黃堅　王玨　林珍云　商宏愷　馬林　卓廣超　馮國芳　張治芬

Toll樣受體2、3、4、9在胎盤組織中的表達及其與自發(fā)性早產的關系

黃堅王玨林珍云商宏愷馬林卓廣超馮國芳張治芬

【摘要 】目的探討Toll樣受體（TLRs）2、3、4、9在不同孕期胎盤組織中的表達及其與自發(fā)性早產的關系。 方法選擇自發(fā)性早產患者的胎盤樣本38份作為早產組（其中孕28-34周和孕35～36周各19份）。選擇同期正常妊娠自然分娩產婦的胎盤樣本38份（孕37-40周）作為對照組。采用real-time PCR法檢測兩組胎盤中TLR 2、3、4、9 mRNA的表達，并用Western blot法檢測胎盤中TLRs 2、3、4、9蛋白的表達，對結果進行統(tǒng)計學分析。 結果 （1）兩組孕產婦胎盤組織中均可檢測到TLRs 2、3、4、9的表達。（2）早產組胎盤組織TLR 2、3、9 mRNA的表達均高于對照組，兩者間差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；TLR4 mRNA的表達兩組間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。（3）早產組TLR 2、3、4、9的蛋白表達均高于對照組，兩者差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。（4）早產組中，28～34孕周組和35～36孕周組胎盤中TLRs mRNA表達量均無統(tǒng)計學差異（均P＞0.05）。 結論早產患者胎盤組織中TLRs過度表達，提示TLRs介導的母胎界面的免疫反應可能是啟動自發(fā)性早產的重要因素。

【關鍵詞 】Toll樣受體早產免疫反應胎盤

【 Abstract】ObjectiveTo investigate the expression of Toll-like receptors(TLRs)in placenta and its relationship with spontaneous preterm labor.MethodsThirty eight placental samples were collected from patients with spontaneous preterm labor(preterm group),including 19 of 28～34 week gestation,and 19 of 35～36 week gestation.Thirty eight placental samples from normal pregnancy and natural delivery(37～40 week)served as control group.The mRNA expressions of TLR 2,3,4,and 9 were detected by real-time quantitative polymerase chain reaction(RT-PCR);and the protein expression of TLR2,3,4,and 9 were evaluated by Western blot.ResultsThe mRNA expressions of TLR2,3,9 in preterm group were significantly higher than those in control group(P＜0.05),but not for TLR4(P＞0.05).The protein expressions of TLR2,3,4 and 9 also showed higher in preterm group than those in control group(P＜0.05).ConclusionThe over-expressed TLRs in preterm placental tissue suggests that the immune response mediated by TLRs in the maternal-fetal interface may be important factors to initiate spontaneous preterm labor.

【 Key words】 Toll-like receptorsPreterm birthImmune responsePlacenta

早產的發(fā)病機制至今尚未完全闡明。近年來研究表明，自發(fā)性早產的發(fā)生可能是促炎癥細胞因子介導母胎界面炎癥反應，使胎兒失去免疫保護并被母體內源性免疫排斥的結果。胎兒和母體對各種因素刺激產生的免疫內分泌反應可能是關鍵原因。目前認為，Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）在內源性免疫系統(tǒng)中起著重要作用，與自發(fā)性早產密切相關[1]。

TLRs是天然免疫中重要的模式識別受體，通過對病原微生物的病原相關分子模式的識別激活先天性免疫應答,在機體抵擋病原體感染中發(fā)揮重要作用。在母體胎盤界面，TLRs在免疫細胞和非免疫細胞（如滋養(yǎng)細胞及蛻膜細胞）上均有表達，表達模式隨妊娠階段的變化而改變[2]。本研究通過比較TLRs在早產及足月產的胎盤組織核酸及蛋白水平的表達，探討TLRs表達量的變化與自發(fā)性早產的關系及早產發(fā)生的免疫學機制。

