姚 干， 王 允， 劉 毅， 陶 勇， 代文飛， 王 皓， 劉 恒

（重慶郵電大學(xué)生物信息學(xué)院， 重慶 400065）

［藥 理］

二至丸有效部位群促進T淋巴細胞免疫活性的實驗研究

姚 干， 王 允， 劉 毅， 陶 勇， 代文飛， 王 皓， 劉 恒

（重慶郵電大學(xué)生物信息學(xué)院， 重慶 400065）

目的 考察二至丸有效部位群 （女貞子總皂苷、 女貞子多糖、 墨旱蓮總黃酮） 促進小鼠T淋巴細胞免疫活性作用的機制。 方法 環(huán)磷酰胺致小鼠免疫力低下， 灌胃給藥， 制備含藥血清、 細胞懸液和脾總RNA， 中性紅法測定腹腔巨噬細胞的吞噬能力， MTT法測定脾淋巴細胞的增殖能力， 胸腺細胞增殖法和 ELISA法測定腹腔巨噬細胞分泌 IL-1的水平、 脾淋巴細胞分泌 IL-2、 IL-12 的水平， RT-PCR法檢測 IL-1、 IL-2 和 IL-12 mRNA的表達。 結(jié)果 免疫力低下小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬能力、 脾淋巴細胞的增殖能 力， 以及 IL-1、 IL-2 和 IL-12 的水平， 均較正常小 鼠明顯下降，三種細胞因子的表達也受到抑制，經(jīng)該方治療后，上述檢測指標(biāo)均有不同程度的提高。結(jié)論 該方對免疫失衡機體的保護作用與其改善 T淋巴細胞因子的活性水平及其 mRNA的表達水平有關(guān)。

二至丸有效部位群；免疫力低下；小鼠；T淋巴細胞

二至丸有效部位群由女貞子總皂苷、女貞子多糖、墨旱蓮總黃酮3種有效部位組成，具有明顯的保肝和增強免疫作 用［1-3］。 本研究主要考察 該組方促進T淋巴細胞免疫活性作用的機制。

1 實驗材料

1.1 藥品 女貞子、 墨旱蓮藥材， 購自重慶康濟醫(yī)藥有限公司，經(jīng)鑒定，分別符合 《中國藥典》2010 年版一部女貞子、 墨旱蓮項下規(guī)定。 女貞子總皂苷 （總皂苷質(zhì)量分數(shù) 64.35%）、女貞子多糖（多糖質(zhì)量分數(shù) 78.32%）、 墨旱蓮總黃酮 （總黃酮質(zhì)量分數(shù) 67.86%）［4-5］， 本實驗室制備。 二至丸有效部位群含女貞子總皂苷、女貞子多糖和墨旱蓮總黃酮， 劑量配比為 13 ∶83 ∶4［6］， 臨用前用蒸餾水制成質(zhì)量濃度為 22.15 mg/mL的藥液， 必要時少量 Tween-80 助溶。 環(huán)磷酰胺粉針劑 （ 江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司， 批號 110901， 200 mg/支）， 鹽酸左旋咪唑片 （山東省莒南制藥廠， 批號 110601，25 mg/片）， 臨用前用蒸餾水制成質(zhì)量濃度分別為4.0、 18.75 mg/mL的藥液。

