南 楠， 寧 娜，2， 孟利娜， 謝憲斌， 周 晶*， 王 欣

（1.天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 天津市臨床藥物關(guān)鍵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 天津 300070； 2.貴州省銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)系， 貴州 銅仁 554300； 3.天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司隆順榕制藥廠， 天津 300457）

酶解輔助提取金芪降糖片中生物堿的工藝研究

南 楠1， 寧 娜1，2， 孟利娜1， 謝憲斌1， 周 晶1*， 王 欣3

（1.天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 天津市臨床藥物關(guān)鍵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 天津 300070； 2.貴州省銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)系， 貴州 銅仁 554300； 3.天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司隆順榕制藥廠， 天津 300457）

目的 考察酶解輔助提取技術(shù)對(duì)金芪降糖片中生物堿提取率的影響，優(yōu)選出生物堿的最佳提取工藝條件。方法采用正交試驗(yàn)， 考察酶用量， pH， 溫度以及酶解時(shí)間對(duì)金芪降糖片中生物堿提取率的影響。 結(jié)果 優(yōu)化酶解法的最佳提取工藝條件為： 加入相當(dāng)于藥材質(zhì)量 0.6%的纖維素酶， 在 pH4.5， 35 ℃條件下酶解 3.0 h， 可將小檗堿提取率提高 29.98%， 黃連總生物堿提高 30.17%。 結(jié)論 酶解-冷浸法提取黃連生物堿簡(jiǎn)便可行， 不僅生物堿浸出率高，而且適合工業(yè)化生產(chǎn)。

酶輔助提?。唤疖谓堤瞧?；生物堿；小檗堿；正交試驗(yàn)

金芪降糖片是治療非胰島素依賴(lài)性糖尿病的經(jīng)典方劑，由黃連、金銀花和黃芪3味藥組成，其中主要成分為四大類(lèi)： 生物堿類(lèi)、 有機(jī)酸類(lèi)、 黃酮類(lèi)和皂苷類(lèi)［1］。 既往研究發(fā)現(xiàn)，金芪降糖片可改善胰島素抵抗個(gè)體的胰島素敏感性，降低血壓和血糖［2］， 還可糾正多囊卵巢綜合征患者的肥胖狀態(tài)，調(diào)節(jié)糖代謝，調(diào)節(jié)雄激素的合成，改善多囊卵巢綜合征患者的生殖調(diào)節(jié)軸［3］。 金芪降糖片拆方實(shí)驗(yàn)已明確其降血糖作用是以黃連［4］為主， 黃芪、 金銀花為輔［5］。 金芪降糖片在生產(chǎn)過(guò)程中黃連是直接以原藥材細(xì)粉入藥，為了縮減金芪降糖片的服用劑量從而提高患者用藥的順應(yīng)性［6］， 本實(shí)驗(yàn)在優(yōu)選黃連生物堿常規(guī)提取工藝基礎(chǔ)上， 采用纖維素酶輔助提取金芪降糖片中黃連中的生物堿，并通過(guò)正交試驗(yàn)篩選出黃連生物堿酶解輔助提取的工藝方法，用以提高黃連中有效成分的浸出率，減少耗能，縮短提取時(shí)間，從而達(dá)到更有效利用黃連藥材資源的目的。

1 材料

美國(guó) Waters高效液相色譜儀； Millennium系統(tǒng)工作站、2484雙波長(zhǎng)吸 收檢測(cè)器、 515 雙 泵、 Waters恒 溫柱溫 箱；SZ-93 自動(dòng)雙重純水蒸餾水器 （上海強(qiáng)運(yùn)科技有限公司）；BP-211D電子分析天平 （ 德國(guó)賽多利斯公司） ； KS-600D超聲清洗 機(jī) （ 寧 波 科 生 儀 器 廠 ） ； 黃 連 為 雞 爪 黃 連 Coptis chinensis Franch.的干燥根 （ 天津中新藥業(yè)隆順榕制藥廠提供， 由天津醫(yī)科大學(xué)生藥教研室周曄教授鑒定）， 符合《中國(guó)藥典》 2010 年版一部要求； 鹽酸藥根堿， 鹽酸巴馬汀，鹽酸小檗堿對(duì)照品 （中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為 110713-200908、 110732-200806、 0733-200905）； 纖維素酶 （天津利華酶制劑技術(shù)有限公司， 濾紙酶活力5 109.52 U/g， 批號(hào) 為 10-03-19 ） ， 乙腈為 色譜純， 水為重蒸水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥材中生物堿測(cè)定 根據(jù)前期工作的方法學(xué)考察結(jié)果［8］對(duì)黃連藥材主要生物堿進(jìn)行了定量測(cè)定。 結(jié)果見(jiàn)表 1。