1　對象和方法

1.1對象2011-08—2012-08在我院產科住院分娩的自發(fā)性早產患者38例，收集其胎盤組織共38份為早產組。其中孕28~34周早產患者的胎盤組織19份，孕35～36周早產患者的胎盤組織19份。早產組的初始癥狀均為胎膜早破，隨后出現(xiàn)陣發(fā)性腹痛，最終導致早產。早產組孕婦年齡20～35（27.89±1.09）歲；孕周28～36（33.95±0.93）周。選擇同期在我院正常妊娠足月自然分娩的孕婦38例，收集其胎盤組織38份為對照組。對照組孕婦年齡23～32（26.58±0.77）歲；孕周37～41（38.92± 0.34）周。兩組孕婦年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。兩組孕婦均無母體疾病，胎位均為頭位，產時無胎盤早剝、前置胎盤、胎兒生長受限、胎兒先天畸形以及頭盆不稱、胎兒窘迫等產科并發(fā)癥。

1.2方法

1.2.1標本取樣胎盤組織于分娩30min內取樣，組織大小約1cm×1cm×1cm，避開梗死、出血、鈣化灶。置于無菌試管內，存于-70°C冰箱備用。

1.2.2real-time PCR法檢測TLRs mRNA在胎盤組織中的表達取50~100mg組織加入1ml Trizol液（美國Invitrogen公司產品）按說明書提取組織總RNA，按逆轉錄試劑盒（日本Takara公司產品）說明書將總量約5μgRNA逆轉錄成cDNA，將2μl逆轉錄產物用于PCR擴增。用于RT-PCR的TLRs和GAPDH的引物見表1。

表1　用于RT-PCR的TLRs和GAPDH的引物

使用ABI PRISM 7500檢測系統(tǒng)（Applied Biosystems，US），程序設定為：（1）50℃2min；（2）95℃10min；（3）變性15s再延伸60s，循環(huán)40次；（4）熒光信號的收集是在每個延伸階段；（5）擴增結束后將溫度提高到60～95℃做產物的溶解曲線。用序列檢測軟件V1.3.1來確定樣本在C（t）值上的均值和差異性。數(shù)據(jù)分析以2-ΔΔCt的方法計算mRNA相對表達量，重復3次試驗取平均值。結果根據(jù)軟件的結果以圖形的形式表示。1.2.3Western blot法檢測TLRs蛋白在胎盤組織中的表達將組織冰上勻漿提取總蛋白，取20μl蛋白提取物加入5μl上樣緩沖液，按次序將樣品凝膠電泳（PAGE）膠中。100V電泳120min。PVDH膜80V電轉120min后再加入第一抗體鼠TLR2單克隆抗體或羊TLR3單克隆抗體或羊TLR4單克隆抗體或鼠TLR9單克隆抗體（美國Santa Cruz公司，濃度為1∶200）室溫孵育120min后，采用相對應的第二抗體：山羊抗鼠TLR2、TLR9 IgG（美國Santa Cruz公司，濃度為1∶4 000）或驢抗羊TLR3、TLR4 IgG（美國 Santa Cruz公司，濃度為1∶4 000）室溫孵育120min。最后經增強化學熒光發(fā)光法顯影（美國Millipore公司），并用Quantity One分析系統(tǒng)拍照分析。顯影拍照后陰性對照以PBS緩沖液沖洗5次，每次5min，再加入兔源抗人GAPDH第一抗體（美國Santa Cruz公司，濃度為1∶1 000）和山羊抗兔的第二抗體（美國Santa Cruz公司，濃度為1∶5 000），然后再次如前所述的方法進行顯影和拍照分析。TLR2、TLR3、TLR4和TLR9蛋白的相對分子量分別為90~100、117、95和180kDa。

1.3早產的診斷標準妊娠滿28至不滿37足周之間（196～258d）發(fā)生的分娩[3]。

1.4統(tǒng)計學處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料符合正態(tài)分布采用表示，先采取方差分析，方差齊則采用t檢驗，方差不齊則采用U檢驗，計量資料不符合正態(tài)分布則采用Wilcoxon秩和檢驗。