1.2 試劑 RPMI-1640 培養(yǎng)液 （ Gibco） ， 無酚紅RPMI-1640 培養(yǎng)液 （Sigma），配制時加青霉素 1 × 105IU/L、鏈霉素 100 mg/L，過濾， 使用時加體積分數(shù)為15%的胎牛血清 （FBS， 超級， 杭州四季青生物 工 程 材 料 研 究 所）。 ConA （ 刀 豆 蛋 白 A）（Flu-ka）， 用培養(yǎng)液配成 4 mg/mL， 0.22 μm孔濾膜過濾， 分裝， -20 ℃凍存， 臨用前稀釋。 MTT（ 噻 唑 藍） （ Sigma）， 使 用 前 用 PBS 配 制 成5 mg/mL，過 濾， 4 ℃ 避光保 存。 LPS （ 脂多糖）（Sigma）， 用培養(yǎng)液配成 1 mg/mL，0.22 μm微孔濾膜過濾， 分裝， -20 ℃凍存，臨用前稀釋。 抗小鼠 CD3 抗體 （Sigma）。 IL-12 ELISA檢測試劑盒（ R&DSystemsEuropeLtd， Abingdon， Oxon， UK）；TRIZOL總 RNA提取試劑 （ Gibco BRL）；RT-PCR試劑 （ Promega）；引 物 （ 上海 生 物 工 程 服 務(wù) 公司）； 其 他 試 劑 （ TaKaRa）； 硫 代 羥 基 乙 酸 鈉（thioglycollate， TG） （ 北京生物制品所） ； 其余試劑均為市售分析純。

1.3 儀器 Napco-5100 型 CO2培養(yǎng)箱，美國。恒溫水浴搖床， Yamato， 日本。 PCR擴增儀、 分光光度計、 凝 膠 成 像 分 析 儀、 550 型 酶 標(biāo) 儀， Bio-Rad， 美國。

1.4 動物 KM 種小鼠，6 ～8 周齡， 體質(zhì)量（20 ±2） g， 重慶市中藥研究院實驗動物研究室（許可證號： 310101001）。

2 方法與結(jié)果

2.1 含藥血清和脾組織制備［7］取小鼠 50 只， 隨機分為 5 組， 每組 10 只， 雌雄各半。 各組按 20 m L/kg灌胃給藥， 連續(xù) 6 d。 其中， 正常對照組、模型組給予生理鹽水，陽性對照組給予鹽酸左旋咪唑 0.375 g/kg， 正常給藥組、 治療給藥組給予二至丸有效部位群 0.443 g/kg。 模型組、 陽性對照組、治療給藥組于實驗第 4 天腹腔注射環(huán)磷酰胺 0.5 m L/只 （0.040 g/kg）。 末次給藥后 1 h， 深度麻醉： （1） 心臟無菌采血， 3 000 r/min 離心 10 min，同組血清混合， 56 ℃ 水浴 30 min， EP管分裝，-70 ℃凍存， 臨用前 4 ℃凍融； （2） 隨行無菌取脾，切成小塊，液氮罐中保存。

2.2 細胞懸液的制備［8］小鼠腹腔注射 3%TG溶液 （2 mL/只）， 72 h 后脫頸椎處死， 無菌條件下，腹腔注射 PBS 5 mL， 收集腹腔洗液， 同時取脾和胸腺。 常規(guī)方法制備細胞懸液， PBS 液洗滌， 離心， 用 RPMI-1640-10%FBS 培養(yǎng)液 調(diào) 整細胞密度為 2 ×106個/mL， 臺盼藍排除法檢查細胞存活率大于95%。

2.3 二至丸有效部位群對小鼠腹腔巨噬細胞（PMΦ） 吞噬功能的影響 取 96 孔細胞 培養(yǎng)板，每孔加入 PMΦ懸液 50 μL、含藥血清 20 μL和培養(yǎng)液120 μL， 各組設(shè) 8 個復(fù)孔。 37 ℃、 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h， 棄孔內(nèi)培養(yǎng)基， 加 0.075%中性紅溶液 100 μL/孔， 培養(yǎng) 1 h， 棄上清液， 預(yù) 溫 的PBS 液洗 3 次， 加入細胞溶解液 （0.1 mol/L乙酸-無水乙醇） 100 μL/孔， 室溫放置， 過夜。 次日，取上清液于 酶 標(biāo) 板 中， 酶 標(biāo) 儀 540 nm處 測 定 OD值。 采用 SPSS 11.0 統(tǒng)計軟件包相應(yīng)方法進行數(shù)據(jù)處理。 組 間 顯 著 性 分 析 選 用 One-Way ANOVA→Dunnett法， 實驗數(shù)據(jù)用表示， 結(jié)果見表1。

