卓廣超　沈俊婭　朱華　冷建杭　丁禹　汪燕　鄭輝　丁曉霞

多重耐藥大腸埃希菌質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥性的研究

卓廣超沈俊婭朱華冷建杭丁禹汪燕鄭輝丁曉霞

【摘要】目的了解臨床收集的多重耐藥大腸埃希菌克隆播散狀況及質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥性的特性。方法通過K-B紙片法明確細(xì)菌耐藥譜，脈沖場凝膠電泳（PFGE）進(jìn)行耐藥菌株的克隆分型，了解其克隆播散情況，通過質(zhì)粒接合實(shí)驗(yàn)獲得耐藥性質(zhì)粒的接合菌，用PCR方法篩選接合菌株的常見耐藥基因，并利用S1酶切質(zhì)粒再進(jìn)行PFGE的方法判讀分析質(zhì)粒的分子大小，分析菌株間的質(zhì)粒水平遷移狀況。結(jié)果臨床分離95株大腸埃希菌均為多重耐藥菌，對青霉素類、頭孢菌素類、喹諾酮類、四環(huán)素類等藥物顯示出廣泛耐藥性，PFGE分型顯示克隆傳播趨勢不明顯。耐藥菌株常攜帶可接合性耐藥質(zhì)粒，質(zhì)粒分子量大小分布在40～330kb，編碼多種對青霉素類、頭孢菌素類等藥物耐藥的耐藥基因，包括CTX-M型、TEM型β-內(nèi)酰胺酶基因，以及質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮耐藥基因qnr等等。結(jié)論臨床大腸埃希菌多重耐藥性嚴(yán)重，耐藥性的快速傳播已非同源克隆細(xì)菌的簡單播散，可接合質(zhì)粒造成的耐藥基因水平轉(zhuǎn)移可能起到了相當(dāng)重要的作用。

【關(guān)鍵詞 】大腸埃希菌多重耐藥性質(zhì)粒

大腸埃希菌是醫(yī)院獲得性感染常見病原菌，其耐藥機(jī)制復(fù)雜，包括常見的獲得水解酶、靶蛋白突變及外排泵異常表達(dá)等[1]。質(zhì)粒在大腸埃希菌的耐藥形成和傳播過程中扮演了非常重要的角色。耐藥性質(zhì)粒目前在臨床病原菌中非常常見，由于質(zhì)粒很容易捕獲外來基因片段或者和外源DNA整合，因此進(jìn)化的速度很快，其分子量大小可以達(dá)到數(shù)十甚至上百kb[2]。常見的臨床病原菌攜帶的耐藥質(zhì)粒大多為可接合質(zhì)粒，即通過性菌毛相互接觸可以將遺傳物質(zhì)（通常是質(zhì)粒DNA）從供體菌轉(zhuǎn)移到受體菌[3]。本研究利用臨床收集的大腸埃希菌，通過藥敏實(shí)驗(yàn)、脈沖場凝膠電泳（PFGE）、質(zhì)粒接合實(shí)驗(yàn)、PCR篩選等方法分析菌株間的質(zhì)粒水平遷移狀況及質(zhì)粒接合對耐藥性的轉(zhuǎn)移作用。

1　材料和方法

1.1菌株95株分離自我院2009-01—12住院患者，符合多重耐藥菌判斷標(biāo)準(zhǔn)的大腸埃希菌，菌株來源標(biāo)本包括全血、痰液、尿、分泌物、腹水、腦脊液等，菌種確認(rèn)采用的是生物梅里埃公司的Vitek菌種鑒定儀。多重耐藥菌判斷標(biāo)準(zhǔn)：對于青霉素類、含抑制劑β-內(nèi)酰胺類、頭孢菌素類、碳青霉烯類、氨基糖苷類、喹諾酮類6類典型的抗菌藥物，如果有其中3類或者3類以上抗菌藥物耐藥，認(rèn)為其為多重耐藥菌。

1.2方法

1.2.1質(zhì)粒接合通過濾膜法進(jìn)行質(zhì)粒接合實(shí)驗(yàn)，供體菌為臨床分離多重耐藥大腸埃希菌，受體菌為利福平耐藥的大腸埃希菌菌株EC600。分別用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)供體菌和受體菌4h后，按1∶1混合，取20μl混合液點(diǎn)在0.22μm孔徑GSWP型硝化纖維素膜上（美國Millipore公司），將纖維素膜放在含有50μg/ml氨芐青霉素和700g/ml利福平的MH平板上過夜培養(yǎng)，篩選出陽性菌落克隆即為成功接收質(zhì)粒的受體菌。