2　結果

2.1胎盤組織中TLRs mRNA的表達量運用realtime PCR技術結果顯示，兩組的胎盤組織中均有TLRs 2、3、4、9 mRNA的表達。對照組胎盤組織中，TLR4的mRNA表達量最高，TLR2的mRNA表達量最低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。早產組中，TLR4與TLR9的mRNA表達量無統(tǒng)計學差異，但都明顯高于TLR2與TLR3的mRNA表達量，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。早產組TLR2、TLR3、TLR9的mRNA表達量均較對照組高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），TLR4的mRNA表達量兩組間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），見圖1。早產組中，28~34孕周組和35~36孕周組的TLRs mRNA表達量均無統(tǒng)計學差異（均P＞0.05），見表2。

2.2兩組胎盤組織TLR2、3、4、9蛋白的表達對照組TLR 2、3、4、9蛋白表達量均無統(tǒng)計學差異（均P＞0.05），早產組中TLR9蛋白表達量最高，TLR2蛋白表達量最低，見圖2。早產組胎盤組織中TLR 2、3、4、9蛋白表達量均較對照組高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表3、圖3。

圖1　兩組胎盤組織中TLRs mRNA相對表達量的比較（*P＜0.05）

表2　TLRs在不同孕周早產胎盤組織中mRNA相對表達量的比較

圖2　兩組胎盤組織中TLRs蛋白表達量的比較

表3 兩組胎盤組織中TLR2、3、4、9蛋白（TLRs/GAPDH）表達的比較

3　討論

TLRs是一類進化保守的胚系編碼的模式識別受體，主要在具有免疫功能的組織中表達，通過識別并結合不同的細菌或病毒的分子結構，啟動機體的天然免疫和引起獲得性免疫反應[4]。在機體抵擋病原體感染中起到至關重要的作用。TLRs最初于上世紀80年代在果蠅身上發(fā)現(xiàn)，直到1996年才在人類組織中發(fā)現(xiàn)，到目前為止共鑒定出11種TLRs（TLR1－11）[5]。不同的TLRs受體通常與不同種類病原體的配體結合，而且可能直接對特殊種類病原體產生獲得性免疫反應。例如，TLR2可識別來源于細菌的二及三軟脂酰肽，TLR3識別病毒感染細胞釋放的雙鏈RNA,TLR4識別脂多糖成分脂質A，TLR9可以使免疫細胞對細菌中常見的胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸反應[6]。目前研究認為，感染所致的免疫平衡被打破是分娩過早啟動最常見的原因。生殖道感染在導致伴有胎膜早破的自發(fā)性早產方面起的作用可能遠大于目前的估計。

從免疫學角度而言,妊娠期胎兒作為同種異體移植物種植在母體，母體對胎兒產生特異性免疫耐受。胎兒能在子宮內保持其免疫原性的機制主要在于精密調節(jié)母胎界面細胞因子的水平[7]。研究表明，多種因素（尤其是感染）可以通過母體TLRs的介導,引起母胎界面促炎癥細胞因子上升，打破母胎間的免疫耐受，導致母體對胎兒產生免疫排斥，過早激活分娩機制而導致自發(fā)性早產[8]。目前，TLRs如何調節(jié)母體胎兒分界面的炎癥反應尚處于研究的起步階段，但越來越多的證據(jù)證明滋養(yǎng)層細胞可以通過TLRs受體的表達來識別病原體并作出應答[9-10]。胎盤作為母胎間的一個重要器官，是特殊的先天性免疫器官，在抵御外來病原菌入侵中起重要作用。研究胎盤上TLRs表達的變化有助于探討其與早產啟動之間的關系。Soboll等[5]已證實人類胎盤有TLR 1～10的表達。小鼠實驗發(fā)現(xiàn)其他身體部位的感染亦可增加胎盤內TLRs表達的增加，這種反應提示TLRs可能是母胎界面的一種敏感免疫保護機制[11]。Patni等[12]在足月順產及剖腹產的胎盤上發(fā)現(xiàn)TLR1~10的mRNA表達，在對胎盤組織進行培養(yǎng)，給予TLR2、3、4、5、7、8、9相應的激動劑刺激后，除CpG的刺激外，其余均能產生促炎癥細胞因子釋放，顯示這些受體是功能受體。本研究運用Real-Time-PCR和Western blot技術對早產組和對照組孕婦的胎盤組織中的TLRs進行檢測，結果證實兩組樣本在mRNA和蛋白水平上均有TLR 2、3、4、9的表達。

