胡海霞， 王效山

（安徽中醫(yī)藥大學藥學院， 安徽 合肥 230031）

注射用新藤黃酸包合物在大鼠體內藥物代謝動力學研究

胡海霞， 王效山

（安徽中醫(yī)藥大學藥學院， 安徽 合肥 230031）

目的 考察大鼠注射新藤黃酸包合物后的藥動學行為。方法 兩組大鼠分別單次注射新藤黃酸包合物 （受試樣品） 及新藤黃酸 （參比樣品）， HPLC法測定不同時間的血藥濃度， 采用 3p97 藥動學軟件擬合藥動學參數(shù)。 結果 受試樣品中新藤黃酸的 C0， T1/2， AUC0-80分別為 （1 502.2 ±283.8） mg/L、 （ 1.76 ±0.84） min、 （ 3 815.2 ±1 468.2）（ mg/L·min） ； 參比 樣 品 中 新 藤 黃 酸 的 C0， T1/2， AUC0-80分 別 為 （ 346.6 ±64.7 ） mg/L、 （ 2.32 ±1.16 ） min、（1 160.1 ±380.2） （mg/L·min）。 結論 注射新藤黃酸后大鼠血漿藥時曲線符合一室模型。 建立的測定方法適用于體內新藤黃酸的定量測定及藥動學研究。

藥物代謝動力學；新藤黃酸包合物；高效液相色譜法

新藤黃酸 （ gambogenic acid， GNA） 是從中藥藤黃中提取的抗腫瘤有效成分之一，體內外藥理實驗結果表明新藤黃酸有廣譜抗腫瘤活性，高效低毒， 有望開發(fā)成優(yōu)良的抗腫瘤藥［1～3］。 新藤黃酸臨床前研究中發(fā)現(xiàn)其凍干粉針有注射刺激性，為此本課題組制備了新藤黃酸 /羥丙基-β-環(huán)糊精 （新藤黃酸 /HP-β-CD） 包合物， 以改善其用藥刺激性， 為新藤黃酸的臨床應用提供更好的實驗基礎［4］。 為了評估新藤黃酸 /HP-β-CD包合物凍干粉針劑的臨床應用前景，本實驗采用 HPLC法測定了大鼠單次尾靜脈注射包合物后血漿中的新藤黃酸，并應用藥動學統(tǒng)計軟件擬合了新藤黃酸/HP-β-CD包合物在大鼠體內的藥動學過程并與新藤黃酸未包合制劑進行了比較［5-8］。

1 儀器、 試劑和實驗動物

1.1 儀器 LC-20AB高效液相色譜儀， （日本島津） 包括 SPD-M20A 紫外檢測 器； KQ-300B超聲清洗機 （昆山市超聲儀器有限公司）；AB135 電子天平 （ 德 國 METTLER TOLEDO公司）； LC-4016型低速離心機 （安徽中科中佳儀器有限公司）；XW-80A微型渦旋混合器 （上海滬西分析儀器廠有限公司）； Anke TGL-16GB高速離心機 （上海安亭科學儀器廠）。

1.2 藥品與試劑 新藤黃酸 （批號為 20120203，純度94.8%）、 注射用新藤黃酸凍干粉針 （批號為20130209， 規(guī)格： 15 mg/支）、 注射用新藤黃酸包合物 凍 干 粉 針 （ 批 號 為 20130416， 規(guī) 格： 15 mg/支）、 新藤黃酸對照品 （批號為 20120408， 純度 99.7%）、內標藤黃酸 （批號為 20121123， 純度97.1%） 均由安徽中醫(yī)藥大學現(xiàn)代中藥安徽省重點實驗室提供； HPLC所用試劑均為色譜純； 其他試劑均為分析純。

1.3 動物及給藥方式 SPF級 SD大鼠， 雌性，體質量 200 ～250 g， 由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供，所有動物于本實驗前禁食，自由飲水，室溫（20 ±2） ℃。 實驗采用單次尾靜脈給藥方式， 給藥劑量為 2 mg/kg， 給藥體積為 2 mL/kg，給藥質量濃度為1 mg/mL。

