孫東杰　滕建英　徐少駿　郭健

血竭負載于人工真皮支架修復豬Ⅲ度燒傷對創(chuàng)面愈合及瘢痕形成的影響

孫東杰滕建英徐少駿郭健

【摘要 】目的探討負載不同濃度血竭對膠原-殼聚糖人工真皮支架修復豬Ⅲ度燒傷創(chuàng)面愈合及瘢痕形成、增生的影響。方法將負載4g/L和1g/L濃度血竭的真皮支架各移植于6頭豬（共12頭）Ⅲ度燒傷清創(chuàng)后創(chuàng)面（A、B組），這12頭豬另一創(chuàng)面分別植入人工真皮支架及無支架的硅膠膜作為對照（C、D組）。觀察植入支架后1、2、3、4周的創(chuàng)面修復情況，采用免疫組織化學方法檢測不同時間4組創(chuàng)面轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β1和TGF-β3的表達。結(jié)果A組創(chuàng)面修復優(yōu)于B、C、D組。鏡下可見A組創(chuàng)面各時間點的新生血管較其他3組多，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。A、B、C 3組的TGF-β1在2周時升高，3周時下降。D組前3周逐漸升高，4周時下降。前2周A、B、C組TGF-β1表達量高于D組，后2周則低于D組。A、B、C 3組TGF-β3表達持續(xù)升高3周，4周時回落，其中A組表達最高；D組在低水平上緩慢升高，各時間段均明顯低于A、B、C 3組表達量。結(jié)論負載高濃度血竭能明顯提高膠原-殼聚糖人工真皮支架修復Ⅲ度燒傷創(chuàng)面時的血管化速度，促進創(chuàng)面更快愈合的同時可有效抑制瘢痕增生。

【關(guān)鍵詞】血竭人工真皮支架Ⅲ度燒傷TGF-β瘢痕

血竭是一種傳統(tǒng)中藥，由棕櫚科植物麒麟竭果實中滲出的樹脂加工制成，在我國有1 500多年使用歷史，具有活血化瘀、祛腐生肌、止血收斂、消腫止痛等作用，主治外傷性疾病。本研究采用膠原-殼聚糖人工真皮支架負載不同濃度血竭修復豬Ⅲ度燒傷創(chuàng)面，觀察真皮支架的血管化，進而探討其對創(chuàng)面愈合及瘢痕形成、增生的影響，現(xiàn)報道如下。

1　材料和方法

1.1實驗動物及材料

1.1.1實驗動物健康廣西巴馬小香豬（許可證號：SYXK＜滬＞2004-0004）12只，雌性，體重8.2～11.7（9.8±1.2）kg。

1.1.2其他材料牛Ⅰ型膠原與殼聚糖 [分子量Mr：（1.0～1.7）×105，75%～85%脫乙酰度]由美國Sigma公司生產(chǎn)。醫(yī)用級硅橡膠薄膜由上海鑫誠公司提供。聚丙烯移植環(huán)（外徑3.3cm，內(nèi)徑3.1cm，高0.4～1.0cm）由浙江玉升醫(yī)療器械公司提供。龍血竭膠囊（z53020999）由云南云河藥業(yè)有限公司提供。TGF-β1單克隆抗體由美國Santa Cruz公司提供。TGF-β3多克隆抗體產(chǎn)自美國Santa Cruz公司。SP免疫組化檢測試劑盒由美國Zymed公司提供。

1.2實驗方法

1.2.1Ⅲ度燒傷創(chuàng)面模型制作采用3%戊巴比妥腹腔注射和速眠新Ⅱ肌肉注射復合麻醉。將直徑2.5cm的圓柱形銅塊在100℃水浴箱中升溫至（99.0±0.5）℃以上，在豬背部兩側(cè)距離后正中線3～4cm處恒溫恒壓持續(xù)70s造成Ⅲ度燒傷[1]。常規(guī)清創(chuàng)后聚維酮碘包扎，換藥1次/d。