表1 二至丸有效部位群對小鼠 PMΦ吞噬功能的影響（OD值， n=8）Tab.1 Effect of effective fractions from Erzhi Pills on phagocytosis of peritoneal macrophage of m ice（OD， n=8）

從表1可以看出， 正常給藥組小鼠 PMΦ的吞噬功能明顯提高，與正常對照組比較，有顯著性差異 （P＜0.05）； 模型組小鼠 PMΦ的吞噬功能明顯降低， 與正常對照組比較， 有極顯著性差異 （P＜0.01）； 陽性對照組、 治療給藥組小鼠 PMΦ的吞噬功能明顯提高，與模型組比較，有顯著性差異（P＜0.05）。

2.4 二至丸有效部位群對小鼠 PMΦ 誘生 IL-1 的影響［9］取 24 孔細胞培養(yǎng)板， 每孔加入 PMΦ 懸液 1 mL， 各組設(shè)3 個復(fù)孔。 37 ℃、 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)， 30 min 輕搖 1 次， 使未黏附細胞黏附， 3 h后，用培養(yǎng)液洗2次，除去未黏附細胞，換以含藥血清-培養(yǎng)液，使含藥血清終體積分數(shù)分別為20%、40%和 80% （V/V） /孔， 繼續(xù)培養(yǎng) 48 h，3 000 r/min 離心， 收集上清液， 備用。 取 96 孔細胞培養(yǎng)板， 每孔加入小鼠胸腺細胞懸液 100 μL，再加 ConA溶液 （終質(zhì)量濃度為 30 μg/m L）， 最后上清液的倍比 （1 ∶5、 1 ∶10 和 1 ∶20） 稀釋液（100 μL/孔）， 對照孔用培養(yǎng)液代替上清液， 各組設(shè) 3 個復(fù)孔。 將培養(yǎng)板置 37 ℃、 5%CO2培養(yǎng)箱中， 培養(yǎng) 48 h 后， 加入 MTT 10 μL/孔 （10 mg/mL）培養(yǎng) 8 h， 棄上清， 加入 DMSO 100 μL/孔， MTT結(jié)晶充分溶解后，酶標(biāo)儀 570 nm處測定 OD值。 數(shù)據(jù)處理同 “2.3” 項下方法， 結(jié)果見表 2。

表 2 二至丸有效部位群對小鼠 PMΦ誘生 IL-1 的影響 （OD值， n=3）Tab.2 Effect of effective fractions from Erzhi Pills on IL-1 p roduction by peritonealmacrophage ofm ice（ OD， n=3）

從表2可以看出，正常給藥組各稀釋比例上清液中 IL-1 的水 平明顯提高， 與正常對照組比較，有顯著性差異 （P＜0.05）； 模型組各稀釋比例上清液中 IL-1 的水平明顯降低， 與正常對照組比較，有顯著性或極顯著性差異 （P＜0.05， P＜0.01）；治療給藥組 20%上清液 1 ∶10、 40%上清液各比例、 80%上清液 1 ∶5 和 1 ∶10 中 IL-1 的水平明顯提高，與模型組比較，有顯著性或極顯著性差異（P＜0.05， P＜0.01）。

2.5 二至丸有效部位群對小鼠脾淋巴細胞 （LP）增殖活性的影響 取96孔細胞培養(yǎng)板，每孔加入脾 LP懸液 50 μL、 含藥血清 20 μL和培養(yǎng)液 120 μL， 混勻后預(yù)孵 1 h， 加入 ConA或 LPS10 μL（終質(zhì)量濃度為 5 μg/m L） （對照組用 PBS 10 μL）， 各組設(shè)8 個復(fù)孔。 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48 h后， 加入 MTT 10 μL/孔 （10 mg/m L） 培養(yǎng) 8 h，棄上清液， 加入 DMSO 100 μL/孔， MTT結(jié)晶充分溶解后， 酶標(biāo)儀 570 nm處測定 OD值。 數(shù)據(jù)處理同 “2.3” 項下方法， 結(jié)果見表 3。

