為中敏，抑菌圈直徑＜10 mm為低敏，無(wú)抑菌圈為耐藥，測(cè)定濾紙片的抑菌圈直徑，結(jié)果取平均值。

1.2.4 最低抑菌濃度的確定 采用2倍稀釋法[5-6]，以1%Tween-80為溶劑，取20 mg/mL黃瑞香提取物供試液，配制成1、1/2、1/4、l/8、l/16、l/32、1/64、1/128、l/256等不同稀釋度的溶液，取各個(gè)濃度藥液1 mL分別加入到無(wú)菌培養(yǎng)皿中，再加入經(jīng)滅菌處理并冷卻至50℃左右的9 mL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(真菌用PDA培養(yǎng)基)，充分混勻后冷卻制成含樣液平板，接種培養(yǎng)，觀察結(jié)果，與對(duì)照組（CK）(菌落正常生長(zhǎng))比較，肉眼可見(jiàn)菌落生長(zhǎng)者為無(wú)抑制作用，以完全沒(méi)有菌落生長(zhǎng)的最小質(zhì)量濃度為其MIC[7-9]，以1%Tween-80為溶液作對(duì)照。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，用單因素方差結(jié)合SSR多重比較分析檢驗(yàn)顯著性（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取溶劑對(duì)小麥病原菌抑菌活性比較

稱(chēng)取一定量黃瑞香提取物粉末，加入5倍體積的水、75%甲醇和75%乙醇，50℃水浴回流提取1 h，提取3次，測(cè)定不同提取溶劑對(duì)小麥病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用。從表1可以看出，在黃瑞香提取物供試質(zhì)量濃度為25 mg/mL時(shí)，對(duì)3種供試小麥病原菌，抑制菌絲效果最佳的均為75%乙醇提取液，且小麥赤霉病病原菌和小麥紋枯病原菌抑制率均達(dá)到40%以上。

表1 不同提取溶劑對(duì)3種小麥病原真菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用比較 %

2.2 不同提取時(shí)間對(duì)小麥病原菌抑菌活性比較

稱(chēng)取一定量黃瑞香提取物粉末，加入5倍體積的75%乙醇溶液，50℃水浴回流分別提取0.5，1.0，1.5，2.0 h，提取3次，測(cè)定不同提取時(shí)間對(duì)3種供試小麥根腐病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用。從表2可以看出，在提取物質(zhì)量濃度為25 mg/mL時(shí)，不同提取時(shí)間對(duì)小麥紋枯病原菌原菌和小麥根腐病原菌菌絲的抑制作用影響較大；但是對(duì)小麥赤霉病菌原菌抑制效果相對(duì)較差。但提取0.5 h時(shí)，對(duì)小麥3種病原菌菌絲的抑制效果都相對(duì)較差，1 h以上抑制效果較好，且二者之間差異顯著。

表2 不同提取時(shí)間對(duì)3種小麥病原真菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用比較 %

2.3 不同提取溫度對(duì)小麥病原菌抑菌活性比較

稱(chēng)取一定量黃瑞香提取物粉末，加入5倍體積的75%乙醇溶液，以40、50、60、70和80℃的不同溫度水浴回流提取1 h，提取3次，測(cè)定不同提取溫度對(duì)3種供試小麥根腐病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用。從表3可以看出，在提取物質(zhì)量濃度為25 mg/mL時(shí)，提取溫度對(duì)小麥紋枯病原菌、小麥根腐病原菌和小麥赤霉病菌菌絲的抑制作用影響明顯，抑制率均達(dá)到50%以上；對(duì)小麥赤霉病菌病原菌，提取溫度60℃以下的提取物抑菌效果相對(duì)較差，提取溫度在70℃以上的提取物抑菌效果較好，而小麥紋枯病原菌和小麥根腐病原菌在80℃提取物抑菌效果較好。結(jié)果表明，75%乙醇和甲醇提取物的抑菌效果較好，水提取物的抑菌效果最差，這說(shuō)明黃瑞香中主要抑菌活性成分是醇溶性物質(zhì)。通過(guò)不同溶劑、不同提取時(shí)間、不同提取溫度提取物對(duì)植物病原菌的抑菌效果比較，確定了黃瑞香抑菌活性物質(zhì)的提取條件，75%乙醇、70℃以上提取，溫度和提取1 h以上效果較佳，可得到的總體抑菌效果較好的黃瑞香提取物。