1.2.2負載血竭的膠原-殼聚糖/硅橡膠雙層人工真皮支架制備將制備的膠原-殼聚糖/硅橡膠雙層真皮支架（真皮支架的孔隙率＞90%，平均孔徑80～200μm，厚度2mm，直徑3.1cm，醫(yī)用級硅橡膠薄膜與制備的真皮支架粘合形成雙層支架）放置在超凈工作臺中以紫外線燈照射過夜，滅菌后備用[2]。將龍血竭粉按比例溶于75%乙醇中，配制成1g/L和4g/L兩種濃度的乙醇溶液，4g/L為其飽和濃度。在超凈臺中將不同濃度的血竭乙醇溶液分別滴加在支架材料上，每個材料加500μl，4%冰箱保存，使用前用0.9%氯化鈉溶液浸洗5min×3次除去乙醇。

1.2.3實驗分組在每只豬背部制作2處Ⅲ度燒傷創(chuàng)面，共24處，創(chuàng)面切痂后移植真皮支架。隨機選擇其中6只豬，2處創(chuàng)面分別植入負載高濃度血竭（4g/L）的膠原-殼聚糖/硅橡膠雙層人工真皮支架和單純膠原-殼聚糖/硅橡膠雙層人工真皮支架。剩余6只豬的2處創(chuàng)面分別植入負載低濃度血竭（1g/L）的膠原-殼聚糖/硅橡膠雙層人工真皮支架和無支架的硅橡膠膜。負載高、低濃度血竭人工真皮支架各6處分別設(shè)為A組和B組；未負載血竭人工真皮支架和無支架的硅橡膠膜各6處作為對照，分別設(shè)為C組和D組。

1.2.4Ⅲ度燒傷創(chuàng)面切痂后雙層人工真皮支架植入[1]燒傷48h后，同上法麻醉后行Ⅲ度燒傷創(chuàng)面切痂，切痂至有出血的正常組織（脂肪或肌肉），切痂直徑3.05～3.15（3.10±0.03）cm。A、B、C組：將不同人工真皮支架修剪至與移植環(huán)內(nèi)徑一致，硅膠膜面朝上放入制備好的創(chuàng)面上，使創(chuàng)面與真皮支架貼合。D組：直接在創(chuàng)面上覆蓋硅橡膠膜。

1.2.5創(chuàng)面觀察及取材在真皮支架植入后1、2、3周時打開內(nèi)層敷料，進行創(chuàng)面大體觀察，并在創(chuàng)面中間切取1.0cm×0.5cm深至肌層的組織塊。每處組織標本切片，一部分進行HE染色，于400倍的光鏡下作組織學觀察，隨機觀察10個視野，對毛細血管進行計數(shù)，取平均值。

1.2.6創(chuàng)面表皮移植[1]支架植入2周時取厚約1mm豬刃厚皮，剪成（0.5～0.7）cm×（0.5～0.7）cm大小組織塊，置0.2%胰酶磷酸緩沖液中37℃消化100min，將表皮從真皮上分離。打開創(chuàng)面，揭下硅橡膠膜，植入分離的表皮（0.4%臺盼藍染色表明表皮細胞成活率在80%以上），打包加壓固定。支架植入術(shù)后4周打開植皮區(qū)觀察表皮成活情況并取材，以成活表皮所占比例表示成活率。組織學觀察方法同前3周標本。

1.2.7創(chuàng)面組織TGF-β1、TGF-β3表達的檢測于真皮支架植入后1、2、3、4周取各處組織切片行TGF-β1、TGF-β3表達的檢測。采用免疫組化SP法，TGF-β1和TGF-β3一抗?jié)舛葹?∶200，按試劑盒說明書步驟進行檢測，DAB顯色，陽性信號為棕黃色，主要表達于血管和成纖維細胞胞質(zhì)中。于400倍光鏡下隨機觀察10個視野的陽性信號，并進行計數(shù)，取平均值。

1.3統(tǒng)計學處理采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2　結(jié)果

2.1創(chuàng)面大體觀察A、B、C 3組不同的真皮支架移植后1～3周創(chuàng)面色澤均逐漸由白色變成紅色，但A組較其他兩組更為紅潤，創(chuàng)面支架與組織的整合也更好，而其他組仍存在不同程度蒼白組織（圖1-4，見插頁）。4周時，A組和 B組的表皮成活率分別為 100%和（87.5±6.5）%，C組為（65.0±2.4）%；D組1～2周時創(chuàng)面分泌物較多，3周時創(chuàng)面粗糙，4周時表皮成活率為（48.0±5.5）%。