表1 黃連中生物堿測(cè)定結(jié)果

2.2 金芪降糖片生物堿酶輔助提取單因素試驗(yàn) （n=2）

2.2.1 纖維素酶液的配制 準(zhǔn)確稱(chēng)取 500 mg纖維素酶，用 pH4.5 的蒸餾水溶解后定容至 100mL量瓶中， 此酶液質(zhì)量濃度為 5 mg/mL， 經(jīng)濾紙酶活力法［9］測(cè)定纖維素酶活力為： 5 109.52 U/g。

2.2.2 酶解液 pH值的考察 稱(chēng)取 10 g黃連 9 份， 置于100m L三角瓶中， 加入8 倍量、 以硫酸水分別調(diào)成 pH1.4、3.0、 3.5、 4.0、 4.5、 5.0、 5.5、 6.0、 6.8， 纖維素酶用量均為藥材質(zhì)量的 0.6%， 于 50 ℃水浴中溫?zé)?3.5 h 后， 按初步篩選優(yōu)化的提取條件， 加入 8 倍量 0.25%硫酸水， 冷浸提取 2 次， 每次 24 h， 收集、 合并提取液， 濃縮定容于100mL量瓶中， 并稀釋到刻度。 按照前期工作方法學(xué)考察中的色譜條件［8］進(jìn)樣 10 μL。 每個(gè)樣品平行兩份， 經(jīng)測(cè)定，計(jì)算生物堿提取率。 小檗堿及總生物堿的提取率見(jiàn)圖1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 在 pH4.0 時(shí)， 小檗堿、 總生物堿的提取得率均達(dá)到最高。

圖1 酶解 PH的考察

2.2.3 酶解時(shí)間考察 稱(chēng)取 10 g黃連 9 份， 置于 100 mL三角瓶中， 分別加入 8 倍量 pH4.0 的硫酸水， 纖維素酶用量均為黃連藥材質(zhì)量的 0.6%， 于 50 ℃水浴中分別酶解1.0、 1.5、 2.0、 2.5、 3.0、 3.5、 4.0、 4.5、 5.0 h 后， 以下操作同 “2.2.2” 項(xiàng)下。 結(jié)果見(jiàn)圖 2。 結(jié)果表明黃連加入纖維素酶酶解 2.5 h， 小檗堿及總生物堿的提取得率均達(dá)到峰值。

圖2 酶解時(shí)間的考察

2.2.4 纖維素酶用量考察 分別稱(chēng)取10 g黃連8 份， 置于100 mL三角瓶中， 分別加入 8 倍量的 pH4.0 的硫酸水， 加入生 藥 質(zhì) 量 0、 0.3%、 0.6%、 0.9%、 1.2%、 1.5%、1.8%、 2.1%纖維素酶， 于50 ℃水浴中酶解2.5h， 以下操作同 “2.2.2” 項(xiàng)下。 結(jié)果見(jiàn)圖 3。 結(jié)果表明， 當(dāng)纖維素酶加入量為黃連藥材質(zhì)量的 0.9%時(shí)， 小檗堿及總生物堿的提取得率達(dá)到最大值。

圖3 酶用量的考察

2.2.5 酶解溫度考察 稱(chēng)取 10 g黃連 8 份， 分別置于 100 m L三角瓶中， 加入 8 倍量 pH4.0 酸水， 再加入 0.9%纖維素酶， 分別于 25、 30、 35、 40、 45、 50、 55、 60、 65 ℃的水浴中進(jìn)行酶解 2.5 h， 以下操作同 “2.2.2” 項(xiàng)下。 結(jié)果見(jiàn)圖 4。 結(jié)果表明， 當(dāng)酶解溫度為 40 ℃時(shí)， 小檗堿及總生物堿的提取得率達(dá)到最大值。

圖4 酶解溫度的考察

2.3 正交試驗(yàn)法優(yōu)選纖維素酶酶解工藝 根據(jù)單因素試驗(yàn)考察結(jié)果， 采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) L9（34）， 選擇纖維素酶用量、 溫度、 pH、 酶解時(shí)間四個(gè)因素作為考察對(duì)象， 以小檗堿及總生物堿提取得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，評(píng)分時(shí)將總生物堿提取率和小檗堿提取率的權(quán)重系數(shù)分別設(shè)為 0.4 和0.6， 以綜合評(píng)分值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 因素水平見(jiàn)表2， 正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析結(jié)果分別見(jiàn)表3 ～4。

綜合評(píng)分 =小檗堿提取率 ×0.6+總生物堿提取率 ×0.4

表2 正交試驗(yàn)因素水平

對(duì)試驗(yàn)結(jié)果做直觀分析，由各因素的極差值 R，確定最佳提取工藝，并用方差分析評(píng)價(jià)各因素水平表對(duì)提取工藝影響的顯著性， 結(jié)果見(jiàn)表4。