圖3　兩組胎盤組織中TLRs蛋白表達量的比較（*P＜0.05）

本研究結果發(fā)現(xiàn)，兩組胎盤上TLRs各種亞型的表達水平亦存在差異。早產組TLR2、3、9 mRNA的表達水平和TLR2、3、4、9蛋白的表達均明顯高于對照組。如圖1所示，早產組TLR4的mRNA表達量最高，且在早產組中的表達量保持相對穩(wěn)定，因此該亞型的分子結構可能是TLRs中相對保守的一種，并不輕易隨著周圍環(huán)境的變化而變化，它可能對維持TLRs基本功能起到重要作用。此外，早產組胎盤中TLR2、3、9的表達量都明顯增加，提示TLR2、3、9可能在早產啟動中起到了促進作用，其中早產組TLR2與TLR9的表達量增高約2倍，明顯高于TLR3在早產孕婦中的增量，因此TLR2和TLR9在誘發(fā)早產的機制中可能起到了更為重要的作用。圖2所示，TLR2、3、4、9的蛋白表達量在對照組中無統(tǒng)計學差異，提示經過蛋白修飾表達后，各亞型表達量保持相對一致的水平。而在早產組中，4種亞型均有明顯升高，提示4種TLRs亞型均在早產中發(fā)揮了介導感染的作用。而TLR4的mRNA表達量在早產組和對照組中無統(tǒng)計學差異，提示該亞型可能是在蛋白水平發(fā)揮作用，或者是TLR2、3、9的促進/激活下，進一步發(fā)揮的作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)，早產組TLRs 4種亞型的表達量并未因孕周的早晚而發(fā)生改變，如表2所示，更早孕周（28～34周）早產的胎盤組織中TLRs的表達量與接近足月孕周（35～36周）胎盤中的TLRs表達量相比并無統(tǒng)計學差異，其中機制尚難以解釋，設想TLR介導的免疫反應可能并非具有累積效應，也不是逐漸加重的，而更像是在短時間內發(fā)生后即導致了早產的發(fā)生。TLRs在早產的不同階段是否存在差異尚需大樣本實驗予以進一步闡明。

綜上所述，我們認為TLRs介導的母胎界面的免疫反應可能是自發(fā)性早產啟動的重要因素。研究結果支持“TLRs介導的早產生化級鏈模式學說”[13]。該學說認為，TLRs識別細菌主要成分和應激蛋白,從而破壞細胞、增加一系列促炎癥因子的生成。并且，由于生殖道的微生物感染往往導致絨毛膜羊膜炎，使胎膜脆性增加、局部張力下降，繼而可發(fā)生胎膜早破。這些促炎癥因子的相互作用，使中性粒細胞及巨噬細胞游移至母胎界面的量增加，過度的應激蛋白和微生物感染一旦超過母胎間免疫保護機制的閾值，就會破壞母胎間的免疫平衡，引起自發(fā)性早產。TLRs在早產免疫機制學說中的重要作用，為今后預防和治療早產提供了依據(jù)。

4　參考文獻

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（本文編輯：沈昱平）

收稿日期：（2014-01-07）

基金項目：浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科學研究基金（2009A162）

作者單位：310006杭州市第一人民醫(yī)院婦產科（黃堅、王玨、林珍云、商宏愷、馬林、馮國芳、張治芬），檢驗科（卓廣超）

通信作者：黃堅，E-mail：huangjian168@msn.com

Expression of Toll-like receptors 2,3,4,9 in placenta and its relation to spontaneous preterm labor

HUANG Jian,WANG Jue,LIN Zhenyun,et al.Department of Obstetrics and Gynecology,Hangzhou First People's Hospital,Hangzhou 310006,China