楊 穎，朱 軍，朱國強(qiáng)

（1．揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225009；2．江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009）

大腸桿菌Nissle 1917鞭毛蛋白部分高變區(qū)功能初步研究

楊 穎1,2，朱 軍1,2，朱國強(qiáng)1,2

（1．揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225009；2．江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009）

初步研究大腸桿菌Nissle 1917（E. coli Nissle 1917，EcN）鞭毛蛋白（Flagellin, FliC）高變區(qū)的功能，為探討其作為表面展示系統(tǒng)的可行性打下基礎(chǔ)。以EcN無質(zhì)?？寺。‥cN was cured of its 2 cryptic plasmids pMUT1 and pMUT2 resulting in EcNc）為實(shí)驗(yàn)菌株，分別構(gòu)建2個鞭毛蛋白基因（f iC）高變區(qū)859-888位、829-858位的缺失突變株和回補(bǔ)菌株。分析突變區(qū)域?qū)cNc的生長性能、生化特性、運(yùn)動性及抗原性等方面的影響。結(jié)果顯示：EcNc、兩個缺失株和回補(bǔ)株的生長特性無明顯差異，且三者生化試驗(yàn)結(jié)果一致。缺失突變株在半固體培養(yǎng)基上不能運(yùn)動，而回補(bǔ)株均恢復(fù)了原運(yùn)動性；缺失突變株均不與H1單因子血清發(fā)生凝集，而互補(bǔ)菌株均能產(chǎn)生與EcNc一致的凝集反應(yīng)。表明高變區(qū)的這兩個區(qū)域盡管不影響菌株的生長性能和生化特性，但與EcN的運(yùn)動性及抗原性密切相關(guān)。這為進(jìn)一步探索EcN鞭毛展示技術(shù)的研究提供了一定的數(shù)據(jù)。

大腸桿菌Nissle 1917；鞭毛蛋白；高變區(qū)

鞭毛蛋白（flagellin, FliC）是鞭毛的主要結(jié)構(gòu)蛋白，不同血清型大腸桿菌中的fliC基因有差異。FliC N端和C端高度保守，存在于鞭毛絲的軸心，是鞭毛發(fā)揮佐劑活性的重要部位；而中間區(qū)域暴露于鞭毛表面，在長度和組成上呈現(xiàn)高度變化，形成不同的抗原表位，這個區(qū)域被稱為“高變區(qū)”[1,2]。全部或部分缺失鞭毛蛋白高變區(qū)會使鞭毛的抗原性降低，但不會影響其佐劑活性[3]。鑒于高變區(qū)可容許部分區(qū)域的缺失和外源多肽插入[4,5]，基于此建立的鞭毛表面展示技術(shù)被廣泛地運(yùn)用于構(gòu)建新型活疫苗的研究[6-8]。

益生菌大腸桿菌Nissle 1917（EcN）因其獨(dú)特的性質(zhì)，諸如無致病性，能合成小菌素、鐵攝取系統(tǒng)，強(qiáng)有力的腸道定殖能力等，一直被用作益生制劑。目前，EcN在臨床上主要用于治療腹瀉、炎癥性腸炎以及便秘等[9-11]。鑒于EcN可攜帶外源基因在腸道表達(dá)，激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，適合用于生物載體口服活苗的候選株[12,13]。

本試驗(yàn)以EcN鞭毛為切入點(diǎn)，構(gòu)建了EcNcfliC基因高變區(qū)缺失突變株EcNc::fliC1、EcNc::fliC2和回補(bǔ)菌株EcNc::fliC1/pBR322-fliC、EcNc::fliC2/pBR322-fliC。分析突變區(qū)域?qū)cNc的生長性能、生化特性、運(yùn)動性及抗原性等方面的影響。

1 材料和方法

1.1 材料本研究中用到的質(zhì)粒和菌株見表1。

表1 質(zhì)粒和菌株Table 1 Bacterial strains and plasmids

1.2 生化試劑限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker為TaKaRa公司產(chǎn)品；Expand Long Range dNTPack購自Roche公司；大腸桿菌H1抗原單價血清購自天津生物芯片技術(shù)有限公司；蔗糖購自Sigma公司。

1.3 EcNc fiC的克隆和鑒定以EcNc基因組DNA為模板，P1、P2（P1：5′-GGCTCTAGAATGGCACAAG TCATTAATACCAACA-3′；P2：5′-ATAGAGCTCTTAACCCTGCAGCAGAGAC-3′）為引物PCR擴(kuò)增得到fliC片段，下劃線為XbaⅠ和SacⅠ酶切位點(diǎn)，與pUC18同時雙酶切、膠回收后，用T4連接酶連接、轉(zhuǎn)化DH5α，并挑取疑似陽性重組子，進(jìn)行酶切鑒定和測序，獲得pUC18-fliC。

