原晉波，趙 琳，董 超 *，史延茂，崔少飛

（1.河北工業(yè)大學(xué) 化工學(xué)院，天津 300100；2.河北省科學(xué)院生物研究所，河北 石家莊 050081）

蛹蟲草又名北冬蟲夏草、北蟲草，是我國名貴中藥材之一。蟲草素是蛹蟲草的主要活性成分，是一種真菌核苷抗生素，具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌、消炎等藥理作用[1-5]，由于蟲草素可以干擾細(xì)胞的DNA和RNA復(fù)制，所以在艾滋病治療方面也有一定的作用[6-7]。

在蛹蟲草中蟲草素的含量比較低，分子質(zhì)量小，分離提純成本高。所以現(xiàn)在還沒有蟲草素單品作為藥物的應(yīng)用。目前，國內(nèi)外許多科研工作者對蟲草素的分離提純工藝進(jìn)行了研究。大多數(shù)以索氏提取法、熱水浸提法，超聲波法以及超臨界萃取法等提取蟲草素[8-9]，但是從這些方法中得到的蟲草素或純度不高或生產(chǎn)成本高昂。為此，本實(shí)驗(yàn)采用離子交換樹脂來達(dá)到進(jìn)一步分離純化蟲草素的效果，高效液相色譜法[10-11]測定蟲草素含量，最終確定最佳工藝吸附條件。

首先對蛹蟲草中的蟲草素進(jìn)行了粗提，然后采用不同的吸附介質(zhì)對蟲草素進(jìn)行了吸附實(shí)驗(yàn)，篩選得到了較好的吸附材料陽離子交換樹脂001×16。根據(jù)吸附條件采用動力學(xué)模型描述了001×16對蟲草素的吸附過程，Langmiur等溫線和Freundlich 等溫線分別被用來描述此吸附系統(tǒng)吸附等溫線，其吸附能力和等溫線參數(shù)被估算，并對兩種擬合方式作了比較，為進(jìn)一步的蟲草分離純化工藝研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛹蟲草：河北省安國市中藥材市場；蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品：上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展公司；甲醇（色譜級）：默克化工技術(shù)（上海）有限公司；無水乙醇（分析純）：天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心；弱陽離子樹脂724、122，強(qiáng)陽離子樹脂001×16、001×14，大孔吸附樹脂D113、CD180：安徽三星吸附材料有限公司；鹽酸（分析純）：石家莊市試劑廠；氫氧化鈉（分析純）：天津市大陸化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

L-2000日立高效液相色譜：天美科技有限公司；FD-27冷凍干燥機(jī)：北京德天佑科技發(fā)展有限公司；JY92-II超聲波破碎機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；OM-130GB智能鼓風(fēng)干燥箱：歐邁（上海）科學(xué)儀器有限公司；Sartorius PB-10 pH計：浙江象牙縣石浦海天電子儀器廠；Sapphire C18色譜柱：美國Sepax technologies公司。

1.3 方法

1.3.1 蟲草粗提液制備

市場采購的蛹蟲草置于60 ℃烘箱內(nèi)處理2～3 h，然后粉碎過100目篩，得到均勻的蛹蟲草干粉。將水與蛹蟲草干粉按照比例20∶1（mL∶g）混合，常溫超聲2～3次[9]，濾紙過濾，收集濾液，定容，0.22 μm濾膜過濾，HPLC測定蟲草素含量。

1.3.2 液相色譜測定方法

L-2000高效液相色譜儀Sapphire C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，流速：1.0 mL/min；檢測波長：254 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：27 ℃；流動相：體積分?jǐn)?shù)為15%的甲醇；洗脫時間：35 min。

1.3.3 吸附介質(zhì)的預(yù)處理

離子交換樹脂的預(yù)處理：用1 mol/L HCl和NaOH反復(fù)浸泡，用1 mol/L NaCl、HCl和NaOH溶液進(jìn)行轉(zhuǎn)型，再用蒸餾水洗至中性，備用。

大孔吸附樹脂的預(yù)處理：用1 mol/L HCl和NaOH反復(fù)浸泡，用蒸餾水洗滌樹脂，再用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇浸泡樹脂6 h，用蒸餾水洗至無醇味，備用。

1.3.4 吸附介質(zhì)的篩選

將處理好的吸附介質(zhì)724、122、CD180、D113、001×14.5和001×16瀝干，分別稱取2 g瀝干樹脂與10 mL蟲草提取液加入三角瓶中，每組三個平行（下同）。測定吸附前后液體中蟲草素的含量，選擇吸附量最大的吸附介質(zhì)。

1.3.5 介質(zhì)吸附蟲草素的pH條件

選取介質(zhì)后，分別調(diào)整液體的pH值為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，測定上清液中蟲草素含量，得到最佳處理的pH條件。