表3 不同提取溫度對(duì)3種小麥病原真菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用比較 %

2.4 最佳提取條件下黃瑞香提取物對(duì)小麥病原菌抑菌活性比較

抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示，在75%乙醇、70℃以上提取溫度和提取1 h以上的條件下，可得到總體抑菌效果較好的黃瑞香提取物對(duì)小麥紋枯病原菌和小麥赤霉病菌原菌的抑制作用均表現(xiàn)為極敏，對(duì)小麥根腐病原菌表現(xiàn)為中敏。

表4 黃瑞香干燥葉片揮發(fā)油抑菌效果

2.5 最佳提取條件下黃瑞香提取物對(duì)供試菌的MIC

據(jù)表5實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇研究最佳條件下所得的黃瑞香提取物對(duì)供試菌的MIC，采用2倍稀釋法進(jìn)行測(cè)定。由表5可知，黃瑞香提取物對(duì)不同供試菌具有不同的抑菌效果，對(duì)小麥紋枯病原菌原菌和小麥赤霉病原菌抑菌效果最好，MIC為1/256；對(duì)小麥根腐病原菌MIC均為1/128。

表5 黃瑞香干燥葉片水蒸汽蒸餾揮發(fā)油的MIC

2.6 溫度對(duì)黃瑞香提取物抑菌效果的影響

最佳條件下所得的黃瑞香提取物經(jīng)80、100、120和150℃處理15 min后，對(duì)各供試菌的抑菌效果見(jiàn)表6?？梢钥闯?，經(jīng)過(guò)不同溫度加熱處理，提取物對(duì)3種供試細(xì)菌抑菌效果的影響不大，各處理溫度之間抑菌圈的差異不明顯。因此，可以說(shuō)明黃瑞香在提取溶劑75%乙醇、提取溫度70℃和提取時(shí)間為1 h以上所得提取物的抑菌活性成分具有較好的熱穩(wěn)定性。

表6 黃瑞香提取物不同溫度加熱處理后對(duì)各種供試菌的抑菌效果

3 結(jié)論

黃瑞香在提取溶劑75%乙醇、提取溫度70℃和提取時(shí)間為1 h以上所得提取物的抑菌活性較好。對(duì)小麥紋枯病原菌原菌和小麥赤霉病菌原菌的抑制作用均表現(xiàn)為極敏，對(duì)小麥根腐病原菌表現(xiàn)為中敏。所得提取物對(duì)小麥病原真菌的MIC有差異，其中對(duì)小麥紋枯病原菌原菌和小麥赤霉病原菌抑菌效果最好，MIC為1/256；對(duì)小麥根腐病原菌MIC均為1/128。而且具有良好的熱穩(wěn)定性，經(jīng)80、100、120和150℃處理15 min后，其抑菌活性無(wú)明顯變化。雖然最佳提取工藝所得提取物對(duì)小麥病原真菌具有較好的抑菌效果，但具體的提取優(yōu)化工藝還有待進(jìn)一步優(yōu)化。黃瑞香中起抑菌效果的具體化學(xué)成分以及黃瑞香中的抑菌成分是某種成分單獨(dú)起作用還是幾種同時(shí)起協(xié)同作用都有待進(jìn)一步研究。若能從黃瑞香中提取抑菌活性成分作為生物農(nóng)藥，并且將其直接用于農(nóng)業(yè)植物病害的防治，將會(huì)極大地提高黃瑞香的有效利用率，并可減輕環(huán)境壓力，為農(nóng)藥安全生產(chǎn)提供更優(yōu)的選擇，所以研究結(jié)果為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用黃瑞香全株提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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