1.4 fiC1和fiC2缺失突變片段引物的設(shè)計(jì)

1.4.1 用于fliC1突變片段的正向及反向引物

fliC1突變片段正向引物P3：5′-CATCTCGAG ACAATCGGAGGACAGGAAGC-3′；fliC1突變片段反向引物P4：5′- ACTCTCGAGCACTTCACC GCTTGCTGCTT- 3′。其中，在正向引物和反向引物的5′端加入保護(hù)堿基和CTCGAG堿基序列，替代fliC859-888位堿基。

1.4.2 用于fliC2突變片段的正向及反向引物

fliC2突變片段正向引物P5：5′-CATCTCGAG AACTTTGATGTTGATGCGAATG-3′；fliC2突變片段反向引物P6：5′-ACTCTCGAGACTAGCAG TTTGCCCAGCC-3′。其中，在正向引物和反向引物的5′端加入保護(hù)堿基和CTCGAG堿基序列，替代fliC829-858位堿基。

1.5 缺失突變株及回補(bǔ)株的構(gòu)建以pUC18-fliC質(zhì)

粒為模板，P3和P4、P5和P6為引物分別進(jìn)行反向PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)XhoⅠ酶切、T4連接酶連接、轉(zhuǎn)化DH5α，挑取疑似陽性重組子進(jìn)行酶切鑒定和測序，獲得pUC18-fliC1、pUC18-fliC2。根據(jù)朱春紅等[14]介紹的自殺性載體技術(shù)構(gòu)建EcNc fliC基因高變區(qū)缺失突變株EcNc::fliC1、EcNc::fliC2，即用XbaⅠ和SacⅠ對pUC18-fliC1、pUC18-fliC2和自殺載體pRE112分別進(jìn)行雙酶切，將fliC1、fliC2片段分別與線形的pRE112質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化E.coliCC118 λpir，并挑取疑似陽性重組子進(jìn)行酶切鑒定，獲得pRE112-fliC1、pRE112-fliC2。提取質(zhì)粒pRE112-fliC1、pRE112-fliC2分別轉(zhuǎn)化至EcNc感受態(tài)，篩選氯霉素抗性菌，此抗性菌即為疑似一次重組菌。將一次重組菌劃線LB（Cm 34 ug/mL）平板傳代純化后挑取單菌落接種4 mL LB（NaCl free）液體培養(yǎng)基，37 ℃震蕩培養(yǎng)至OD600約為0.5時分別涂布含蔗糖的LB（sucrose 10%，NaCl free）瓊脂平板。從含蔗糖的LB平板上選擇氯霉素抗性敏感的菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增后測序，驗(yàn)證缺失突變位點(diǎn)，篩選基因缺失突變株EcNc::fliC1、EcNc::fliC2。

以EcNc基因組DNA為模板，P7、P8（P7：5′-GCTCTAGAATGGCACAAGTCATTAATACCA ACAG-3′，P8：5′- CAGCGTCGACTTAACCCTGC AGCAGAGACAGAAC-3′）為引物，PCR 擴(kuò)增得到互補(bǔ)片段fliC基因全長，連接到pBR322載體構(gòu)建重組質(zhì)粒pBR322-fliC，酶切鑒定后，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到缺失突變株 EcNc::fliC1、EcNc::fliC2，構(gòu)建回補(bǔ)菌株。

1.6 細(xì)菌生長、生化特性、運(yùn)動性及H1抗原性血清學(xué)測定按照常規(guī)方法進(jìn)行EcNc、缺失突變株及回補(bǔ)株生長曲線的測定，將過夜生長的種子液OD600調(diào)整為1.0后1:100轉(zhuǎn)接于新鮮的LB中，間隔1 h測取各菌液OD600的數(shù)值繪制生長曲線。將EcNc、缺失突變株及回補(bǔ)株分別純化培養(yǎng)，進(jìn)行生化鑒定。對菌株進(jìn)行運(yùn)動性檢測，取60 μL過夜的種子液重新轉(zhuǎn)接于6 mL新鮮的LB培養(yǎng)，然后將EcNc、缺失突變株及回補(bǔ)株分別稀釋至OD600=1.0，各取1 μL滴加于0.3%的半固體運(yùn)動平皿上，37 ℃生長約24 h，觀察運(yùn)動圈的大小。按照常規(guī)玻片凝集試驗(yàn)進(jìn)行EcNc、缺失突變株及回補(bǔ)株鞭毛H1抗原性血清學(xué)測定。

