王小紅 周星明 江洪 張谷 蘇丹

●論 著

Stathmin基因在Ⅱ期非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)的意義

王小紅 周星明 江洪 張谷 蘇丹

目的 探討Ⅱ期非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中Stathmin mRNA和蛋白表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系。方法單基因定量法檢測(cè)已手術(shù)Ⅱ期NSCLC患者腫瘤組織中Stathmin mRNA表達(dá)；免疫組化法檢測(cè)患者腫瘤組織中Stathmin蛋白表達(dá)水平。所有患者行長(zhǎng)春瑞濱聯(lián)合順鉑方案化療，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析其表達(dá)水平與患者臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系，并隨訪患者的無(wú)瘤生存時(shí)間（DFS）和總體生存時(shí)間（OS），統(tǒng)計(jì)學(xué)分析StathminmRNA和蛋白表達(dá)水平與患者的DFS、OS的關(guān)系。結(jié)果Stathmin mRNA表達(dá)水平與患者的T、N分期顯著相關(guān)，與患者的年齡，病理類(lèi)型均無(wú)顯著相關(guān)性；Stathmin蛋白表達(dá)水平與患者的年齡、病理類(lèi)型、T、N分期均無(wú)顯著相關(guān)性；Stathmin mRNA和蛋白表達(dá)水平與患者的OS，DFS均無(wú)顯著相關(guān)性。結(jié)論Ⅱ期NSCLC患者腫瘤組織中Stathmin表達(dá)水平不能作為預(yù)測(cè)患者預(yù)后的指標(biāo)。

肺腫瘤 Stathmin

肺癌是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤，在惡性腫瘤相關(guān)死亡原因中占第一位。非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）占所有肺癌病例的80%，5年生存率不足15%。近年研究表明，細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中相關(guān)因子的表達(dá)異常、腫瘤細(xì)胞DNA修復(fù)的異常與肺癌的發(fā)生、發(fā)展存在密切聯(lián)系。因此，我們用單基因定量法檢測(cè)了73例已手術(shù)Ⅱ期NSCLC患者腫瘤組織中Stathmin mRNA表達(dá)，免疫組化法檢測(cè)患者腫瘤組織中Stathmin蛋白表達(dá)，評(píng)價(jià)其表達(dá)水平與患者臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系，同時(shí)隨訪患者的無(wú)瘤生存時(shí)間（DFS）和總體生存時(shí)間（OS），統(tǒng)計(jì)分析Stathmin mRNA和蛋白表達(dá)水平與患者DFS、OS的關(guān)系。我們?cè)噲D探索Stathmin在肺癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起到的作用，并研究Stathmin基因表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 一般資料 所有標(biāo)本均從本院標(biāo)本庫(kù)中篩選（患者均簽定知情同意書(shū)，醫(yī)院倫理委員會(huì)討論通過(guò)）。術(shù)后病理按照2006年國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，共篩選2007-09—2010-06經(jīng)根治性手術(shù)切除的Ⅱ期NSCLC患者73例。其中男58例，女15例；年齡≤60歲55例，＞60歲18例；腫瘤大小≤3cm 22例，＞3cm 51例；無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例；高-中分化53例、低分化20例；腺癌33例、鱗癌36例、其他病理類(lèi)型4例。

1.2 輔助化療 患者術(shù)后轉(zhuǎn)至化療科行長(zhǎng)春瑞濱聯(lián)合順鉑化療，順鉑75mg/m2分3d給予，長(zhǎng)春瑞濱25mg/m2第1、8天，以上方案每3周重復(fù)。其中1例患者因骨轉(zhuǎn)移只進(jìn)行2周期化療，有4例患者第1周期化療在本院進(jìn)行，余3個(gè)周期化療在當(dāng)?shù)剡M(jìn)行，其余患者均在本院完成4個(gè)周期的化療。

1.3 隨訪資料（DFS和3年生存率） 73例患者，70例通過(guò)電話隨訪，其中失訪3例，由指定醫(yī)師完成，每3個(gè)月1次。隨訪率為95.89%，失訪病例按截尾值處理。