1.2.2藥敏實(shí)驗(yàn)對臨床分離大腸埃希菌通過K-B紙片法進(jìn)行以下藥物的藥敏實(shí)驗(yàn)：阿米卡星、復(fù)方新諾明、美羅培南、亞胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢吡肟、頭孢他啶、頭孢唑林、氨芐西林、四環(huán)素、氨曲南、環(huán)丙沙星、哌拉西林、慶大霉素、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢噻肟、頭孢西丁、阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林/舒巴坦、頭孢呋辛。藥敏折點(diǎn)判斷標(biāo)準(zhǔn)參考臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所文件（CLSI，2012），標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922作為藥敏實(shí)驗(yàn)質(zhì)控菌株。

1.2.3PFGE分型對臨床分離大腸埃希菌進(jìn)行PFGE分子分型，取2ml培養(yǎng)后菌液進(jìn)行低熔點(diǎn)膠包埋，再經(jīng)過蛋白酶K和內(nèi)切酶XbalI的酶切，PFGE電泳的條件是：6V/cm，脈沖間隔時(shí)間5～20s，14℃，0.5×TBE，電場角度120°，總時(shí)間為24h；PFGE條帶只有3個(gè)或3個(gè)以下差異認(rèn)為它們是具有同源關(guān)系的相近克隆。PFGE所用marker為沙門菌Braenderup血清型H9812菌株酶切產(chǎn)物[4]。

1.2.4S1酶切鑒定質(zhì)粒大小細(xì)菌包埋后用S1核酸酶（TAKARA公司）1μl于120μl體系中進(jìn)行酶切，37℃水浴50min，再進(jìn)行PFGE，PFGE電泳條件為6V/cm，脈沖間隔時(shí)間2.16～63.8s，14℃，0.5×TBE，電場角度120°，總時(shí)間為20h。S1核酸酶僅可降解細(xì)菌染色體DNA而保留環(huán)狀的質(zhì)粒DNA，并促使質(zhì)粒DNA脫離超螺旋狀態(tài)，再經(jīng)過PFGE電泳后可精確讀出質(zhì)粒分子量大小。1.2.5耐藥基因的PCR擴(kuò)增篩選利用細(xì)菌煮沸法制備DNA模板，PCR擴(kuò)增篩選常見耐藥基因，包括blaCTX-M-1、blaCTX-M-9、blaTEM、blaSHV[5]、blaKPC[6]、blaDHA[7]、qnrA、qnrB、qnrS、aac（6＇）-Ib（可同時(shí)擴(kuò)增出aac（6＇）-Ib-cr）[8]及armA[9]，所用引物序列、擴(kuò)增片段長度及退火溫度見表1。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均錄入Microsft Office Excel 2003表格，部分結(jié)果采用百分?jǐn)?shù)（%）表示。PFGE結(jié)果膠圖使用BioNumerics軟件進(jìn)行同源關(guān)系分析。

表1　PCR擴(kuò)增所用引物序列、擴(kuò)增片段長度及擴(kuò)增時(shí)的退火溫度

2　結(jié)果

2.1臨床分離菌株藥敏結(jié)果臨床分離95株大腸埃希菌均為多重耐藥菌，耐藥情況非常嚴(yán)重（表2），氨芐西林的耐藥率為100%，對頭孢菌素的耐藥率也很高，三代頭孢菌素頭孢噻肟的耐藥率達(dá)到了93.7%，四代頭孢菌素頭孢吡肟的耐藥率也達(dá)到了88.4%。含抑制劑的頭孢菌素保持了較低的耐藥率，但整體敏感性也明顯下降，有相當(dāng)比例的菌株達(dá)到了中介，例如頭孢哌酮/舒巴坦的耐藥率雖只有21.1%，但中介的比例卻占了36.8%，使得非敏感菌株達(dá)到了較高的57.9%。頭孢西丁的敏感性尚可，敏感菌株占68.4%，而氨曲南的敏感率只有8.4%。碳青霉烯類藥物美羅培南和亞胺培南作為治療多重耐藥陰性菌的“王牌”藥物雖然保持了較高的敏感性，但也出現(xiàn)了3株耐藥菌株，給臨床耐藥菌的治療敲響了警鐘。氨基糖苷類藥物阿米卡星的耐藥率只有17.9%，可以作為臨床治療的又一選擇，而喹諾酮類藥物環(huán)丙沙星以及復(fù)方新諾明、四環(huán)素等藥物耐藥率都超過了80%，臨床治療效果已大大下降。

