唐旭霞 葉再元

紫草素抑制人甲狀腺髓樣癌TT細胞增殖及其機制的研究

唐旭霞 葉再元

目的 了解紫草素抑制甲狀腺癌TT細胞增殖的作用及機制。方法采用MTT法分析紫草素對人甲狀腺癌TT細胞增殖的影響；流式細胞術分析紫草素對TT細胞周期分布和凋亡的影響；透射電鏡觀察紫草素對TT細胞凋亡和自噬的調控。結果不同濃度紫草素作用24～72h對TT細胞均有抑制增殖的作用，并隨藥物濃度增加和作用時間延長而增強。紫草素作用24h，2、4μg/ml紫草素組細胞出現(xiàn)凋亡峰（亞二倍體峰），與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但未見明顯的細胞周期阻滯。AnnexinV-PE/7-AAD雙染法分析細胞凋亡，2μg/ml紫草素作用TT細胞24h，早期凋亡細胞增至8.0%；而空白對照組為0.2%，凋亡后期繼發(fā)壞死細胞為11.3%，空白對照組為0.1%；作用48h后，早期凋亡細胞為24.9%，凋亡后期繼發(fā)壞死細胞上升為14.2%。2μg/ml紫草素作用TT細胞24h，透射電鏡觀察可見典型的細胞凋亡和自噬結構。結論紫草素具有抑制人甲狀腺癌TT細胞增殖的作用，呈劑量和時間依賴關系；其作用機制與誘導細胞凋亡和自噬有關。

紫草素 甲狀腺髓樣癌 細胞增殖 細胞凋亡

甲狀腺髓樣癌（medullary carcinoma of thyroid，MTC）來源于甲狀腺濾泡旁細胞（又稱C細胞），約占全部甲狀腺惡性腫瘤的5%～10%[1]。MTC屬中度惡性腫瘤，女性發(fā)病率略多于男性。目前手術切除仍是其首選根治方式，與分化型甲狀腺癌不同，131I對MTC無治療作用，放療、放射性核素治療及化療等效果均不佳[2-3]。積極尋找MTC新的治療靶點及對治療有效的藥物具有重大意義。紫草為紫草科多年生草本植物新疆紫草干燥根，在我國有悠久的藥用歷史，目前研究表明，紫草素具有抗腫瘤作用[4-7]。本研究旨在探討紫草素對MTC TT細胞是否有增殖抑制和誘導凋亡的作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 人甲狀腺髓樣癌TT細胞株系購自中國科學院細胞庫，紫草素購自成都曼思特生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 TT細胞培養(yǎng)與傳代 TT細胞為貼壁生長細胞，在37℃、5%CO2飽和濕度條件下，將TT細胞培養(yǎng)在F-12K培養(yǎng)液中。吸干培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，加入0.05%胰蛋白酶工作液1ml快速前后旋轉培養(yǎng)瓶4～5次以便胰蛋白酶包被所有瓶內細胞，吸出胰蛋白酶工作液，另加入0.05%胰蛋白酶工作液1ml，旋轉培養(yǎng)瓶4～5次。細胞脫落前吸出胰蛋白酶工作液。將細胞培養(yǎng)瓶蓋松松擰上后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中2～5min。用手輕拍培養(yǎng)瓶，檢查細胞脫壁情況，若無細胞脫落將細胞培養(yǎng)瓶再放回37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育數(shù)分鐘，繼續(xù)輕拍細胞培養(yǎng)瓶直至細胞完全脫落，再懸細胞于細胞培養(yǎng)液內（4ml），輕輕吹打細胞使得團狀細胞分散，以所需細胞密度接種細胞。