1.4 mRNA檢測(cè) 用單基因定量（Quanti-Gene Assay）方法進(jìn)行，由基因科技（上海）有限公司完成。步驟如下：先將3～5片的石蠟切片樣本直接用200μl裂解液裂解完全消化后，室溫12 000r/min，離心半徑9cm，離心取上清液，與反應(yīng)系統(tǒng)的各試劑包括微珠和探針等混合，在54℃600r/min的條件下過(guò)夜混合雜交，雜交后利用磁力洗去未雜交到微珠上的雜質(zhì)。接著對(duì)捕捉到的RNA信號(hào)利用bDNA技術(shù)做級(jí)聯(lián)放大，通過(guò)預(yù)放大，放大，標(biāo)記探針在50℃600r/min的條件下分別作1h雜交，每一步雜交后都需要用洗滌液洗3次。最后做SAPE標(biāo)記后利用Luminex 200讀取基因表達(dá)數(shù)據(jù)。檢測(cè)過(guò)程按文獻(xiàn)[1]的方法進(jìn)行。檢測(cè)Stathmin mRNA的寡核苷酸探針QuantiGene 2.0工具由Panomics公司設(shè)計(jì)并合成。HPRT1基因作為質(zhì)量控制基因,每個(gè)樣本均檢測(cè)待檢基因和HPRT1基因拷貝數(shù)。

1.5 Stathmin蛋白水平檢測(cè) 采用免疫組化方法，由本院病理科完成，免疫組化試劑購(gòu)自福州邁新公司。Stathmin蛋白主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中，陽(yáng)性呈棕黃色，以?xún)?nèi)皮細(xì)胞作陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果判斷采用半定量法，即結(jié)合陽(yáng)性細(xì)胞的染色強(qiáng)度和百分比來(lái)判定表達(dá)狀態(tài)。染色強(qiáng)度：無(wú)色0分、淺黃色1分、棕黃色2分、棕褐色3分。著色細(xì)胞比例：無(wú)著色0分、＜5%為1分、6%～30%為2分、31%～60%為3分、≥61%為4分。兩者相加得分為判定級(jí)別：≤2分為陰性，＞2分為陽(yáng)性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0軟件完成，采用COX模型進(jìn)行單因素分析，Kaplan-Meier法繪制生存曲線，并經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 癌組織中Stathmin mRNA的表達(dá) 均值0.916739，中位值0.6318，極小值0.335，極大值5.0746，方差0.975。

2.2 癌組織中Stathmin蛋白表達(dá) 在73例患者中，Sthatmin陰性45例，陽(yáng)性28例，陽(yáng)性率為38.4%，見(jiàn)圖1、2。

圖1 Sthatmin高表達(dá)

圖2 Sthatmin低表達(dá)

2.3 Stathmin表達(dá)水平與患者臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系 Stathmin mRNA表達(dá)水平與患者的T、N分期顯著相關(guān)，與患者的年齡、病理類(lèi)型均無(wú)顯著相關(guān)性；Stathmin蛋白表達(dá)水平與患者的年齡、病理類(lèi)型、T、N分期均無(wú)顯著相關(guān)性，見(jiàn)表1。2.4 隨訪結(jié)果 70例患者中19例在隨訪期間死亡，3年生存率為為75.1%，5年生存率為56.6%，中位生存時(shí)間68個(gè)月（95%CI：45.21～90.79），見(jiàn)圖3。

表1 Stathmin表達(dá)水平與患者臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系（例）

圖3 70例患者的生存曲線圖

2.5 不同Stathmin表達(dá)患者OS、DFS的比較 Stathmin mRNA低表達(dá)患者OS、DFS與高表達(dá)患者相比，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見(jiàn)圖4、5。

圖4 不同Stathmin表達(dá)患者的DFS曲線圖（χ2=0.227，P=0.633）

圖5 不同Stathmin表達(dá)患者的OS曲線圖（χ2=1.907，P=0.167）

2.6 Sthatmin蛋白表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系 Sthatmin陰性者44例，陽(yáng)性者26例，兩組患者的OS、DFS比較，差異意義均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)，見(jiàn)圖6、7。