2.2PFGE分子分型結(jié)果77株大腸埃希菌成功進(jìn)行了PFGE分型，結(jié)果顯示這些臨床分離株的脈沖型非常分散（圖1），條帶一致的同一克隆出現(xiàn)很少，具有同一克隆型的菌株數(shù)最多不超過4株。說明本研究收集菌株基本為散發(fā)克隆，只有臨床上小范圍的耐藥傳播克隆株，但耐藥性傳播更重要的原因已變成耐藥基因在菌株間的水平遷移，使得各種不同克隆型菌株都演變成臨床多重耐藥菌。

2.3可接合性質(zhì)粒的大小分布95株大腸埃希菌中有73株成功獲得了攜帶耐藥質(zhì)粒的接合菌，占總菌株數(shù)的76.8%，73株接合菌中，表型產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶（ESBLs）菌株共64株，占87.7%，接合質(zhì)粒通過S1酶切再PFGE電泳后可精確判讀出質(zhì)粒大小，大部分菌株僅攜帶一個(gè)可接合性質(zhì)粒，有10株接合菌攜帶有兩個(gè)質(zhì)粒，質(zhì)粒大小在40～330kb（圖2）。質(zhì)粒的大小表現(xiàn)出了很強(qiáng)的多態(tài)性，即使是在菌株脈沖型相同的情況下，它們所攜帶的質(zhì)粒大小也差別明顯。

2.4耐藥基因的PCR篩查對所有73株接合菌進(jìn)行了耐藥基因的PCR擴(kuò)增篩選，篩選耐藥基因包括blaCTX-M-1、blaCTX-M-9、blaTEM、blaSHV、blaKPC、blaDHA、qnrA、qnrB、qnrS、aac（6＇）-Ib及armA，篩選結(jié)果（表3）顯示有72株接合菌攜帶blaTEM，是播散最廣的β-內(nèi)酰胺酶，除此之外，CTX-M型β-內(nèi)酰胺酶出現(xiàn)得也較多，對于大腸埃希菌來說CTX-M型β-內(nèi)酰胺酶大多為攜帶CTX-M-9組，共37株，CTX-M-1組只有6株。其它耐藥基因攜帶情況分別為：blaSHV 2株、blaDHA 3株、qnrB 3株、qnrS 4株、aac（6＇）-Ib 12株，沒有發(fā)現(xiàn)攜帶qnrA、blaKPC和armA的菌株。

表3　73株接合菌攜帶耐藥基因情況

3　討論

臨床多重耐藥菌的泛濫已給感染性疾病的治療帶來了很大難題，尤其對于革蘭陰性菌來說，多重耐藥大腸埃希菌已經(jīng)占據(jù)了臨床分離耐藥菌的首位。本研究收集來自同一家三級甲等醫(yī)院的95株大腸埃希菌，通過藥敏實(shí)驗(yàn)明確其耐藥譜，并采用PFGE進(jìn)行耐藥菌株的克隆分型，了解其克隆播散情況，再通過質(zhì)粒接合實(shí)驗(yàn)，獲得耐藥性質(zhì)粒的接合菌，用PCR方法篩選接合菌株的常見耐藥基因，并利用S1酶切質(zhì)粒再進(jìn)行PFGE的方法判讀質(zhì)粒的分子大小，分析菌株間的質(zhì)粒水平遷移狀況及質(zhì)粒接合對耐藥性的轉(zhuǎn)移作用。

所有菌株都對3類或3類以上抗菌藥物耐藥，且對氨芐西林全部耐藥。它們對頭孢菌素類顯示了很高的耐藥性，而對含抑制劑的頭孢菌素保持了一定的敏感，說明大部分菌株均為產(chǎn)ESBLs菌株。產(chǎn)ESBLs菌株在國內(nèi)非常普遍，且大多為質(zhì)粒攜帶耐藥基因，一份國內(nèi)多中心2002—2011年共10年的大腸埃希菌耐藥性研究表明，10年間臨床分離大腸埃希菌ESBLs攜帶率已經(jīng)從52.2%上升到了70.0%，處于一個(gè)相當(dāng)高的耐藥水平，而近幾年ESBLs攜帶率在浙江地區(qū)也均穩(wěn)定在60%～70%高區(qū)間內(nèi)[10]。耐藥基因PCR篩查也證實(shí)，本研究菌株的ESBLs類型以質(zhì)粒編碼CTX-M-9組為主。