2.2創(chuàng)面組織學觀察見表1和圖5、6（見插頁）。

圖1 A組術(shù)后3周時創(chuàng)面情況　

圖2　B組術(shù)后3周時創(chuàng)面情況

圖3　C組術(shù)后3周時創(chuàng)面情況　

圖4　D組術(shù)后3周時創(chuàng)面情況

圖5　A組術(shù)后3周創(chuàng)面組織學觀察，箭頭所示為毛細血管（HE，× 400）

圖6　B組術(shù)后3周創(chuàng)面組織學觀察（HE，×400）

圖7　A組術(shù)后3周時TGF-β1表達情況（免疫組化，×400）

由表1可見，A組創(chuàng)面各時間點新生血管數(shù)均明顯多于其他3組，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），D組在1、2周時新生血管數(shù)無明顯增多，3、4周時新血管數(shù)有所增多。

表1　4組創(chuàng)面各時間點新生毛細血管計數(shù)（個）

由圖5、6可見，3周時A組創(chuàng)面真皮組織毛細血管密度明顯高于B組。

2.34組創(chuàng)面組織各時間點TGF-β1、TGF-β3陽性表達細胞數(shù)的比較 見表2、圖7-10（見插頁）。

圖8　B組術(shù)后3周時TGF-β1表達情況（免疫組化，×400）

圖9　A組術(shù)后3周時TGF-β3表達情況（免疫組化，×400）

圖10　B組術(shù)后3周時TGF-β3表達情況（免疫組化，×400）

表2　4組創(chuàng)面組織各時間點TGF-β1、TGF-β3表達陽性的細胞數(shù)比較（個）

由表2可見，A、B、C 3組TGF-β1表達陽性的細胞數(shù)2周時最高，3周時較2周時降低，4周最低；D組前3周表達陽性細胞數(shù)逐漸增加，3周時達到最高，4周時降低，但仍高于2周時。同組前后時間點兩兩相比差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。4組前3周時TGF-β3表達陽性細胞數(shù)均逐漸增加；A、B、C 3組4周時陽性表達低于前3周，D組4周時陽性表達則高于3周時。同組前后時間點兩兩相比均有統(tǒng)計學差異（均P＜0.05）。各組4個時間點均為A組最多，D組最少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3　討論

血竭能抗血小板集聚，增高纖維蛋白溶解酶活性單位，促進纖溶活性[3]。中醫(yī)用其治療燒傷可改善創(chuàng)面瘀滯區(qū)微循環(huán)，避免大量微血栓形成，顯著提高微循環(huán)血量，阻止瘀滯區(qū)組織發(fā)生凝固性壞死。本實驗是將血竭溶液負載于人工真皮支架，再經(jīng)支架移植及表皮移植來進行治療。通過不同時間點的創(chuàng)面觀察以及組織學觀察發(fā)現(xiàn)，負載高濃度血竭的人工真皮支架內(nèi)血管生成明顯較多較快，3周已基本完全血管化。Ⅲ度燒傷由于全層皮膚壞死需通過自體皮膚移植修復，愈合效果則取決于所植皮片能否得到基底的充足血供，因而人工真皮支架的血管化速度也決定了創(chuàng)面的愈合速度。實驗4周后，高濃度血竭組的表皮成活率達到100%證明了血竭對人工真皮支架血管化的促進作用。