從表 3 可以看出，正常給藥組 ConA或 LPS 誘導(dǎo)的小鼠脾 LP的增殖活性明顯提高， 與正常對照組比較， 有顯著性差異 （P＜0.05）； 模型組 ConA或 LPS 誘導(dǎo)的小鼠脾 LP的增殖活性明顯降低， 與正常對照組比較， 有極顯著性差異 （P＜0.01）；陽性對照組、治療給藥組 ConA或 LPS 誘導(dǎo)的小鼠脾 LP的增殖活性明顯提高，與模型組比較， 有極顯著性差異 （P＜0.01）。

表3 二至丸有效部位群對小鼠脾 LP增殖活性的影響（OD值， n=8）Tab.3 Effect of effective fractions from Erzhi Pills on sp lenic lym phocyte proliferation of m ice （ OD，n=8）

2.6 二至丸有效部位群對小鼠脾 LP誘生 IL-2 的影響［10］取 24 孔細胞培養(yǎng)板， 每孔加入脾 LP懸液 1 m L， 各組設(shè)3 個復(fù)孔。 37 ℃、 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)， 30 min 輕搖一次， 使未黏附細胞黏附， 3 h后，用培養(yǎng)液洗2次，除去未黏附細胞，換以含藥血清-培養(yǎng)液 （1 mL/孔）， 繼續(xù)培養(yǎng) 48 h， 3 000r/min離心， 收集上清液， 備用。 取 96 孔細胞培養(yǎng)板， 每孔加入小鼠胸腺細胞懸液 100 μL， 再加ConA溶液 （終質(zhì)量濃度為 30 μg/mL）， 最后加 IL-2 上清液 （100 μL/孔），對照孔用培養(yǎng)液代替 IL-2上清液， 各組設(shè)8 個復(fù)孔。 將培養(yǎng)板置37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)箱中， 培養(yǎng) 48 h 后， 加入 MTT 10 μL/孔（10 mg/mL） 培養(yǎng) 8 h，棄上清， 加入 DMSO 100 μL/孔，MTT結(jié)晶充分溶解后，酶標(biāo)儀 570 nm處測定 OD值。 數(shù)據(jù)處理同 “2.3” 項下方法， 結(jié)果見表4。

表 4 二至丸有效部位 群對小鼠脾 LP誘 生 IL-2 的影響（OD值， n=8）Tab.4 E ffect of effective fractions from Erzhi Pills on IL-2 p roduction by sp lenic lym phocyte of m ice（ OD，n=8）

從表 4 可以看出， 正常給藥組上清中 IL-2 的水平明顯降低，與正常對照組比較，有顯著性差異（P＜0.05）；陽性對照組、 治療給藥組上清中 IL-2的水平明顯提高， 與模型組比較，有顯著性 （P＜0.05）。

2.7 二至丸有效部位群組方對小鼠脾淋巴細胞 IL-12 誘生的影響［11］取 24 孔細胞培養(yǎng)板，每孔加入脾 LP懸 液 950 μL， 各 組 設(shè) 3 個復(fù) 孔。預(yù)孵 1 h，加入 50 μL ConA或 LPS （100 μg/mL） 或 抗 小 鼠CD3 抗體 （1.25 μg/mL） 刺激脾 LP（ 對照組用 10 μL PBS） ， 37 ℃、 5%CO2培 養(yǎng) 箱 培 養(yǎng)， 30 min 輕搖一次， 使未黏附細胞黏附，3 h后， 用培養(yǎng)液洗2 次， 除 去 未黏附細胞， 換 以 含 藥 血 清-培 養(yǎng) 液，繼續(xù)培 養(yǎng) 48 h， 3 000 r/min 離 心 ， 收 集 上 清 液 ，用培養(yǎng)液按 1 ∶5 比例稀釋后， 備用。 取 96 孔細胞培養(yǎng)板， 每孔加入50 μL上清液稀釋液和 50 μL生物素化的抗 IL-12 抗體， 同時設(shè)空白對照、 陰性對照 （ 均 加 培 養(yǎng) 液 ） 和 陽 性 對 照 （ 加 IL-12 標(biāo) 準品） ， 各組設(shè) 8 個復(fù)孔。室溫孵育 2 h， 洗板 3 次。加入鏈霉親和素-辣根過氧化物酶溶液 100 μL（ 空白對照 用 PBS 代 替 ） ， 室 溫 孵 育 30 min， 洗 板 3次， 加入四甲基聯(lián)苯胺 （TMB） 底物溶液。 酶標(biāo)儀 450 nm處測定 OD值， 根據(jù)標(biāo)準曲線計算 IL-12的水平。 數(shù)據(jù)處理同 “2.3” 項下方法， 結(jié)果見表5。

