摘 要 研究了不同誘變時間（12 h、24 h、36 h、48 h、72 h）和誘變濃度（0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%）下，化學(xué)誘變劑甲基磺酸乙酯（EMS）對頭花蓼的誘變效應(yīng)。結(jié)果表明，EMS誘變頭花蓼種子的半致死劑量LD50為0.6%EMS處理24 h， 0.8 % EMS處理12 h。經(jīng)過處理的頭花蓼種子播種成苗后存在廣泛變異，且變異類型豐富，主要表現(xiàn)為：葉片增大、葉片縮小、葉片變薄、葉面積增加、葉比重提高，此5項指標(biāo)與對照相比差異達(dá)極顯著；植株生長速度加快、花青素含量降低，此2項指標(biāo)與對照相比差異顯著；此外還有葉片皺縮、葉片表皮毛增加等類型。

關(guān)鍵詞 頭花蓼；EMS；誘變；濃度；時間；變異

中圖分類號：Q319+.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-890X（2014）10-046-05

知網(wǎng)出版網(wǎng)址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/50.1186.S.20140611.1610.017.html 網(wǎng)絡(luò)出版時間：2014-6-11 16：10：00

頭花蓼（Persicaria capitata）又名四季紅，隸屬于蓼科（Polygonaceae）蓼屬（Polygonum）頭狀蓼組，為多年生草本植物，主產(chǎn)于貴州，在重慶南川、涪陵、北碚、武隆、巴南等地均有分布[1]。頭花蓼耐貧瘠土壤，花色粉紅且花期較長，可用于觀賞；作為貴州地區(qū)少數(shù)名族常用藥，頭花蓼在治療痢疾、腎盂腎炎、尿路結(jié)石等疾癥方面，具有一定效果[2]。此外，楊艷等[3]的研究表明，當(dāng)土壤中Cd處理濃度達(dá)到50 mg/kg時，頭花蓼地上部分對Cd的遷徙總量可達(dá)100.09 μg/plant，達(dá)到植物富集標(biāo)準(zhǔn)，說明頭花蓼可以作為修復(fù)Cd污染的先鋒植物。針對當(dāng)前園林土壤重金屬嚴(yán)重污染的情況，頭花蓼作為一種景觀地被植物種質(zhì)資源，在園林中的應(yīng)用顯得極為重要。

頭花蓼是一種具有綜合利用開發(fā)價值的園林植物。目前，對頭花蓼的研究主要集中在對其化學(xué)成分的分析上，而在誘變育種方向的研究較少。為充分發(fā)掘其潛在價值，本研究以甲基磺酸乙酯（EMS）為誘變劑，研究不同濃度EMS和處理時間對頭花蓼種子發(fā)芽以及成苗的影響，同時希望篩選出一批有育種價值的突變材料，以期為頭花蓼的選育及園林應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

頭花蓼成熟種子，采自西南大學(xué)園林植物遺傳育種基地，采集后種子在干燥避光處存放[3]。

甲基磺酸乙酯（EMS）購自美國SIGMA公司。

1.2 方法

1.2.1 EMS誘變處理方法

用0.01 mol/L的磷酸緩沖液（Na2HPO4·12H2O-NaH2PO4·H2O，pH=6.5）作為溶劑，配制質(zhì)量濃度為0（CK）、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%的EMS溶液，處理時間為12 h、24 h、36 h、48 h和72 h，依照完全隨機設(shè)計得出20個處理（表1）。按10粒種子1 mL誘變劑的比例在4℃避光條件下浸種，處理結(jié)束后的種子經(jīng)流水沖洗24 h，點播于鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，每個處理3次重復(fù)，每次重復(fù)50粒。培養(yǎng)條件為人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)25℃暗光發(fā)芽[4]，從置放當(dāng)日起，每日上午9時記錄當(dāng)天發(fā)芽數(shù)，當(dāng)發(fā)芽數(shù)連續(xù)3d不再變化時即視為發(fā)芽結(jié)束[5]，統(tǒng)計發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)，其中：發(fā)芽率=發(fā)芽結(jié)束時的發(fā)芽總數(shù)/供試種子數(shù)×100%，發(fā)芽勢=開始發(fā)芽后連續(xù)3 d的發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%，發(fā)芽指數(shù)=∑Gt/Dt（Gt為t時間內(nèi)的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)）[6]。

將所有萌發(fā)的種子移栽至16 cm×8 cm的塑料盒中，培養(yǎng)基質(zhì)由腐殖土、“椰糠+稻殼”、細(xì)田土按1∶1∶1比例組成，基質(zhì)厚度為8 cm。頭花蓼生長期間溫室溫度控制在18～25℃，濕度≥75%，視土壤缺水程度不定期澆水，保證土壤持水量在70%左右[7]，生長期間溫室光照均勻，強度為2000～3500 lx。待誘變發(fā)芽后的頭花蓼正常生長60 d時進行變異測定[8]。