1.2.2 TT細胞增殖影響的測定 采用MTT比色法。消化、收集對數(shù)生長期的TT細胞，使用含10%胎小牛血清的培養(yǎng)液配成5×104個/ml單個細胞懸液，每孔加200μl，以每孔10 000個細胞接種至96孔板。37℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育24h致細胞貼壁，分別加入200μl含不同終濃度的紫草素（0.5、1、2、4μg/ml），每組5個復孔，并設立空白對照組（僅加入完全培養(yǎng)基）。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)24、48、72h，培養(yǎng)后每孔加MTT溶液（5mg/ml，PBS配制）20μl，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4h。終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內培養(yǎng)上清液。每孔加入150μl DMSO，振蕩10min，使結晶物充分融解。選擇490nm作為檢測波長，在全波長多功能酶標儀（INFINTE M200）測定各孔光吸收值（OD值），記錄結果。根據(jù)MTT結果算抑制率：抑制率=1-OD加藥/OD空白× 100%。

1.2.3 TT細胞周期分布的改變 采用流式細胞術。取對數(shù)生長期細胞，6孔板內每孔接種3×105個細胞，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)12h，待其貼壁。棄上清液，每孔加入3ml含2、4μg/ml紫草素的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h，并設立空白對照組。胰酶消化，收集細胞，棄上清液，用預冷PBS洗滌細胞2次，加入預冷70%乙醇，于-20℃固定過夜。3 000 r/min離心10min，棄上清液，收集細胞，用預冷PBS洗滌細胞3次，棄上清液，加入200μl細胞周期染液（Guava Cell Cycle Reagent,美國Millipore公司）后混勻，避光室溫孵育30min。流式細胞儀（Guava easycyte plus，美國Millipore公司）檢測周期分布。

1.2.4 細胞凋亡率檢測 采用流式細胞術。取對數(shù)生長期細胞，6孔板內每孔接種3×105個細胞，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h，待其貼壁。棄上清液，每孔加入3ml含2μg/ml紫草素的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h和48h，并設立空白對照組。胰酶消化，1 000r/min離心10min收集細胞，PBS洗滌細胞3次，加入200μl AnnexinV-PE及7-AAD的細胞凋亡檢測試劑后混勻，避光室溫孵育30min。流式細胞儀分析紫草素對TT細胞凋亡的影響。

1.2.5 透射電鏡觀察細胞凋亡和自噬形態(tài) 取對數(shù)生長期細胞，以3×105個細胞密度接種于6孔板中，接種12h后進行加藥處理?？瞻讓φ战M細胞（僅加入F-12K完全培養(yǎng)基）和處理組（以濃度為2、4μg/ml的紫草素處理TT細胞）細胞分別經(jīng)溫PBS液洗滌2～3次，刮取細胞并將其移入離心管中，1 000r/min離心5min，棄上清液；細胞沉淀采用2%戊二醛4℃預固定2h，PBS洗滌3次，在2.5%的戊二醛溶液中4℃固定過夜，將經(jīng)過滲透處理的樣品包埋，70℃加熱過夜，即得到包埋好的樣品。樣品在Reichert超薄切片機中切片，獲得70～90nm的切片，該切片經(jīng)檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液各染色15min，透射電鏡中觀察。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件，計量資料采用表示，組間比較較采用t檢驗。

2 結果

2.1 紫草素對TT細胞增殖的影響 MTT結果顯示，不同濃度紫草素作用24～72h對TT細胞增殖均有抑制作用，并隨藥物濃度增加和作用時間延長而增強，詳見表1。

表1 不同濃度紫草素作用TT細胞的抑制率（%）

2.2 紫草素對TT細胞周期分布的影響 流式細胞儀檢測TT細胞空白對照組細胞周期時未發(fā)現(xiàn)G0/G1期前的亞二倍體峰（凋亡峰），2μg/ml濃度的紫草素處理細胞24h開始出現(xiàn)亞二倍體峰；紫草素濃度4μg/ml以上處理細胞時出現(xiàn)明顯的G0/G1期前的亞二倍體峰（凋亡峰）（圖2），與空白對照組細胞比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。不同濃度紫草素作用TT細胞24h細胞周期的變化：M1、M2、M3細胞周期的百分比經(jīng)藥物作用后分別與空白對照組比較未見明顯增高（P＞0.05），即對細胞周期百分比的影響未見明顯變化，詳見表2。