表 5 二至丸有效部位群對小鼠脾 LP誘生 IL-12 的影響（ng/L， n=8）Tab.5 Effect of effective fractions from Erzhi Pills on IL-12 production by sp lenic lym phocyte of m ice（ng/L， n=8）

從表 5 可以看出，正常給藥組上清液中 IL-12的水平明顯提高， 其中， 以經(jīng)抗 CD3 抗體刺激后的效應(yīng)較為明顯，與正常對照組比較，有顯著性差異 （P＜0.05）； 模型組上清液中 IL-12 的水平明顯降低， 其中， 以經(jīng) ConA、 抗 CD3 抗體刺激后的效應(yīng)較為明顯，與正常對照組比較，有顯著性或極顯著性差異 （P＜0.05， P＜0.01）；陽性對照組、治療給藥組上清液中 IL-12 的水平明顯提高， 其中，治療給藥組以經(jīng) ConA、 抗 CD3 抗體刺激后的效應(yīng)較為明顯，與模型組比較， 有顯著性差異 （P＜0.05）。

2.8 二至丸有效部位群對小鼠脾臟 IL-1、 IL-2 和IL-12 mRNA 表 達 的 影 響［11-12］取 脾 組 織 小 塊 約100 mg， 在液氮預(yù)冷的研缽中研磨成粉末狀， 加RNAiso Plus， 勻漿液離心， 上清液用三氯甲烷振蕩， 離心， 上清液加異丙醇， 離心， 沉淀加 75%乙醇離心， 沉淀通風(fēng)干燥， RNase-free dd H2O溶解， 即得脾總 RNA。 引物序列見表 6， RNA純度鑒定、 RT-PCR分別按對應(yīng)的試劑盒說明書操作。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體 系 42 ℃反應(yīng) 60 min， 99 ℃ 加 熱 5 min， 冰浴 10 min。 PCR反應(yīng)在基因擴增儀上進行，不同的基因擴增時運用不同的循環(huán)數(shù) （ IL-1、 IL-2、 IL-12 依 次 為 28、 28、 30 個 循 環(huán)） 及 T m 值（退火溫度，IL-1、 IL-2、 IL-12 依次為 62、 64、 60℃）， 每批模板均同時進行 β-actinmRNA擴增作為內(nèi)對照。 凝膠電泳、 掃描， 用細胞因子吸光度/βactin 吸光度之比表示各細胞因子 mRNA的量。 數(shù)據(jù)處理同 “2.3”項下方法， 結(jié)果見表7。

表6 目的基因的引物序列Tab.6 Primer sequence of the target gene

表 7 二至丸有效部位群對小鼠脾臟 IL-1、 IL-2 和 IL-12 mRNA表達的影響 （ n=8）Tab.7 Effect of effective fractions from Erzhi Pills on expressions of IL-1， IL-2 and IL-12m RNA in sp leen ofm ice（ n=8）

