王贊，李光輝，羅惠波

（四川理工學(xué)院釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川自貢643000）

濃香型白酒窖泥厭氧細(xì)菌的分離鑒定

王贊，李光輝，羅惠波

（四川理工學(xué)院釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川自貢643000）

濃香型白酒的生產(chǎn)依賴于窖池，窖池的好壞取決于窖泥微生物，其中厭氧微生物尤為重要。為了認(rèn)識(shí)窖泥厭氧微生物，從濃香型白酒窖泥中分離純化得到3株厭氧細(xì)菌，對(duì)其進(jìn)行菌落觀察、鏡檢和生理生化檢測(cè)，參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行初步鑒定并確定其屬名。3株厭氧細(xì)菌分別為:Lactobacillus（乳桿菌屬）、Tsukamurella（束村氏菌屬）、Sporolactobacillus（芽孢乳桿菌屬）。

濃香型白酒；窖泥；厭氧細(xì)菌

好酒產(chǎn)于好窖，好窖依賴于好泥［1］。在生產(chǎn)濃香型白酒的窖池中，窖泥的好壞取決于其中微生物種群，優(yōu)質(zhì)的窖泥中含有豐富的有利于釀酒的微生物群，這一微生物生態(tài)群包括甲烷菌、厭氧異養(yǎng)菌、乳酸菌、己酸菌等多種微生物［2］。在酒醅入窖發(fā)酵過(guò)程中，窖泥中的厭氧細(xì)菌對(duì)酒醅的糖化，乙醇產(chǎn)生等起到了一定作用，其代謝產(chǎn)生的窖香香氣是構(gòu)成濃香型白酒窖香濃郁的重要組成部分［3］。許多高產(chǎn)己酸乙酯的細(xì)菌隸屬于厭氧菌，如巨大芽孢桿菌（Bacillusmegaterium）、梭狀芽孢桿菌（Bacillus fusiformis）及地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）等［4］。所以，窖泥中的厭氧細(xì)菌不僅對(duì)酒醅發(fā)酵起著重要作用，而且對(duì)濃香型白酒香味產(chǎn)生有重大作用。

本試驗(yàn)利用傳統(tǒng)的稀釋平板分離方法，結(jié)合厭氧培養(yǎng)的方式，從濃香型白酒的窖泥分離得到3株厭氧細(xì)菌。經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化特征，參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行初步鑒定確定其屬名。實(shí)現(xiàn)了對(duì)濃香型白酒窖泥中分離的厭氧細(xì)菌的初步鑒定，豐富了濃香型白酒窖泥微生物菌種庫(kù)，同時(shí)也為對(duì)濃香型白酒酒醅發(fā)酵過(guò)程中香味物質(zhì)的產(chǎn)生的研究提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

窖泥樣品∶采自瀘州鑫霸實(shí)業(yè)股份有限公司濃香型白酒發(fā)酵窖池2組2號(hào)窖池（窖齡30年），于窖底中心取樣，迅速放入?yún)捬鯕獯兄糜诒羞\(yùn)回，4℃保藏，盡快分析。

1.2 主要試劑

結(jié)晶紫、番紅、過(guò)氧化氫、孔雀綠、可溶性淀粉、NaOH（分析純）、KNO3（分析純）、K2HPO4（分析純），刃天青等購(gòu)自成都科龍?jiān)噭┕尽?/p>

培養(yǎng)基∶TSA培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博生物試劑公司；YP培養(yǎng)基∶5 g蛋白胨，1.5 g酵母膏，0.01 g FeSO4·7H2O，20 g瓊脂，溶解于1 L水中，PH=7.2；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；改良的CSEA培養(yǎng)基，將土壤冷水浸出液改為窖池底發(fā)酵水稀釋液；胰胨酵母瓊脂培養(yǎng)基（EG）。

1.3 主要儀器與設(shè)備

生物顯微成像系統(tǒng)（55i+Ds-SM-U1，日本NIKON公司），影像分析菌落計(jì)數(shù)儀（SCAN 1200法國(guó)），恒溫培養(yǎng)箱（MJ-250，上海和羽良公司），厭氧工作站（DG-250，英國(guó)DWS公司），F(xiàn)ATO高壓滅菌鍋（華通機(jī)電集團(tuán)有限公司）。

1.4 細(xì)菌的分離純化

1.4.1培養(yǎng)基的選擇

取少量樣品直接放入少量生理鹽水中，涂片染色直接鏡檢，指導(dǎo)培養(yǎng)基的選擇。選擇的結(jié)果用胰胨酵母瓊脂培養(yǎng)基（EG）進(jìn)行純化和保藏，篩選時(shí)可用TSA培養(yǎng)基、YP培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和胰胨酵母瓊脂培養(yǎng)基（EG）。