表2 不同濃度紫草素作用24h TT細胞周期分布的變化（%）

2.3 紫草素誘導TT細胞凋亡 為了進一步證實亞二倍體峰為凋亡峰，應用7-AAD及AnnexinV-PE雙標記染色測定細胞凋亡。與空白對照組相比，2μg/ml濃度的紫草素作用TT細胞24h，早期凋亡（AnnexinV-PE+/7-AAD-）細胞從0.2%（空白對照組）增至8.0%；凋亡后期繼發(fā)壞死（AnnexinV-PE+/7-AAD+）細胞，從0.1%（空白對照組）增至11.3%；紫草素處理48h后，早期凋亡細胞上升為24.9%，凋亡后期繼發(fā)壞死細胞上升為14.2%（圖3）。

2.4 透射電鏡樣品制備與觀察TT細胞凋亡的形態(tài) 透射電鏡觀察空白對照組細胞的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)各細胞器、細胞核、染色體形態(tài)和分布均正常（圖4）。透射電鏡觀察2μg/ml紫草素作用24h后TT細胞，發(fā)現(xiàn)細胞結構出現(xiàn)兩種典型的形態(tài)改變：凋亡（圖5）和自噬體的形成（圖6）。

圖3 流式細胞術分析空白對照組和2μg/ml紫草素作用24、48h對TT細胞凋亡的影響（A：空白對照組；B：2μg/ml紫草素作用24h；C：2μg/ml紫草素作用48h）

圖4 透射電鏡：空白對照組細胞，各細胞器、細胞核、染色體形態(tài)和分布均正常（×25 000）

圖5 透射電鏡：2μg/ml紫草素作用24h的TT細胞，細胞全面皺縮，但胞膜結構保持完整，胞核固縮或崩解而彌散在胞質內，染色質濃縮并邊緣化（×8 000）

3 討論

MTC 1959年由Hazard首次描述，其生物學惡性度介于甲狀腺分化癌（乳頭狀癌和濾泡癌）與未分化癌之間，預后較乳頭狀癌和濾泡狀癌差。目前手術切除仍是其首選根治方式，然而在確診的同時大約50%～80%的患者已發(fā)生了頸部淋巴結轉移或遠處轉移，而對于進展期或晚期伴遠處轉移的患者手術難以徹底清除腫瘤，許多患者無法實施根治性手術。近年來中藥極其提取物在抗腫瘤方面取得了很好的成績，積極尋求對MTC治療有效的藥物具有重要意義。

圖6 透射電鏡：2μg/ml紫草素作用24h的TT細胞，胞內出現(xiàn)典型的自噬囊泡：雙層膜包繞的圓形或橢圓形結構（×25 000）

紫草為紫草科多年生草本植物新疆紫草或內蒙紫草的干燥根，在我國有悠久的藥用歷史，作為中藥最早記載于東漢時期的《神農本草經(jīng)》，具有清熱涼血，活血，解毒透疹之功效，治溫熱斑疹、濕熱黃疸、丹毒、癰瘍等。紫草素是從紫草的根部提取的一種萘醌類化合物，現(xiàn)代研究表明紫草素及其衍生物有多種藥理作用，如抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗真菌、抗病毒、促進傷口愈合等[2-5,8-10]。

紫草素的抗腫瘤作用首次被報道是在1977年，Sankawa指出5～10mg/（kg·d）的紫草素能有效對抗腹水腫瘤的活性，并在1981年應用X線對紫草素、紫草及其衍生物進行了分析，得出紫草、紫草素及其衍生物具有抗腫瘤的特性[11-12]。此后國內外對紫草素的抗腫瘤作用有了很多進展。據(jù)報道，紫草素具有抗腫瘤效果，對HL60人早幼粒細胞白血病細胞系[13]、肝癌[14]、前列腺癌[14]、大腸癌[15]、口腔鱗癌[16]、基底細胞癌[17]、骨肉瘤[18]均有作用，影響腫瘤細胞的代謝、增殖、分化、信號傳遞、基因表達等過程，阻礙腫瘤細胞的生長[19]。