從表 7 可以看出：正常給藥組小鼠脾臟 IL-1、IL-2 和 IL-12 mRNA表達的水平明顯提高， 其中，以促進 IL-1、 IL-2 mRNA表達的作用較為明顯， 與正常對照組比較， 有極顯著性差異 （P＜0.01）；模型組小鼠脾臟 IL-1、 IL-2 和 IL-12 mRNA表達的水平明顯降低，與正常對照組比較，有顯著性差異（P＜0.05）； 陽性對照組、 治療給藥組小鼠脾臟IL-1、 IL-2 和 IL-12 mRNA表達 的水平明顯提高，與模型組比較， 有極顯著性差異 （P＜0.01）。

3 討論

機體免疫功能狀況與細胞免疫關(guān)系密切，細胞免疫的識別和效應(yīng)階段由 T細胞特異性識別介導(dǎo)［13-14］。 IL-2 活性水平可以直接反映 T細胞功能，IL-1 是 T細胞活化和 IL-2 產(chǎn)生的重要刺激因子，IL-12 既是活化 Th1 和 NK細胞的關(guān)鍵因子， 又是 T細胞和 NK細胞分 泌 γ-INF的強烈刺激因 子［15-16］，對這些影響T細胞功能的關(guān)鍵分子進行分析，有助于闡明藥物的免疫作用機理。

本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠皮下注射環(huán)磷酰胺后，其腹腔巨噬細胞的吞噬能力、脾淋巴細胞的增殖能力、關(guān)鍵細胞因子 （IL-1、 IL-2、IL-12） 的活性水平及其 mRNA的表達水平均明顯降低。 采用二至丸有效部位群治療后，上述各項指標(biāo)都有明顯改善，說明該方可以較好地恢復(fù)免疫力低下機體的免疫功能，對免疫失衡機體的保護作用與改善T淋巴細胞關(guān)鍵因子的活性水平及其 mRNA的表達水平有關(guān)。研究成果對闡明二至丸免疫調(diào)節(jié)作用的分子機理具有重要的意義，為其二次開發(fā)提供實驗依據(jù)。

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Promotion of effective fractions from Erzhi Pills on immune activity of T lymphocyte

YAO Gan， WANG Yun， LIU Yi， TAO Yong， DAIWen-fei， WANG Hao， LIU Heng
（College of Bioinformation of Chongqing University of Postsand Telecommunications， Chongqing 400065， China）

AIM To study the promotion of effective fractions from Erzhi Pills（total saponins from Broussonetiae Fructus， polysaccharides from Broussnetiae Fructus， total flavonoids from Ecliptae Herba）on immune activity of T lymphocyte in mice.METHODS Cyclophosphamide was used to cause immunosuppressive mice and the test drug was applied by gavage.Drug-contained serum， cell suspension and total RNA in spleen were later prepared. Themacrophage phagocytosis， the lymphocytic proliferation， the levels of IL-1， IL-2 and IL-12， and the expressions of IL-1， IL-2 and IL-12 mRNAs in spleen from immunosuppressivemice were evaluated by natural redmethod， MTT colorimetry， thymus cell proliferation assay， ELISA and RT-PCR， respectively.RESULTS Themacrophage phagocytosis， the lymphocytic proliferation， the levels of IL-1， IL-2 and IL-12， and theirmRNA expressions in cyclophosphamide group were significantly lower than those in the normalmice.The above-mentioned indexes all improved to a certain extent after the treatment with effective fractions from Erzhi Pills.CONCLUSIONS The protective effect of effective fractions from Erzhi Pillson immunosuppressivemicemay be related to increasing levels of cytokines of T lymphocytes and theirmRNA expressions.

effective fractions from Erzhi Pills； hypoimmunity； mice； T lymphocytes

R285.5

： A

： 1001-1528（2014）03-0441-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.03.001

2013-04-14

重慶市自然科學(xué)基金 （CSTC2006BB5429）

姚 干 （1970—）， 男， 博士， 副教授， 研究方向： 中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、 作用機理及中藥新藥。 Tel： （023） 62471286， E-mail： 451037849@qq.com