1.3.6 靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線

取1 g處理好的陽離子樹脂001×16，加入15 mL蟲草素提取液，分別在20 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min、210 min、240 min、270 min取上清液，測定液體中蟲草素含量，繪制動力學(xué)曲線。

采用偽一級和偽二級動力學(xué)模型對蟲草素在001×16樹脂上的吸附動力學(xué)曲線擬合。

1.3.7 吸附等溫線

蟲草素粗提液的質(zhì)量濃度梯度為0.009 84 mg/mL、0.0295 mg/mL、0.049 2 mg/mL、0.070 mg/mL、0.088 9 mg/mL、0.1085mg/mL、0.1283mg/mL、0.1476mg/mL、0.1702mg/mL、0.201 mg/mL、0.254 mg/mL、0.306 mg/mL。

將處理好的瀝干樹脂0.5 g和不同濃度的蟲草素粗提液10 mL，分別在15 ℃、25 ℃、35 ℃靜態(tài)吸附3 h（根據(jù)動力吸附曲線選定），繪制吸附等溫線。

分別用Langmiur等溫線和Freundlich 等溫線[12-13]描述此吸附系統(tǒng)吸附等溫線，并估算其吸附能力和等溫線參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸線性方程的建立

以蟲草素質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。蟲草素的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=257 33x－126 736（R2=0.999 7），線性范圍是蟲草素質(zhì)量濃度10～320 μg/mL，此范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，在選定的色譜條件下蟲草素出峰時間在17 min左右。檢測結(jié)果蟲草素在蛹蟲草中的含量為1 035.7 μg/g，這與凌建亞等[9]的測量結(jié)果相似。

圖1 蟲草素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of cordycepin

2.2 樹脂的選擇

根據(jù)蟲草素的結(jié)構(gòu)分析，嘌呤環(huán)是強(qiáng)的吸電子基團(tuán)，氨基上的電子向環(huán)內(nèi)偏移，從而使得氨基帶部分正電荷，進(jìn)行離子交換吸附時優(yōu)先選擇陽離子交換樹脂。

計算吸附平衡時吸附量Qe方程式：

式中：Qe為吸附平衡時的吸附量，mg/g；Ce為吸附前蟲草素質(zhì)量濃度，mg/mL；Ci為吸附后蟲草素質(zhì)量濃度，mg/mL；M為吸附劑質(zhì)量，g；V為蟲草素粗提液的體積，mL。

實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證陰離子交換樹脂對蟲草素基本不吸附（數(shù)據(jù)未給出），在pH值為5，溫度為25 ℃，轉(zhuǎn)速180 r/min，蟲草素質(zhì)量質(zhì)量濃度為0.052 mg/mL條件下，常用的幾種陽離子樹脂的吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。由圖2可知，樹脂001×16對蟲草的吸附量較大，蟲草素的離子交換分離純化中優(yōu)先考慮樹脂的吸附量，這是樹脂選擇的關(guān)鍵性因素[14-15]，因此選擇此樹脂做進(jìn)一步研究。

2.3 pH條件對吸附量的影響

pH能夠直接改變吸附劑表面吸附位點(diǎn)和吸附質(zhì)離子的化學(xué)形態(tài)，從而影響吸附量。在pH值為5，溫度為25 ℃，轉(zhuǎn)速180 r/min，蟲草素質(zhì)量質(zhì)量濃度為0.052 mg/mL條件下，不同pH對吸附量的影響見圖3。由圖3可知，當(dāng)溶液pH＞9時，吸附量急劇下降，是因?yàn)閴A性增強(qiáng)時蟲草素的形態(tài)趨于中性分子，失去交換能力，且吸附位點(diǎn)的H+被中和而失去交換位點(diǎn)，最終導(dǎo)致低的吸附量降低；反之當(dāng)pH值為4～9時，蟲草素的陽離子形態(tài)得以增多，吸附量增大；但當(dāng)過酸時，H+濃度增加與蟲草素形成競爭吸附關(guān)系，吸附量減小。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，pH值為4時吸附量最大，因此選擇在此條件下研究動力學(xué)曲線和吸附等溫線。

圖2 不同型號樹脂的吸附能力Fig.2 Adsorption ability of different resins

圖3 不同pH條件下的吸附量Fig.3 Adsorption ability at different pH

2.4 靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線

001×16樹脂對蟲草素的吸附動力學(xué)曲線如圖4所示。由圖4可知，隨這時間的延長，001×16樹脂對蟲草素的吸附量逐漸增加，0～30 min吸附量的增加顯著，180 min后隨時間的延長，蟲草素的吸附量不再增加，這說明001×16樹脂對蟲草素的吸附達(dá)到飽和。