根據(jù)直觀分析結(jié)果可知：各因素對(duì)提取金芪降糖片總生物堿的影響大小順序?yàn)椋?C＞D＞B＞A。 直接根據(jù)極差值的大小可知： 在考察的四個(gè)因素中， 酶解液的pH值影響較大，纖維素酶的用量影響較小， 并且 0.6%和 0.8%的纖維素酶對(duì)黃連生物堿的提取率比較接近， 但是選用 0.6%纖維素酶可以降低成本且不影響提取率，因此最佳酶解條件是A1B1C3D3。 根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果可得出以纖維素酶輔助提取金芪降糖片生物堿的最佳參數(shù)指標(biāo)分別為：加入相當(dāng)于藥材質(zhì)量 0.6%的纖維素酶， 在 pH4.5， 35 ℃條件下酶解 3.0 h。正交試驗(yàn)與單因素考察的優(yōu)選條件是一致的。方差分析表明： 酶解液的pH值、 酶解時(shí)間、 酶解溫度及纖維素酶用量對(duì)金芪降糖片生物堿提取得率的影響無(wú)顯著性差異。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 將藥材量放大 10 倍， 即稱(chēng)取 100 g黃連，按照最佳工藝 A1B1C3D3下進(jìn)行纖維素酶解處理后， 在優(yōu)選的冷浸條件下進(jìn)行常規(guī)提取。并設(shè)置非酶解組與之比較，即不加纖維素酶外，其他提取過(guò)程均與酶解輔助提取法提取操作相同。 每個(gè)樣品平行3份。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

表 3 L9（34） 正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 方差分析

表 5 酶解輔助提取工藝驗(yàn)證結(jié)果 （n=3）

上述結(jié)果表明， 在 A1B1C3D3工藝條件下黃連生物堿的提取率較高， 小檗堿及總生物堿提取得率分別為 85.27%和87.54%， 與非酶解組相比， 小檗堿及總生物堿提取率分別提高了 29.98%和 30.17%， 浸膏得率降低了 25.19%。

3 討論

金芪降糖片中的生物堿主要是來(lái)源于黃連生物堿，有文獻(xiàn)報(bào)道金銀花中綠原酸可使黃連中小檗堿生成沉淀［10］，所以生產(chǎn)中采用單煎的方式提取黃連生物堿。本實(shí)驗(yàn)在單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)選的最佳酶解條件下，對(duì)黃連藥材總生物堿進(jìn)行酶解輔助提取，與空白組比較，小檗堿及總生物堿提取率分別提高了約三分之一，其原因是黃連屬于根莖類(lèi)藥材，其組織結(jié)構(gòu)致密堅(jiān)硬不利于有效成分的浸出，通過(guò)纖維素酶處理，細(xì)胞壁中纖維素被酶水解，減少了藥材組織細(xì)胞內(nèi)化學(xué)物質(zhì)溶出的屏障，使其更容易擴(kuò)散被提取出來(lái)。而且通過(guò)酶處理后，其浸膏得率降低了約四分之一，也有利于降低成藥的劑量。綜上，酶輔助提取法不僅提高了金芪降糖片的內(nèi)在質(zhì)量，而且還可以縮減服用劑量，提高患者用藥的順應(yīng)性，并且該方法對(duì)設(shè)備無(wú)特殊要求，應(yīng)用常規(guī)提取儀器即可完成，更有利于在制藥工業(yè)生產(chǎn)中實(shí)施。

黃連中主要含有巴馬汀、藥根堿、小檗堿等生物堿，其中前二者具有保護(hù)缺血心肌、 解毒殺菌［11］等作用， 隨著近年來(lái)對(duì)黃連研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)小檗堿具有降血糖［12］、 降血壓、 降血脂、 抗心律失常、 抗甲狀腺癌［13］等功效。也有研究表明小檗堿能通過(guò)肝細(xì)胞發(fā)揮非胰島素依賴(lài)的降血糖作用， 但不能增加胰島素的分泌［14］。 考慮到小檗堿在治療糖尿病和心腦血管疾病的作用價(jià)值，所以本實(shí)驗(yàn)在優(yōu)選金芪降糖片中生物堿的提取條件時(shí)，以小檗堿量為主要考察指標(biāo)，同時(shí)兼顧其他生物堿的量，篩選生物酶解輔助提取金芪降糖片中小檗堿以及總生物堿的工藝，為金芪降糖片的工業(yè)化生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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R284.2

： B

： 1001-1528（2014）01-0192-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.01.050

2013-01-12

天津市科技攻關(guān)項(xiàng)目 （06YFGPSH02900）

南 楠 （1988—） ， 女， 碩士生， 研究方向： 天然藥物化學(xué)。 Tel： 13102128508 ， E-mail： nan198829@126.com

*通信作者： 周 晶 （1956—） ， 女， 教授， 研究方向： 中藥及中藥制劑提取工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化。 Tel： 13920680193， E-mail： zhoujing @tijmu.edu.cn