1.4.2菌體富集

按改良的CSEA培養(yǎng)基配方，配制450 mL液體培養(yǎng)基，分裝入3個(gè)三角瓶中，121℃滅菌15 min，待用；在厭氧工作站中，無(wú)菌條件取10 g窖泥，加入90 mL無(wú)菌水，充分搖勻，振蕩5～10 min，使泥樣充分打散，自然沉淀后取上清液；將準(zhǔn)備好的液體培養(yǎng)基煮沸10 min，放入?yún)捬豕ぷ髡?，冷卻后，立即接種10 mL窖泥上清液，搖勻。37℃厭氧培養(yǎng)3～4 d。

1.4.3菌種分離

在厭氧工作站中，取富集液1 mL，涂布于平板上，TSA培養(yǎng)基、YP培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和胰胨酵母瓊脂培養(yǎng)基（EG）四種培養(yǎng)基接三個(gè)平板，37℃培養(yǎng)3～4 d，挑單菌落，平板劃線37℃培養(yǎng)2～3 d。對(duì)每個(gè)平板的菌進(jìn)行菌落形態(tài)觀察和鏡檢，對(duì)各種菌歸類，接種于胰胨酵母瓊脂培養(yǎng)基（EG），平板劃線37℃培養(yǎng)2～3 d。

厭氧培養(yǎng)中選出的菌種進(jìn)行好氧和微好氧篩選∶將選出的菌種接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和胰胨酵母瓊脂培養(yǎng)基（EG）平板上，分別放到普通培養(yǎng)箱和帶有5%氧氣的氮?dú)獯信囵B(yǎng)，37℃培養(yǎng)3～7 d，觀察是否生長(zhǎng)。

1.4.4菌種的純化

將1.4.3選出的菌種，挑取單菌落，轉(zhuǎn)接于胰胨酵母瓊脂培養(yǎng)基（EG）平板，37℃培養(yǎng)3～4 d，依照此法轉(zhuǎn)接2～3次，進(jìn)行純化，根據(jù)菌落特征及革蘭氏染色鏡檢確認(rèn)后，挑取單菌落移入斜面，培養(yǎng)后備用。

1.5 生理生化鑒定

芽孢染色∶采用改良的Schaeffer—Fulton氏染色法［5］。

對(duì)分離菌種進(jìn)行革蘭氏染色、莢膜染色、接觸酶、甲基紅、淀粉水解、反硝化、產(chǎn)氨、抗酸和吲哚等實(shí)驗(yàn)［6］。

2 結(jié)果與分析

2.1 窖泥中細(xì)菌的分離純化

通過(guò)對(duì)瀘州鑫霸酒廠窖泥菌懸液富集，厭氧培養(yǎng)，從窖泥樣品中得到11株形態(tài)不同的菌株，經(jīng)過(guò)好氧和微好氧篩選，發(fā)現(xiàn)有4株菌能進(jìn)行好氧生長(zhǎng)，4株能在5%的微量氧氣生長(zhǎng)，從而排除這8株菌株，從窖泥樣品中得到3株厭氧細(xì)菌。

分離純化得到的3株厭氧細(xì)菌，分別編號(hào)為YJ-01、YJ-02、YJ-03，對(duì)其個(gè)體形態(tài)、菌落形態(tài)觀察（圖1）和革蘭氏染色鏡檢（圖2）。YJ-01在培養(yǎng)基上呈白色、濕潤(rùn)，易于挑取，無(wú)黏性，單體呈桿狀，革蘭氏染色呈陽(yáng)性。YJ-02菌落呈淺黃色、濕潤(rùn)，易于挑取，無(wú)黏性，單體為球狀，多個(gè)單菌粘連，革蘭氏染色呈陽(yáng)性。YJ-03在培養(yǎng)基上呈白色略透明、較濕潤(rùn)，易于挑取，無(wú)黏性，單體呈桿狀，革蘭氏染色呈陽(yáng)性。

2.2菌種生理生化檢測(cè)及菌種簽定結(jié)果

試驗(yàn)對(duì)3株分離純化好的厭氧細(xì)菌進(jìn)行生理生化檢測(cè)，并檢測(cè)芽孢、莢膜等檢測(cè)，結(jié)果見表1。根據(jù)生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》［7］對(duì)菌種進(jìn)行了初步的種類鑒定，鑒定結(jié)果分別為∶YJ-01為L(zhǎng)actobacillus（乳桿菌屬）、YJ-02為Tsukamurella（束村氏菌屬）、YJ-03為Sporolactobacillus（芽孢乳桿菌屬）。

3 結(jié)束語(yǔ)