為找到合適的動力學(xué)模型描述001×16樹脂對蟲草素的吸附過程[16]，在pH值為5，溫度為25 ℃，轉(zhuǎn)速180 r/min，蟲草素質(zhì)量質(zhì)量濃度為0.052 mg/mL條件下，樹脂001×16吸附蟲草素的偽一級和偽二級動力學(xué)參數(shù)見表1，吸附動力學(xué)曲線見圖4。分別采用偽一級和偽二級動力學(xué)模型對圖4吸附動力學(xué)曲線進(jìn)行擬合，結(jié)果如圖5和表1所示，擬合方程分別為：

式中：Qe為吸附平衡時的吸附量，mg/g；Qt為時間t時的吸附量，mg/g；t為吸附時間，min。

式中：Qt為時間t時的吸附量，mg/g；t為吸附時間，min。

表1 001×16吸附蟲草素的偽一級和偽二級動力學(xué)參數(shù)Table 1 Kinetics fitting parameters of cordycepin adsorption onto 001×16 resin based on pseudo-first-order and pseudosecond-order

注：Qe，exp為實(shí)驗(yàn)值；Qe，cal為計算值；Kf為偽一級動力學(xué)模型的速率常數(shù)；Ks為偽二級動力學(xué)模型的速率常數(shù)。

由圖5可知，t/Qt 對時間t作圖得到良好的線性關(guān)系，該樹脂吸附蟲草素的動力學(xué)數(shù)據(jù)與偽二級動力學(xué)模型有更好的相關(guān)性，且按偽二級動力學(xué)方程計算的Qe，cal值于實(shí)驗(yàn)值Qe，exp非常接近，說明該樹脂吸附蟲草素的動力學(xué)行為更符合偽二級吸附動力學(xué)規(guī)律，由于偽二級動力學(xué)方程建立于化學(xué)反應(yīng)的機(jī)理假設(shè)，一定程度上說明化學(xué)吸附反應(yīng)對樹脂001×16吸附蟲草素的速率起到主要控制作用，其吸附起始的速率常數(shù)為h=16.69 μg/（g·min）。

圖4 001×16樹脂對蟲草素的吸附動力學(xué)曲線Fig.4 Kinetics plot of cordycepin sorption onto 001×16 resin

圖5 偽一級和偽二級動力學(xué)方程擬合001×16樹脂對蟲草素的動力學(xué)曲線Fig.5 Kinetics fitting plots of cordycepin sorption onto 0001×16 resin based on pseudo-first-order and pseudo-second-order

2.5 吸附等溫線

2.5.1 線性擬合

通過線性擬合和非線性擬合計算得到的等溫吸附參數(shù)對比見表2，吸附等溫線的線性擬合分別見圖6（c）及圖6（d）。根據(jù)擬合相關(guān)系數(shù)R2，在不同溫度條件下Langmuir（L）的R2均高于Freundlich（F）的R2且根據(jù)回歸平方和（regression square sum，RSS），L模型均低于F模型，說明用L模型描述此吸附等溫線更合適。

表2 不同溫度下線性擬合和非線性擬合吸附等溫線參數(shù)比較Table 2 Linear fitting and non-linear fitting adsorption isotherm parameters comparison at different temperature

2.5.2 非線性擬合

吸附等溫線的非線性擬合分別見圖6（A）及圖（B）。對于樹脂001×16對蟲草素的吸附等溫線，非線性擬合與線性擬合的擬合相關(guān)系數(shù)R2相近，但非線性擬合的RSS要遠(yuǎn)低于線性擬合的RSS，意味著實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)被更好的表述，即由非線性擬合計算得到的等溫線參數(shù)更加準(zhǔn)確。

線性擬合不能直接地關(guān)聯(lián)實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)點(diǎn)，計算所得的等溫線參數(shù)可能存在較大的誤差。在非線性擬合中RSS的計算關(guān)聯(lián)每一個原始實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，誤差分析涉及范圍內(nèi)的所有數(shù)據(jù)，而由非線性形式轉(zhuǎn)變到線性形式會導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)誤差失真。因此線性擬合和非線性擬合得到的方程對于最大吸附量Qm的預(yù)測有大的差異，在實(shí)驗(yàn)過程中預(yù)測值也會不同。實(shí)際中絕大數(shù)等溫吸附曲線是非線性的，誤差分布也會在線性轉(zhuǎn)換中改變，不同的軸向設(shè)置也會較大程度的影響R2值，這些最終影響等溫線參數(shù)的確定；而選用非線性擬合，由如上原因所導(dǎo)致的誤差就會避免。這表明獲取等溫吸附參數(shù)，非線性擬合方法更加準(zhǔn)確。