2 結(jié)果

2.1 pUC18-f iC的構(gòu)建擴(kuò)增fliC基因連接到pUC18，經(jīng)雙酶切和測序表明，EcNcfliC基因（約1800 bp）成功克隆到pUC18質(zhì)粒載體中（圖1）。

圖1 質(zhì)粒pUC18-f iC酶切鑒定Fig.1 Identif cation of the plasmid pUC18-f iC by restriction enzymes digestion

2.2 缺失突變菌株與回補(bǔ)菌株的構(gòu)建如圖2所示，反向PCR擴(kuò)增在約4500 bp處有明亮的特異性電泳條帶，在兩個缺失突變體轉(zhuǎn)化的平板上分別隨機(jī)挑選克隆，提取質(zhì)粒大小約2900 bp，通過雙酶切鑒定，獲得缺失突變片段fliC1、fliC2及與載體片段pUC18大小相同的DNA條帶，測序結(jié)果均與預(yù)期相符（圖3中劃橫線處表示發(fā)生突變的堿基序列）。將fliC1、fliC2片段連接到自殺載體pRE112，轉(zhuǎn)化E.coliCC118 λpir。從轉(zhuǎn)化平板上挑取單個菌落提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果均與預(yù)期的大小相同。pRE112-fliC1、pRE112-fliC2分別轉(zhuǎn)化到EcNc中，經(jīng)過第一次同源重組和第二次同源重組篩選到的菌株，擴(kuò)增其鞭毛蛋白基因測序，證實(shí)獲得了fliC859-888位以及829-858位堿基被CTCGAG堿基序列替換的缺失突變株EcNc::fliC1、EcNc::fliC2（圖略）?；匮a(bǔ)菌株在Amp+LB平板上篩選，進(jìn)行質(zhì)粒提取和酶切分析驗(yàn)證（圖4），獲得了回補(bǔ)菌株EcNc::fliC1/pBR322-fliC、EcNc::fliC2/pBR322-fliC。

圖2 pUC18-f iC1、pUC18-f iC2的構(gòu)建Fig.2 Construction of pUC18-f iC1 and pUC18-f iC2

圖3 fliC1和fliC2缺失突變片段的測序結(jié)果Fig.3 DNA sequencing results of mutant fragments

圖4 質(zhì)粒pBR322-f iC酶切鑒定Fig.4 Identif cation of the plasmid pBR322-f iC by restriction enzymes digestion

2.3 生長能力、生化特性、運(yùn)動性及H1抗原性血清學(xué)測定圖5所示EcNc、缺失突變株及回補(bǔ)株在LB培養(yǎng)基中的生長曲線，表明EcNc在對數(shù)期的生長速率略高于缺失株和回補(bǔ)株，但無明顯差異。生化試驗(yàn)結(jié)果顯示，EcNc、缺失突變株及回補(bǔ)株在麥芽糖、葡萄糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、硫化氫、檸檬酸鈉等代謝分解利用上并無定性差異，均為α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶陽性。運(yùn)動性平板檢測細(xì)菌運(yùn)動性，24 h后觀察，缺失突變株不具有運(yùn)動能力，細(xì)菌只在接種的原點(diǎn)生長，而回補(bǔ)株可以恢復(fù)到EcNc的運(yùn)動水平（圖6）。凝集反應(yīng)顯示缺失突變株均不與H1單因子血清發(fā)生凝集，而回補(bǔ)菌株能產(chǎn)生與EcNc一致的凝集反應(yīng)。