1.2.2 變異材料的確定及處理方法

（1）觀察形態(tài)變異；（2）將變異材料按變異類型進行分類，進行數(shù)據(jù)采集；（3）制作變異材料切片，在LEICA DM 1000顯微鏡下觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)；（4）提取花色變異材料花青素，采用分光光度法測定花青素量。

用AM300掃描式手持葉面積儀測定葉長、葉寬、葉面積，每個處理重復(fù)10次，所取樣本均位于植株的同一部位；直尺測量節(jié)間長，估讀至0.1 mm，重復(fù)10次；采用烘干稱重法測定葉比重及葉片含水量，重復(fù)3次，用浸提法測量花青素含量，重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS19.0軟件進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理條件下EMS對種子發(fā)芽的影響

從圖1可知，不同EMS濃度和EMS處理時間對頭花蓼種子發(fā)芽具有顯著影響，在同一處理時間下，與對照組相比，實驗組發(fā)芽率隨處理濃度的變化呈現(xiàn)“低促高抑”現(xiàn)象。低濃度的化學(xué)誘變劑（<0.2%）能夠促進頭花蓼種子萌發(fā)，且顯著（P<0.05）提高種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢及發(fā)芽指數(shù)（圖1～圖3）。隨著EMS濃度的逐漸提高（≥0.4%），種子發(fā)芽開始受到抑制，當(dāng)EMS濃度為0.8%、處理時間為12 h時，頭花蓼種子的相對發(fā)芽率接近40%，達(dá)到對照組發(fā)芽的一半；當(dāng)EMS濃度為0.8%、處理時間為48 h時，頭花蓼種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)均達(dá)到最低值，種子生長活力在高濃度誘變劑處理下顯著降低（P<0.05）。在預(yù)備實驗中，當(dāng)EMS濃度為2.0%時，在各時間處理下頭花蓼種子均不發(fā)芽，可見高濃度EMS完全抑制了頭花蓼種子的萌發(fā)。

當(dāng)EMS濃度一定，處理時間在12～48 h時，實驗組種子發(fā)芽率隨處理時間的延長而降低（圖1）。在0.2%濃度下，當(dāng)誘變時間增長為72 h時，經(jīng)過處理的頭花蓼種子發(fā)芽率不降反增，72 h處理組的種子發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)均達(dá)到了本實驗水平下的最大值（圖2～圖3），與對照相比，達(dá)到極顯著差異（P<0.01），表現(xiàn)出了強烈的生長活力，這一結(jié)果很可能與種子打破休眠萌發(fā)的過程有關(guān)。正如所知，種子發(fā)芽除了需從胚內(nèi)得到養(yǎng)分供應(yīng)外，還極易受外界環(huán)境影響，有文獻(xiàn)提出，長時間的低溫浸種環(huán)境可能會刺激細(xì)胞內(nèi)與發(fā)芽相關(guān)的酶的活性[7]，從而增強種子的成活率。在本實驗中，經(jīng)過4℃環(huán)境下72 h的誘變浸種，種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢以及發(fā)芽指數(shù)與對照相比都得到提高。此外，在以磷酸緩沖液作為空白處理的對照組中，經(jīng)過72 h浸種的CK5發(fā)芽率和發(fā)芽勢明顯高于經(jīng)過12 h浸種的CK1，可見，低溫浸種可在一定程度上提高頭花蓼種子的萌發(fā)。

2.2 苗期分析

待頭花蓼植株生長60 d后觀察發(fā)現(xiàn)，植株產(chǎn)生了廣泛的變異。

2.2.1 葉面積變化

觀察發(fā)現(xiàn)，其中1株突變體的葉片面積增長至16.520 cm2，而對照組平均葉面積僅為8.971 cm2，差異達(dá)到極顯著水平（P<0.01）。葉長葉寬與對照相比有顯著變化，突變體的葉片長度可增長至6.58 cm，對照組平均葉長僅為4.36 cm，差異達(dá)到極顯著水平（P<0.01）；而縮小突變體葉片長度僅為3.23 cm，與對照相比縮小顯著（P<0.05）。

2.2.2 株高增加

誘變可使部分植株株高增至32.03 cm，相比對照組18.44 cm的平均株高，差異達(dá)到極顯著水平（P<0.01）。

2.2.3 葉片皺縮

經(jīng)化學(xué)誘變劑EMS處理后，頭花蓼在幼苗期普遍發(fā)生葉片皺縮現(xiàn)象，是此次觀察中出現(xiàn)最多的變異類型（表1），大量細(xì)胞團從葉面中鼓起，造成葉片不正常突起或蜷縮（圖4），部分植株在生長一段時間后皺縮程度降低或自動消失。

2.2.4 葉表絨毛

在誘變育種中關(guān)于誘變導(dǎo)致植株葉片表面有毛或無毛的變異，有非常多的報道[9]。與對照相比，本實驗中出現(xiàn)了大量的表皮毛增多變異類型（圖4、圖5）。