2 方法與結果

2.1 色譜條件［9］Hypersil ODS2 C18色譜柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm）； C18保護柱 （10 mm×4.6 mm， 5 μm）； 流動相為甲醇-0.1%磷酸水 （90 ∶10， V/V）； 體積流量為 1.0 mL/min； 檢測波長 358 nm； 柱溫 25 ℃。

2.2 對照品溶液及內標溶液配制

2.2.1 對照品溶液的制備 取新藤黃酸對照品 10 mg， 精密稱定， 置于 50 mL量瓶中用甲醇溶解并稀釋至刻度，將對照品貯備液用甲醇稀釋成質量濃度為 1.00、5.00、10.00、20.00、 50.00、 100.00 μg/mL的溶液備用。

2.2.2 內標溶液的制備 取藤黃酸 5 mg， 精密稱定， 置于50 mL量瓶中用甲醇溶解并稀釋至刻度，配置成質量濃度為 100.00 μg/mL的內標溶液。

2.3 血漿樣品預處理 取大鼠全血 3 500 r/min 離心 20 min 制備血漿， 用微量進樣器吸取 0.2 mL，置離 心 管 中， 加 甲 醇 和 內 標 藤 黃 酸 （ gambogic acid，GA）漩渦混合， 12 000 r/min 離心 10 min，分離上清液， 經(jīng) 0.45 μm微孔濾膜過濾， 進樣 20 μL測定。

2.4 方法學的驗證 取大鼠空白血漿 20 μL， 按“2.3”項方法， 將一定濃度的新藤黃酸標準溶液和內標溶液加入空白血漿中；取大鼠尾靜脈注射給藥后收集的全血， 同法操作。 按照 “2.1” 項下的色譜條件進樣分析，結果顯示，空白血漿中內源性物質不干擾新藤黃酸和內標的測定，新藤黃酸的保留時間為 8.6 min， 藤黃酸的保留時間為 12.3 min，見圖1。

圖1 新藤黃酸及內標的色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms for gambogenic acid（1） and dexamethasone gambogic acid（2） in rat plasma

2.5 標 準 曲 線 繪 制 取 大 鼠 空 白 血 漿 200 μL 6份， 分別加入配置好的對照品溶液 50 μL， 質量濃度依 次 為 1、 8、 16、 40、80、 160、 800 μg/mL，加 600 μL的 甲 醇， 40 μL內 標 溶 液， 渦 流 振 蕩1 min， 3 500 r/min 離 心 20 min， 上 清 液 用 0.45 μm有機膜過濾，棄初濾液，取續(xù)濾液 20 μL進樣， 進行 HPLC分析。 以新藤黃酸與內標物峰面積比 Ri為縱坐標， 新藤黃酸質量濃度為橫坐標， 求得標準曲線的方程為 Y=0.002 6X （r2=0.999 6），結果顯示的線性范圍為 1 ～800 μg/mL， 定量下限為 1 μg/mL（S/N＞10）。

2.6 精密度試驗 取大鼠空白血漿 100 μL 3份，分別加入新藤黃酸對照品高、中、低3個質量濃度 （分別為 3.02、 1.53、 0.43 μg/m L） ，按 “2.4” 項下方法處理后， 1 d 內分別測 5 次，計算日內精密度， 每次取 20 μL進樣，用樣品峰面積與內標峰面積比 Ri代入標準曲線， 計算得到的相應濃度， 3 份樣品的 RSD值分別為3.04%、 2.66%和 3.48%。 同樣的方法， 連續(xù)測定 3 d， 該 3份樣品的日間精密度分別為3.44%、 3.59%和 3.58%。