本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度紫草素（0.5～4μg/ml）作用細胞24h，對TT細胞的抑制率由11.3%（0.5μg/ml）上升至51.4%（4μg/ml）；作用48h后，抑制率由15.8%（0.5μg/ ml）上升到62.7%（4μg/ml）。相同濃度的紫草素組對TT細胞增殖抑制率隨著時間的增加而上升。紫草素對TT細胞增殖的抑制作用呈劑量和時間雙重依賴性。流式細胞術檢測空白對照組細胞周期分布時未發(fā)現(xiàn)G0/G1期前的亞二倍體峰(凋亡峰)，2μg/ml濃度的紫草素處理細胞24h開始出現(xiàn)亞二倍體峰；4μg/ml紫草素處理組細胞出現(xiàn)明顯的G0/G1期前的亞二倍體峰；但未改變TT細胞周期的分布，提示紫草素抑制TT細胞增殖不是通過誘導細胞周期阻滯的途徑。

細胞凋亡早期改變之一是磷脂酞絲氨酸（PS）從細胞膜內轉移到細胞膜外。在正常細胞中，PS只分布在細胞膜脂質雙層的內側，而在細胞凋亡早期，細胞膜中PS由脂膜內側翻向外側。Annexin V是一種分子量為35～36kD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。因此Annexin V被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。本研究結果發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，2μg/ml濃度的紫草素作用TT細胞24h，早期凋亡細胞從0.2%（空白對照組）增至11.3%，凋亡后期繼發(fā)壞死的細胞，從0.1%（空白對照組）增至8.0%；2μg/ml紫草素處理48h后，早期凋亡細胞增至24.9%；凋亡后期繼發(fā)壞死的細胞，增至14.2%。這些結果表明，隨著藥物作用時間的上升紫草素誘導TT細胞凋亡和壞死的水平上升。

本研究以透射電鏡觀察細胞的超微結構可見部分典型的凋亡形態(tài)：微絨毛消失，細胞全面皺縮，細胞核碎裂，染色質濃聚形成半月體，細胞膜發(fā)泡，同時可見凋亡小體。此外，本研究通過電鏡檢測發(fā)現(xiàn)，紫草素處理TT細胞24h后，胞質內出現(xiàn)獨立雙層膜，且大部分呈彎曲或C型，另有一些雙層膜已包繞部分胞質或細胞器，甚至部分細胞核，形成封閉的雙側膜囊泡，即自噬體，表明紫草素誘導的TT細胞死亡中,有細胞發(fā)生了自噬性活化?？瞻讓φ战M以0.1%的DMSO處理細胞，細胞質內細胞器、細胞核、染色體形態(tài)和分布均正常，未見凋亡或自噬的典型形態(tài)。

綜上所述，紫草素通過誘導細胞凋亡和自噬抑制使人MTC TT細胞增殖，筆者將對紫草素誘導TT細胞凋亡及自噬的分子機制做進一步研究。

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Shikonin induces apoptosis of human thyroid carcinoma TT cells

Objective To investigate the effect of shikonin on proliferation of human thyroid carcinoma TT cells.MethodsHuman thyroid carcinoma TT cells were treated with shikonin in vitro.Cell proliferation was examined by MTT method,cell apoptosis was detected by flow cytometry.ResultsMTT assay showed that shikonin inhibited TT cell proliferation in a dose-and time-dependent manner(P＜0.01).Flow cytometry revealed sub-diploid(apoptosis)peaks in TT cells after treated with shikonin 2μg/ml and 4μg/ml for 24h;however,there was no cell cycles arrest.Annexin V-PE/7-AAD staining also demonstrated cell apoptosis.Electron microscopy showed typical morphological characteristics of autophagy and cell apoptosis after treatment of shikonin.ConclusionShikonin can inhibit proliferation of human thyroid carcinoma TT cells,which is associated with the cell apoptosis and autophagy.

Shikonin Medullary carcinoma of thyroid Cell proliferation Cell apoptosis

2013-08-09）

（本文編輯：嚴瑋雯）

浙江省自然基金課題（LY13H130003）

310006 杭州，浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科（唐旭霞）；浙江省人民醫(yī)院外科（葉再元）

葉再元，E-mail:yezhaiyuan@163.com