根據(jù)非線性擬合Langmiur方程，001×16樹脂對蛹蟲草提取液中蟲草素的吸附量在15 ℃、25 ℃、35 ℃時分別是1.296 33 mg/g、1.034 7 mg/g、0.775 56 mg/g，吸附量隨溫度升高而降低，表明此吸附過程是一個放熱過程，一定范圍內(nèi)低溫有利于吸附，高溫會抑制吸附，這對蟲草素的進(jìn)一步解吸提供思路。

圖6 等溫線的線性和非線性擬合曲線Fig.6 Linear fitting and nonlinear fitting curve of isotherm

3 結(jié)論

結(jié)果表明，蟲草素在001×16的陽離子交換劑上吸附最優(yōu)，且吸附等溫線符合Langmuir 方程。001×16對蟲草素的吸附受pH值的影響較大。其最佳的靜態(tài)吸附工藝為溶液pH值為4.0，溫度15 ℃，吸附時間3 h。在此條件下蟲草素的吸附量可以達(dá)到1.296 33 mg/g。

研究發(fā)現(xiàn)，選擇001×16陽離子吸附作為蛹蟲草中的蟲草素分離提純的初步步驟，既提高了分離效率，又為蟲草素進(jìn)一步的解析提供了思路，同時為后續(xù)的進(jìn)一步純化提供了基礎(chǔ)。

[1]LEE S Y,DEBNATH T,KIM S K,et al.Anti-cancer effect and apoptosis induction of cordycepin through DR3 pathway in the human colonic cancer cell HT-29[J].Food Chem Toxicol,2013,60(9):439-447.

[2]YAO L H,LI C H,YAN W W,et al.Cordycepin decreases activity of hippocampal CA1 pyramidal neuron through membrane hyperpolarization[J].Neurosci Lett,2011,503(3):256-260.

[3]CHENG Z,HE W,ZHOU X,et al.Cordycepin protects against cerebral ischemia/reperfusion injuryin vivoandin vitro[J].Eur J Pharmacol,2011,664(1-3):20-28.

[4]FAN D D,WANG W,ZHONG J J.Enhancement of cordycepin production in submerged cultures ofCordyceps militarisby addition of ferrous sulfate[J].Biochem Eng J,2012,60(5):30-35.

[5]LEE J H,YOON J Y,MYOUNG H,et al.Anti-cancer effects of cordycepin on oral squamous cell carcinoma proliferation and apoptosis in vitro[J].J Cancer Ther,2011,47(Suppl.1):S75.

[6]RAMESH T,YOO S K,KIM S W,et al.Cordycepin (3′-deoxyadenosine) attenuates age-related oxidative stress and ameliorates antioxidantcapacity in rats[J].Exp Gerontol,2012,47(12):979-987.

[7]MEYER C U,SCHMIDTKE P,ZEPP F,et al.Cordycepin is an immunoregulatory active ingredient ofCordyceps sinensis[J].Am J Chinese Med,2008,36(5):967-980.

[8]LING J Y,ZHANG G Y,LIN J Q,et al.Supercritical fluid extraction of cordycepin and adenosine fromCordyceps kyushuensisand purification by high-speed counter-current chromatography[J].Sep Purif Technol,2009,66(3):625-629.

[9]凌建亞，孫迎節(jié)，呂 鵬，等.蟲草屬真菌中蟲草素的超聲波提取及其毛細(xì)管電泳測定[J].菌物系統(tǒng)，2002，21（3）：394-399.

[10]李學(xué)軍，都興范，王林美，等.蛹蟲草中蟲草素的提取及純化工藝研究[J].生物技術(shù)，2012，22（5）：75-78.

[11]裴軼琨.超聲波提取HPLC-UV 法測定人工蛹蟲草中8 種核苷類物質(zhì)[J].中國釀造，2012，31（11）：163-166.

[12]WONG Y C,SZETO Y S,CHEUNG W H,et al.Adsorption of acid dyes on chitosan-equilibrium isotherm analyses[J].Process Biochem,2004,39(6):695-704.

[13]PROCTOR A,TORO-VAZQUEZ J F.The Freundlich isotherm in studying adsorption in oil processing[J].J Am Oil Chem Soc,1996,73(12):1627-1633.

[14]潘中華，貢成良，范雪峰.蠶蛹蟲草中蟲草素的提取及純化工藝研究[J].江蘇蠶業(yè)，2003，25（2）：13-15.

[15]李 剛，朱華李，毛先兵，等.蛹蟲草中蟲草素分離純化工藝研究進(jìn)展[J].重慶中草藥研究，2006，49（1）：51-54，29.

[16]MALL I D,SRIVASTAVA V C,AGARWAL N K.Removal of Orange-G and Methyl Violet dyes by adsorption onto bagasse fly ash-kinetic study and equilibrium isotherm analyses[J].Dyes Pigments,2006,69(3):210-223.