圖5 EcNc、缺失突變株及回補(bǔ)株的生長曲線Fig.5 Growth curve of strains

圖6 EcNc、缺失突變株及回補(bǔ)株的運(yùn)動性Fig.6 Motility of strains

3 討論

黏膜是機(jī)體與外界環(huán)境接觸的最前沿，是機(jī)體的第一道屏障，研發(fā)的黏膜免疫疫苗尤其是口服活疫苗在臨床上期待有很好的療效[15]。眾多研究表明益生菌EcN的優(yōu)勢[9-11]，且適合作為生物載體口服活苗候選株，攜帶外源基因在腸道靶向表達(dá)，激活機(jī)體的黏膜免疫系統(tǒng)[12-13]。EcN在運(yùn)動性試驗(yàn)中體現(xiàn)出強(qiáng)大的運(yùn)動能力，較短時間內(nèi)出現(xiàn)較大的運(yùn)動環(huán)，這有賴于它自身的鞭毛系統(tǒng)。EcN的鞭毛不僅介導(dǎo)菌體的運(yùn)動性，而且能誘導(dǎo)人體產(chǎn)生β防御素-2。最近的報道表明，鞭毛具有較強(qiáng)的黏附能力，促進(jìn)菌體在腸道的定殖[16-17]。FliC是鞭毛的主要結(jié)構(gòu)蛋白，其N端和C端高度保守區(qū)含有與TRL5的結(jié)合位點(diǎn)，主要介導(dǎo)鞭毛蛋白的佐劑活性；中部的高變區(qū)是鞭毛蛋白的抗原區(qū)域，該區(qū)域能允許部分缺失和容納一定的外源多肽，使鞭毛攜帶外源抗原在菌體表面表達(dá)。早在1988年，Kuwajima等[4]就隨機(jī)缺失大腸桿菌K-12鞭毛蛋白高變區(qū)以研究該區(qū)域的缺失和短肽的插入對H抗原性的影響。Benita等[5]把金黃色葡萄球菌纖連蛋白結(jié)合蛋白A（FnbpA）、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌粘附素YadA的不同肽段嵌合入大腸桿菌JT1鞭毛蛋白高變區(qū)，將不同肽段功能性地展示于大腸桿菌表面。在部分沙門氏菌和大腸桿菌中，鞭毛高變區(qū)嵌合表達(dá)外源抗原的方法已成功地應(yīng)用于活菌疫苗的研制[6]。

本試驗(yàn)構(gòu)建了EcNc fliC基因高變區(qū)缺失突變株EcNc::fliC1、EcNc::fliC2及其回補(bǔ)株EcNc::fliC1/pBR322-fliC、EcNc::fliC2/pBR322-fliC，同時對EcNc、缺失突變株及回補(bǔ)株的生長性能、生化特性、運(yùn)動性及抗原性進(jìn)行了測定。三者的生化特性一致，生長性能沒有顯著差異，說明缺失突變區(qū)域不影響菌株的生長，這與賀揚(yáng)等[18]對遲緩愛德華氏菌野生株、fliC基因突變株及回補(bǔ)株生長性能的測定結(jié)果不一致，他們的結(jié)果顯示突變株的生長速度明顯低于野生株和回補(bǔ)株，且突變株所能達(dá)到的最大密度只有野生株和回補(bǔ)株的29%。EcN FliC基因高變區(qū)859～888位、829～858位的缺失使菌株失去了運(yùn)動性和抗原性。Troge等[19]構(gòu)建的EcN高變區(qū)缺失株亦喪失了運(yùn)動性能。楊菁毅等[2]將HIV-1 p24蛋白替換了E. coliK12鞭毛蛋白的可變區(qū)去除了鞭毛蛋白自身的免疫原性。劉芳等[20]構(gòu)建的3個沙門氏菌鞭毛蛋白高變區(qū)（190～278、220～320、180～400）缺失株均失去了H抗原性，說明高變區(qū)域?qū)ζ淇乖跃哂兄匾绊?。FliC高變區(qū)的缺失可能引起鞭毛形成壓力，影響了FliC亞基之間或者FliC和其他鞭毛的蛋白之間相互作用的穩(wěn)定性[4]，破壞了FliC的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，二級結(jié)構(gòu)的改變亦可能不利于FliC通過孔道運(yùn)輸，而這是鞭毛進(jìn)行組裝的關(guān)鍵[21]，即便FliC通過了孔道運(yùn)輸組裝成鞭毛絲，但鞭毛脆性增加容易斷落，這也影響了其運(yùn)動性能[19]。今后的實(shí)驗(yàn)將嘗試在高變區(qū)的其他區(qū)域進(jìn)行缺失和插入外源多肽，這將為EcN鞭毛展示技術(shù)的應(yīng)用提供了一定的數(shù)據(jù)，為探索大腸桿菌Nissle 1917鞭毛作為運(yùn)送載體的可行性打下基礎(chǔ)。

[1] Smith K D, Andersen-Nissen E, Hayashi F,et al. Tolllike receptor 5 recognizes a conserved site on flagellin required for protofilament formation and bacterial motility[J]. Nat Immunol, 2003, 4(12): 1247-1253.

[2] Yang J, Zhong M, Zhang Y,et al. Antigen replacement of domains D2 and D3 in flagellin promotes mucosal IgA production and attenuates flagellin-induced inflammatory response after intranasal immunization[J]. Hum Vaccin Immunother, 2013, 9(5): 1084-1092.