圖6 不同Stathmin蛋白表達(dá)水平患者的DFS曲線圖（χ2=0.229，P=0.633）

圖7 不同Stathmin蛋白表達(dá)水平患者的OS曲線圖（χ2=2.365，P=0.124）

3 討論

Stathmin是一種重要的微管解聚蛋白，作為細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子在細(xì)胞分化、組織再生與修復(fù)、尤其在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及表型決定上有重要作用及意義。在細(xì)胞周期的不同階段通過(guò)磷酸化和去磷酸化作用，對(duì)細(xì)胞微管系統(tǒng)動(dòng)力平衡的調(diào)節(jié)發(fā)揮十分重要的作用。雖然沒(méi)有直接的證據(jù)表明Stathmin高表達(dá)與惡性腫瘤的轉(zhuǎn)化直接相關(guān),但有證據(jù)提示腫瘤細(xì)胞高增殖率與它直接相關(guān)。Singer等[2]發(fā)現(xiàn)，在NSCLC中，無(wú)論腺癌還是鱗癌細(xì)胞中均可觀察到Stathmin及其家族成員Stathminlike 3（SCLIP）高表達(dá)而引起的腫瘤細(xì)胞分裂增殖加快和基質(zhì)浸潤(rùn)、細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)增加的現(xiàn)象。也有學(xué)者證明Stathmin基因表達(dá)水平與肺癌的分化程度成反比，即Stathmin基因表達(dá)水平越高，肺癌分化程度越低。同時(shí)，他們還認(rèn)為Stathmin基因高表達(dá)可以作為診斷肺癌的腫瘤標(biāo)志物。我們的研究也提示Stathmin mRNA表達(dá)水平與肺癌的腫瘤大小，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等多種臨床病理學(xué)特征有關(guān)，但以上的研究證據(jù)均是在中晚期肺癌中獲得的。Stathmin基因在肺癌尤其是早期肺癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用，尚待進(jìn)一步研究證實(shí)。

目前的研究表明Stathmin在多種惡性腫瘤中表達(dá)升高，且其表達(dá)水平與腫瘤惡性度和預(yù)后密切相關(guān)，可能成為新的治療靶點(diǎn)。在口腔鱗狀細(xì)胞癌中和消化系統(tǒng)腫瘤中，顯著升高的Stathmin水平與腫瘤的TNM分期、分化程度及預(yù)后密切相關(guān)[3-4]。在乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌中的研究表明，Stathmin表達(dá)有獨(dú)立的預(yù)后價(jià)值，且Stathmin高表達(dá)的卵巢癌患者使用紫杉醇和鉑類(lèi)化療預(yù)后不良。這一發(fā)現(xiàn)支持Stathmin可能會(huì)干擾紫杉醇治療，導(dǎo)致預(yù)后不良[5-6]。

肺癌中目前未有明確證據(jù)證實(shí)Stathmin表達(dá)與患者預(yù)后有關(guān)。蒲驍麟等[7]報(bào)道，在晚期NSCLC中，免疫組織化學(xué)方法測(cè)得的Stathmin表達(dá)水平與長(zhǎng)春瑞濱+順鉑/卡鉑（NP）方案的化療療效負(fù)相關(guān)，且可能與患者的預(yù)后負(fù)相關(guān)。但我們的研究結(jié)果表明：Ⅱ期NSCLC術(shù)后標(biāo)本中Stathmin mRNA和蛋白表達(dá)均與患者預(yù)后無(wú)關(guān)，不能作為患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)。其高表達(dá)患者與低表達(dá)患者相比，DFS和OS均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

為什么會(huì)出現(xiàn)上述不一致的結(jié)果呢？這種不同結(jié)果的解釋可能是：（1）是否Stathmin的表達(dá)在不同期別的NSCLC存在著不同的預(yù)測(cè)結(jié)果?我們的研究結(jié)果也提示患者的T、N分期級(jí)別越高，Stathmin mRNA的表達(dá)水平越高。（2）檢測(cè)的病例、樣本和標(biāo)準(zhǔn)的不同。目前的研究多為晚期病例，且多采用穿刺或纖支鏡標(biāo)本，組織樣本量較少，而我們的檢測(cè)對(duì)象為Ⅱ期NSCLC的術(shù)后標(biāo)本，樣本含量大。（3）樣本例數(shù)的限制。（4）隨訪時(shí)間的長(zhǎng)短可能都是造成結(jié)果不同的原因。這也反映了Stathmin的表達(dá)對(duì)肺癌患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值不如對(duì)乳腺癌、卵巢癌和消化系統(tǒng)惡性腫瘤，仍需大樣本前瞻性試驗(yàn)的證實(shí)[8]。因此，我們正在不斷積累樣本例數(shù)，并且嘗試使用更多的方法來(lái)檢測(cè)更多不同期別的肺癌標(biāo)本中微管基因的表達(dá)水平，以期獲得更加準(zhǔn)確的結(jié)果。

[1]Eastham L L,Mills C N,Niles R M.PPARalpha/gamma expression and activity in mouseand human melanocytes and melanoma cells[J].Pharm Res,2008,25(6)：1327-1333.