2.7 提取回收率試驗［10］取 5 份 100 μL大鼠空白血漿制得的上清液， 分別加20 μL不同質量濃度的新藤黃酸系列標準溶液， 加入甲醇溶液 300 μL及20 μL內標溶液， 混勻后進樣， 記錄樣品峰面積與內標峰面積比值 Ri， 用 Ri與稀釋后的樣品質量濃度作直線回歸，得到對照品的回歸方程；另取離心管加大鼠空白血漿 100 μL， 加入 20 μL的不同質量濃度的新藤黃酸對照品溶液 （分別為 3.02、1.53、 0.43 μg/m L）， 每一質量濃度進行 6 樣本分析。 加入甲醇溶液 300 μL及 20 μL內標溶液，漩渦 5 min， 3 000 r/min 離心 15 min； 取上清液過濾后進樣， 將樣品峰面積與內標峰面積比值 Ri代入對照品的回歸方程，得到相應質量濃度求得血漿中新藤黃酸的提取回收率。提取回收率=測得質量濃度/加入質量濃度 ×100%， 結果見表 1。

表1 大鼠血漿中新藤黃酸及內標的平均提取回收率Tab.1 M ean recoveries of gam bogenic acid and gambogic acid in rat p lasm a

2.8 血樣采集及測定 取健康成年 SD大鼠 12只，雌性，隨機分成2組，分別一次性尾靜脈注射新藤黃酸凍干粉針和新藤黃酸包合物凍干粉針，給藥劑量為 2 mg/kg， 給藥體積為 2 mL/kg， 給藥質量濃度為 1 mg/mL。 分別于給藥前和給藥后 1、 2、5、 7、9、12、20、 40、 60、 80 min 從眼眶靜脈取血0.4 mL， 置于肝素化離心管中， 每取 4 個血樣，給予大鼠生理鹽水灌胃，以保持血容量。按“2.2”項進行血漿處理， 進樣分析， 計算出各時間點血漿中的新藤黃酸的質量濃度。

2.9 參數(shù)分析 用 3p97 軟件進行新藤黃酸及新藤黃酸包合物在大鼠體內的藥代動力學模型的擬合。結果表明，新藤黃酸和新藤黃酸包合物在大鼠體內的藥物動力學規(guī)律均符合一室模型。主要藥動學參數(shù)見表2， 平均藥時曲線見圖 2。

3 討論

本實驗以甲醇-0.1%磷酸水 （90 ∶10，V/V）、檢測波長 358 nm、 柱溫 20 ℃測定大鼠血漿中新藤黃酸的質量濃度，新藤黃酸和內標的保留時間分別是 8.6 min 和 12.3 min， 本法具有分離度好、 保留時間合適等優(yōu)點，可以為檢測生物樣品中的新藤黃酸含量提供參考。

表2 單劑量注射新藤黃酸和新藤黃酸包合物后主要藥動學參數(shù)Tab.2 Pharmacokinetic param eters of gambogenic acid after i.v.adm inistration of single dose of gambogenic acid and gambogenic acid inclusion com p lex

圖 2 兩組大鼠給藥后體內新藤黃酸的平均血藥濃度-時間曲線Fig.2 Cure of p lasma concentration and time of gambogenic acid and gambogenic acid inclusion in rats

實驗數(shù)據(jù)表明新藤黃酸和新藤黃酸包合物在大鼠體內的藥物動力學規(guī)律均符合一室模型，新藤黃酸在大鼠體內代謝迅速，新藤黃酸經(jīng)包合后在一定程度上減慢了代謝。 經(jīng)配對 t檢驗， 受試樣品和參比樣 品 的 C0和 AUC0-80均 有 顯 著 性 差 異 （ P＜0.05）， 表明包合物與原料藥在大鼠體內為生物不等效制劑。注射部位的生理切片觀察發(fā)現(xiàn)包合物制劑沒有注射刺激性。

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Pharm acokinetics of gam bogenic acid inclusion comp lex in rats

HU Hai-xia， WANG Xiao-shan
（Pharmaceutical Department of Anhui University of Traditional Chinese Medicine， Hefei230031， China）

pharmacokinetics； gambogenic acid inclusion complex； HPLC

R969.1

： A

： 1001-1528（2014）03-0503-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.03.012

2013-06-15

“重大新藥創(chuàng)制” 科技重大專項 （2009ZX09103-399）； 安徽省高校優(yōu)秀青年基金項目 （2012SQRL106）

胡海霞 （1977—） ， 女， 碩士， 副教授， 研究方向： 制劑工藝。 Tel： 13966777656， E-mail： huhx6262@126.com