利用傳統(tǒng)的分離純化方法，結(jié)合厭氧培養(yǎng)方式可以從窖泥中分離出厭氧細(xì)菌。經(jīng)對(duì)其菌落形態(tài)、單體形態(tài)進(jìn)行觀察和生理生化性質(zhì)檢測(cè)，參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，獲得分離得到的單菌株的屬名或種名。這一過(guò)程雖然傳統(tǒng)簡(jiǎn)單，但工作量大。由于實(shí)驗(yàn)在分離與純化這兩個(gè)過(guò)程中利用了很多厭氧的特殊處理方法。運(yùn)用樣品直接涂布，鏡檢觀察，可以在鏡檢中看到樣品中許多菌體形態(tài)及染色效果，指導(dǎo)培養(yǎng)基的選擇，本實(shí)驗(yàn)選出的培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和胰胨酵母瓊脂培養(yǎng)基（EG）；由于厭氧菌不易培養(yǎng)和生長(zhǎng)緩慢，先用添加環(huán)境營(yíng)養(yǎng)液的培養(yǎng)基進(jìn)行富集；對(duì)富集的菌懸液進(jìn)行分離篩選；在篩選過(guò)程中培養(yǎng)基一定要新鮮，每次篩選做好有氧檢測(cè)（指示劑為刃天青）；厭氧培養(yǎng)中選出的菌種進(jìn)行好氧和微好氧篩選，將選出的菌種接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和胰胨酵母瓊脂培養(yǎng)基（EG）平板上，分別放到普通培養(yǎng)箱和帶有5%氧氣的氮?dú)獯信囵B(yǎng)；同時(shí)對(duì)各株菌的生理生化檢測(cè)需要做大量的重復(fù)試驗(yàn)，確保獲得該菌株準(zhǔn)確的性質(zhì)。

本次試驗(yàn)應(yīng)用傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定方法，鑒定了獲得的3株厭氧細(xì)菌，確定了其屬名，分別為L(zhǎng)actobacillus（乳桿菌屬）、Tsukamurella（束村氏菌屬）和Sporolactobacillus（芽孢乳桿菌屬）。表明傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定方法對(duì)厭氧細(xì)菌進(jìn)行鑒定是切實(shí)可行的。這為大批量的菌種分離純化鑒定給出了一個(gè)經(jīng)濟(jì)、可行、實(shí)用的方法。如果為了更加深入的獲得菌種的信息，可以進(jìn)行Biolog自動(dòng)微生物鑒定［7］和分子生物學(xué)鑒定［4］等方法。

［1］胡承'應(yīng)鴻'許德富'等.窖泥微生物群落的研究及其應(yīng)用［J］.釀酒科技'2005(3）:34-38.

［2］陶勇'徐占成'李東訊'等.窖泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)演替及其與環(huán)境因子的相關(guān)性［J］.釀酒科技'2011(9）:42-46.

［3］黃治國(guó)'衛(wèi)春會(huì)'邊名鴻'等.濃香型白酒窖泥中兩株細(xì)菌的分離鑒定［J］.釀酒科技'2012(11）:36-38.

［4］趙輝'敞顏'王葳'等.濃香型白酒窖泥中高產(chǎn)己酸兼性厭氧細(xì)菌的分離鑒定［J］.食品科學(xué)'2012(5）: 177-182.

［5］宋瑛琳'王芳'田明.細(xì)菌芽孢染色方法比較的研究［J］.實(shí)驗(yàn)室科學(xué)'2012(2）:122-123.

［6］黃秀梨.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)［M］.北京:高等教育出版社'2006.

［7］布坎南R E'吉本斯N E.伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)［M］.8版.北京:科學(xué)出版社'1984.

Separation and Identification of Anaerobic Bacteria From Pit Mud of Luzhou-flavor Liquor

WANG Zan，LIGuanghui，LUO Huibo
（Liquor Making Biological Technology&Application of Key Laboratory of Sichuan Province，Sichuan University of Science&Engineering，Zigong 643000，China）

The production of Luzhou-flavor liquor depends on pits，and the quality of pits depends on pitmud microbes in which anaerobic bacteria is especially important.In order to realize the pitmud anaerobic bacteria，three strains of anaerobic bacteria are separated from pitmud of Luzhou-flavor liquor.After observing colony characteristics，microscopic performance and physiological-biochemical characteristics，referring to Bergey's manual of determinative Bacteriology，the three genus are preliminary identified and determined.The results show that the three strains of anaerobic bacteria are Lactobacillus，Tsukamurella，Sporolactobacillus separately.

Luzhou-flavor liquor；pitmud；anaerobic bacteria

Q93

A

1673-1549（2014）01-0016-03

10.11863/j.suse.2014.01.05

2013-09-02

四川省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)項(xiàng)目（07JY029-026）；釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目（NJ2012-06；NJ2013-08）

王贊（1977-），男，四川自貢人，講師，碩士生，主要從事發(fā)酵工程方面的研究，（E-mail）379304035@qq.com