[2]Singer S,Malz M,Herpel E,et al.Coordinated expression of Stathmin family members by far upstream sequence element-binding protein-1 increases motility in non-small cell lung cancer[J]. Cancer Res,2009,69(6)：2234-2243.

[3]Jeon T Y,Han M E,Lee Y W,et al.Overexpression of Stathmin1 in the diffuse type of gastric cancer and its roles in proliferation and migration of gastric cancer cells［J].Br J Cancer,2010,102：710-718.

[4]Gan L,Guo K,Li Y,et al.Up-regulated expression of Stathmin may be associated with hepatocarcinogenesis[J].Oncol Rep, 2010,23：1037-1043．

[5]Su D,Smith S M,Preti M,et al.Stathmin and tubulin expression and survival of ovarian cancer patients receiving platinum Treatment with and without paclitaxel[J].Cancer,2009,115(11)：2453-2463．

[6]McGrogan B T,Gilmartin B,Carney D N,et al.Taxanes,microtubules and chemoresistant breast cancer[J].Biochim Biophys Acta,2008,1785(2)：96-1321.

[7]蒲驍麟,王峻,許林,等.β-tubulin-Ⅲ和Stathmin與晚期NSCLC化療敏感性的關(guān)系[J].中國(guó)肺癌雜志,2009,12(1)：49-53.

[8]Stengel C,Newman S P,Leese M P,et al.Class III beta-tubulin expression and in vitroresistance to microtubule targeting agents[J]. Br JCancer,2010,102(2)：316-324．

（本文編輯：田云鵬）

《浙江醫(yī)學(xué)》對(duì)圖表的要求

稿件中若有圖表，分別按其在正文中出現(xiàn)的先后次序連續(xù)編碼。每幅圖應(yīng)冠有圖題。說(shuō)明性的文字應(yīng)置于圖下方注釋中，并在注釋中標(biāo)明圖表中使用的全部非公知公用的縮寫(xiě)。線條圖應(yīng)墨繪在白紙上，高寬比例以5∶7為宜。以計(jì)算機(jī)制圖者應(yīng)提供激光打印圖樣。照片圖要求有良好的清晰度和對(duì)比度；圖中需標(biāo)注的符號(hào)（包括箭頭）請(qǐng)用另紙標(biāo)上，不要直接寫(xiě)在照片上。每幅圖的背面應(yīng)貼上標(biāo)簽，注明圖號(hào)、方向及作者姓名。若刊用人像，應(yīng)征得本人的書(shū)面同意，或遮蓋其能被辨認(rèn)出系何人的部分。大體標(biāo)本照片在圖內(nèi)應(yīng)有尺度標(biāo)記。病理照片要求注明染色方法和放大倍數(shù)。圖表中如有引自他刊者，應(yīng)注明出處。電子版投稿中圖片建議采用JPG格式。表格建議采用三橫線表（頂線、表頭線、底線），如遇有合計(jì)和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理內(nèi)容（如值值等），則在此行上面加一條分界橫線；表內(nèi)數(shù)據(jù)要求同一指標(biāo)有效位數(shù)一致，一般按標(biāo)準(zhǔn)差的1/3確定有效位數(shù)。

本刊編輯部

Expression of Stathmin in stage II non-small cell lung cancer and its significance

Objective To investigate the expression of Stathmin in stageⅡnon-small cell lung cancer(NSCLC)and its significance.MethodsThe expression of Stathmin mRNA and protein was detected by Quanti-Gene Assay and immunohistochemistry,respectively.All patients received NP chemotherapy.The patients were followed-up;the disease-free survival(DFS) and overall survival(OS)were observed.The correlation of Stathmin expression level with the clinicopathological features of NSCLC and prognosis of patients were analyzed.ResultsStathmin mRNA expression levels was significantly correlated with T stage and N stage.There was no significant correlation of Stathmin mRNA and protein expression levels with the OS and DFS of patients.ConclusionIn patients with stageⅡ NSCLC,the expression levels of Stathmin mRNA and protein in cancer tissue cannot be used as a prognostic indicator.

Lung cancer Stathmin

2013-12-11）

浙江省教育廳資助課題（2007-01345）

310022 杭州，浙江省胸部腫瘤（肺、食管）診治技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、浙江省腫瘤醫(yī)院化療科（王小紅），胸外科（周星明、江洪），病理科（張谷），研究所（蘇丹）

江洪，E-mail：hh110120@126.com