深度創(chuàng)面愈合往往伴隨瘢痕增生現(xiàn)象，是由多種細胞和生物活性物質(zhì)聚集并產(chǎn)生復雜生物反應所致。TGF-β是目前公認的瘢痕生長相關(guān)因子，其中TGF-β1是已知的與創(chuàng)面修復和瘢痕增生關(guān)系最為密切、最具代表性的細胞因子[4]，其與瘢痕增生呈正相關(guān)，可能通過刺激成纖維細胞的大量增生并使其活性增強，促進膠原蛋白的合成而導致組織增生、瘢痕形成[5]。因此創(chuàng)面早期TGF-β1高表達有利于創(chuàng)面盡快修復，但持續(xù)長時間高表達則促使瘢痕過度增生[6]。TGF-β3在胎兒的皮膚無瘢痕再生過程中有較高表達，雖然TGF-β3也能刺激成纖維細胞增生并使其活性增強，促進膠原蛋白的合成，但卻并不刺激瘢痕的形成[7]。研究表明TGF-β3是TGF-β1的競爭性拮抗物[8]，因此創(chuàng)面TGF-β3的高表達有利于抑制瘢痕增生。本實驗結(jié)果顯示，3種支架在創(chuàng)面愈合早期與無支架組相比TGF-β1表達陽性的細胞數(shù)均明顯增加，2周達高峰，以高濃度血竭組為最高。此后急劇減少，在3、4周已明顯低于無支架組。而3種支架組表達TGF-β3陽性細胞數(shù)在1～3周大幅升高，4周雖然有所回落，仍遠高于無支架組，其中負載高濃度血竭支架組的TGF-β3陽性細胞數(shù)高于負載低濃度血竭支架組和未負載血竭支架組。從兩種細胞因子的表達情況可以看到，人工真皮支架修復Ⅲ度燒傷創(chuàng)面既可促進愈合又有利于抑制瘢痕增生，高濃度血竭通過促進人工真皮支架血管化可強化這種效果。而負載血竭濃度較低時，強化作用不明顯。

綜上所述，膠原-殼聚糖人工真皮支架負載高濃度血竭修復豬Ⅲ度燒傷創(chuàng)面，借助血竭的促血管化作用，可在早期更為迅速地修復創(chuàng)面，同時在遠期亦可有效抑制創(chuàng)面瘢痕增生。

4　參考文獻

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（本文編輯：楊麗）

收稿日期：（2014-08-08）

基金項目：浙江省中醫(yī)藥科學研究基金（2011ZB124）

作者單位：310015杭州師范大學附屬醫(yī)院（孫東杰），杭州師范大學臨床醫(yī)學院（滕建英）；杭州瑞麗整形外科（徐少駿）；浙江省中醫(yī)院（郭健）

通信作者：滕建英，E-mail：tengjianying5@yahoo.com.cn

Application of Sanguis draconis-coated artificial dermal stent in treatment of full-thickness burn wound of pigs

【Abstract】ObjectiveTo evaluate the efficacy of Chinese traditional medicine Sanguis draconis-coated collagen-chitosan artificial dermal stent in treatment of full-thickness burn wound in pigs.MethodsFull thickness burn wounds were induced in 12 Bama miniature pigs.After debridement,collagen-chitosan artificial dermal stents coated with Sanguis draconis 4g/L (group A),1g/L(group B),or artificial dermal stents without coating were implanted on wounds(group C);the wounds without stents implantation served as controls(group D).The wound repairing and pathological changes were observed 1,2,3 and 4 weeks after treatment;the TGF-β1 and TGF-β3 expressions in wounds were detected by immunohistochemical staining.ResultsThe wounds repairing and new micro-vessel growth in group A were better than those in other groups.Expression of TGF-β1 was increased in the wounds of groups A，B and C in the first 2 weeks，decreased at week 3;for group D it increased in the first 3 weeks and decreased at week 4.The expression of TGF-β1 of group A，B，C were higher in first 2 weeks and lower in last 2 weeks than that of group D.Expression of TGF-β3 was increased in groups A,B and C in the first 3 weeks and decreased at week 4 week;compared to group B and C TGF-β3 expression in group A was the highest.TGF-β3 expression in group D was lower than 3 groups at all time points.ConclusionChinese traditional medicine Sanguis draconis-coated collagen-chitosan artificial dermal stent can promote angiogenesis in tissue,improve wound healing and inhibit the hyperplasia of scar in treatment of full-thickness burn injury in pigs.

【Key words】Dragon's bloodArtificial dermal stentFull thickness burn woundTGF-βScar