大腸埃希菌對碳青霉烯類藥物維持了較低的耐藥率，耐藥菌株只有3株，而對接合菌的耐藥基因篩選并未發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒介導(dǎo)碳青霉烯酶基因blaKPC，說明國內(nèi)KPC型碳青霉烯酶在大腸埃希菌中還較少出現(xiàn)。對于臨床治療來說碳青霉烯類藥物是治療多重耐藥革蘭陰性菌的最后防線[11]，目前已出現(xiàn)KPC型碳青霉烯酶在同為腸桿菌科細(xì)菌的肺炎克雷伯菌中廣泛流行，有報(bào)道攜帶blaKPC質(zhì)粒的肺炎克雷伯菌ST11克隆型已成為國內(nèi)主要流行克隆[12]，如果出現(xiàn)blaKPC攜帶質(zhì)粒水平轉(zhuǎn)移至大腸埃希菌，會引起大腸埃希菌KPC型碳青霉烯酶的大規(guī)模傳播，將給院內(nèi)感染性控制帶來威脅。

圖2　部分菌株經(jīng)S1酶切后的PFGE圖譜，第4和第12泳道為marker

圖1　大腸埃希菌菌株P(guān)FGE膠圖及親緣關(guān)系圖

細(xì)菌耐藥性的流行趨勢現(xiàn)在已非簡單的克隆播散，耐藥基因的水平遷移越來越成為主要原因，而質(zhì)粒在這種水平轉(zhuǎn)移中扮演了非常重要的角色。菌株的PFGE圖譜顯示，臨床分離株只出現(xiàn)了小范圍的克隆播散情況。臨床分離大腸埃希菌通常攜帶了多樣性非常強(qiáng)的可接合性質(zhì)粒，可以通過接合作用很方便地在菌株間轉(zhuǎn)移，甚至還可以在不同菌種間交流，大大加快了耐藥性在菌株之間的傳播速度。通過S1酶切再進(jìn)行PFGE的方法可以較為準(zhǔn)確地判讀出質(zhì)粒分子量大小，大腸埃希菌所攜帶的質(zhì)粒大小變化范圍非常大，從40～330kb不等，即使是克隆型相近的菌株，所攜帶質(zhì)粒的大小也明顯不同，說明接合性耐藥質(zhì)粒很容易在傳播過程中發(fā)生插入和重組事件，通過基因的水平轉(zhuǎn)移獲得外界耐藥基因，再一次加快了耐藥性的傳播。

通過接合菌耐藥基因PCR篩查結(jié)果，發(fā)現(xiàn)臨床多重耐藥大腸埃希菌大多產(chǎn)ESBLs，其可接合性質(zhì)粒常編碼CTX-M型和TEM型β-內(nèi)酰胺酶，可以造成青霉素類和頭孢菌素類耐藥。喹諾酮類藥物的高耐藥性主要由于細(xì)菌染色體上編碼的靶蛋白突變造成，以qnr為代表的質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮耐藥基因所表現(xiàn)出的耐藥性不強(qiáng)，但在接合菌中篩選到7株qnr陽性菌株。相對β-內(nèi)酰胺類藥物，氨基糖苷類、喹諾酮類和四環(huán)素類等藥物也表現(xiàn)出相當(dāng)高的耐藥率，臨床治療難以選擇。含抑制劑的頭孢菌素和碳青霉烯類藥物依然是多重耐藥大腸埃希菌的重要選擇，同時(shí)加強(qiáng)院感控制、防止耐藥菌的大規(guī)模流行傳播也已經(jīng)成為當(dāng)務(wù)之急。

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（本文編輯：沈昱平）

收稿日期：（2014-06-04）

基金項(xiàng)目：浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃資助項(xiàng)目（2012KYA153）作者單位：310006杭州市第一人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室

通信作者：卓廣超，E-mail：boyzhuo@163.com

Plasmid-mediated multidrug-resistance in Escherichia coil

【Abstract】ObjectiveTo investigate the plasmid-mediated multidrug resistance in.MethodsNinety five clinical isolates of multidrug resistantwere collected.Antimicrobial susceptibility was determined by K-B method.PFGE was used to investigate the clonality of clinical isolates.Plasmid conjugation assay was used by filter mating.An S1-PFGE assay on plasmid was performed to determine the plasmid molecular size.PCR amplification and sequencing were used to screen common antimicrobial resistance genes.ResultsNinety-five clinical isolates ofexhibited multidrug resistance to penicillin,cephalosporins,quinolones and tetracycline.PFGE result did not support the evidence of clone dissemination.Resistant isolates harbored conjugant plasmid with 40kb-330kb size,which encoded penicillin,cephalosporins or quinolones resistant determinants,including CTX-M,TEM type β-lactamase genes and??gene.ConclusionClinical isolates ofpresent severe problem of multidrug resistance.The rapid prevalence of resistance may be mainly determined by conjugant plasmid or horizontal gene transfer instead of simple clone dissemination.

【Key words】Escherichia coliMultidrug-resistancePlasmid