2.2.5 葉色

經(jīng)誘變處理的頭花蓼種子萌發(fā)后，葉片顏色變?yōu)闇\綠（圖4）。由于對照株與誘變株在生長期間環(huán)境條件完全一致，因此可以認(rèn)為對照株與誘變株的葉片顏色差異是誘變處理導(dǎo)致的遺傳變化。

用分光光度法測定了25個處理的葉片花青素含量（圖6），結(jié)果顯示，對照株葉片的花青素含量較高（1～5號），為0.9115%（鮮樣），處理組有2株花青素含量（12號、15號）提高，與對照相比差異顯著，其余各株花青素含量下降，與對照相比差異不顯著。

有研究認(rèn)為，EMS的傷害會減弱大部分植株對光照的敏感性[9]，而敏感性的降低則使植株花青素的合成受到阻礙，在頭花蓼葉片中的含量降低。

2.2.6 生長抑制

部分植株誘變后生長受到明顯抑制，表現(xiàn)為誘變組幼苗在一定時期內(nèi)的生長速度與對照組相比有極顯著的滯緩現(xiàn)象（P<0.01）。在頭花蓼的生長旺盛期，每5 d測量誘變組和對照組的生長節(jié)數(shù)和節(jié)長，觀測數(shù)據(jù)表明，高濃度（0.8%）EMS對植株的生長抑制極為顯著，經(jīng)過30 d生長后，對照組平均生長節(jié)數(shù)為5，平均節(jié)長為24.504 mm，0.8%誘變組的生長節(jié)數(shù)為3，節(jié)長平均增加5.332 mm（圖7），與對照相比，差異達(dá)到極顯著（P<0.01），而低濃度（<0.8%）EMS誘變對植株的生長抑制不顯著。

2.2.7 花粉育性

實驗表明，化學(xué)誘變劑EMS可能對花粉造成不育或半不育性育性影響。其中一個不育株系，柱頭發(fā)育正常，花藥干癟，套袋自交不能結(jié)實，但以正常株對其授粉卻能正常結(jié)實。

3 討論

確定適宜EMS處理濃度和時間是化學(xué)誘變育種的關(guān)鍵工作，通常采用半致死劑量作為標(biāo)準(zhǔn)。本實驗中，使誘變組植株成活率達(dá)到對照植株成活率一半的誘變處理為：EMS濃度0.6%浸種時間24 h，EMS濃度0.8%浸種時間12 h。根據(jù)苗期觀察，經(jīng)過12 h、濃度0.8%EMS處理的頭花蓼生長受到顯著抑制，植株成活率低，成活植株生長幼小且不育，而經(jīng)過24 h、0.6%EMS處理的頭花蓼植株成活率高，突變頻率高，突變體易于選擇，誘變篩選效果好。根據(jù)處理后的植物變異情況，選擇EMS濃度0.6%、浸種時間24 h為本實驗最佳誘變處理。

在對突變體的篩選中，后期共篩選出葉面積增大型、葉片多絨毛型、葉片皺縮型、植株生長速度加快型、花青素含量降低型等變異株。本實驗僅從生理學(xué)角度對誘變植株進行了篩選和鑒定，缺少分子水平上的驗證，對變異植株M2代的觀察也沒有開展，使結(jié)果具有一定的局限性，有待進一步研究的驗證和完善。

參考文獻(xiàn)

[1]董力，王海洋.頭花蓼4個野外居群生物量及分枝格局研究[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報2011，24（1）：253-257.

[2]楊艷，吳宗萍，張敏，等.頭花蓼對重金屬Cd 的吸收特性與累積規(guī)律初探[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境保護，2010，29（11）：2094-2099.

[3]Greene E A，Codomo C A，Taylor N E，et a1.Spectrum of chemically induced mutations from a large scale reverse genetic screen in Arabidopsis[J].Genetics，2003，164（2）：731-740.

[4]孫長生，韓見宇，楊錦綱，等.頭花蓼種子發(fā)芽生物學(xué)特性研究[J].現(xiàn)代中藥研究與實踐，2005，19（2）：19-22.

[5]熊慶娥.植物生理學(xué)實驗教程[M].成都：四川科學(xué)技術(shù)出版社，2003：551.

[6]陳紅，韓曉瑩.超低溫保存對貴州酥李種子生理生化特性的影響[J].天津農(nóng)業(yè)學(xué)報， 2013，19（5）：1-4.

[7]徐剛，尹春英，牟東嶺.甲基磺酸乙酯（EMS）處理對麻瘋樹（Jatropha Curcas L.）萌發(fā)種子的生理效應(yīng)[J].種子，2010，29（10）：49-53.

[8]薛惠丹，李周岐.花椒愈傷組織EMS誘變及變異研究[J].西北林學(xué)院學(xué)報，2012，27（2）：98-101.

[9]原小燕，李加納，劉列釗.EMS對油菜種子萌發(fā)的影響[J].西南師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2010，35（3）：217-221.

（責(zé)任編輯：丁志祥）