[3] Nempont C, Cayet D, Rumbo M,et al. Deletion of flagellin's hypervariable region abrogates antibodymediated neutralization and systemic activation of TLR5-dependent immunity[J]. J Immunol, 2008, 181(3): 2036-2043.

[4] Kuwajima G. Construction of a minimum-size functional flagellin of Escherichia coli[J]. J Bacteriol, 1988, 170(7): 3305-3309.

[5] Westerlund-Wikstrom B, Tanskanen J, Virkola R,et al. Functional expression of adhesive peptides as fusions to Escherichia coli flagellin[J]. Protein Eng, 1997, 10(11): 1319-1329.

[6] Westerlund-Wikstrom B. Peptide display on bacterial flagella: Principles and applications[J]. Int J Med Microbiol, 2000, 290(3): 223-230.

[7] Ben-Yedidia T, Arnon R. Flagella as a platform for epitope-based vaccines[J]. Isr Med Assoc J, 2006, 8(5): 316-318.

[8] Zhang H, Liu L, Wen K,et al. Chimeric flagellin expressed by Salmonella typhimurium induces an ESAT-6-specific Th1-type immune response and CTL effects following intranasal immunization[J]. Cell Mol Immunol, 2011, 8(6): 496-501.

[9] Willer Y, Muller B, Bumann D. Intestinal inflammation responds to microbial tissue load independent of pathogen/non-pathogen discrimination[J]. PloS One, 2012, 7(5): e35992.

[10] Zhou S, Zhang M, Wang J. Tumor-targeted delivery of TAT-Apoptin fusion gene using Escherichia coli Nissle 1917 to colorectal cancer[J]. Med Hypotheses, 2011, 76(4): 533-534.

[11] Seo E J, Weibel S, Wehkamp J,et al. Construction of recombinant E. coli Nissle 1917 (EcN) strains for the expression and secretion of defensins[J]. Int J Med Microbiol, 2012, 302(6): 276-287.

[12] Buddenborg C, Daudel D, Liebrecht S,et al. Development of a tripartite vector system for live oral immunization using a gram-negative probiotic carrier[J]. Int J Med Microbiol, 2008, 298(1-2): 105-114.

[13] Remer K A, Bartrow M, Roeger B,et al. Split immune response after oral vaccination of mice with recombinant Escherichia coli Nissle 1917 expressing fmbrial adhesin K88[J]. Int J Med Microbiol, 2009, 299(7): 467-478.

[14] 朱春紅, 孫小慶, 何素芬, 等. 基于Red同源重組和高效自殺性載體系統(tǒng)構(gòu)建腸炎沙門氏菌突變株方法的比較[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報, 2009, 31(2): 81-84.

[15] Pasetti M F, Simon J K, Sztein M B,et al. Immunology of gut mucosal vaccines[J]. Immunol Rev, 2011, 239(1): 125-148.

[16] Zhou M, Duan Q, Zhu X,et al. Both flagella and F4 fimbriae from F4ac(+) enterotoxigenic Escherichia coli contribute to attachment to IPEC-J2 cells in vitro[J]. Vet Res, 2013, 44(1): 30.

[17] Duan Q, Zhou M, Zhu X,et al. Flagella from F18+Escherichia coli play a role in adhesion to pig epithelial cell lines[J]. Microb Pathog, 2013, 55: 32-33.

[18] He Y, Xu T, Fossheim L E,et al. FliC, a Flagellin Protein, Is Essential for the Growth and Virulence of Fish Pathogen Edwardsiella tarda[J]. PloS One, 2012, 7(9): e45070.

[19] Troge A, Scheppach W, Schroeder B O,et al. More than a marine propeller-the fagellum of the probiotic Escherichia coli strain Nissle 1917 is the major adhesin mediating binding to human mucus[J]. Int J Med Microbiol, 2012, 302(7-8): 304-314.

[20] Liu F, Yang J, Zhang Y,et al. Recombinant fagellins with partial deletions of the hypervariable domain lose antigenicity but not mucosal adjuvancy[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2010, 392(4): 582-587.

[21] Okuda J, Murayama F, Yamanoi E,et al. Base changes in the fliC gene of Edwardsiella tarda: possible effects on flagellation and motility[J]. Dis Aquat Organ, 2007, 76(2): 113-121.

PRELIMINARY STUDY ON THE FUNCTIONAL ROLE OF FLAGELLIN PARTIAL HYPERVARIABLE DOMAIN OF ESCHERICHIA COLI NISSLE 1917

YANG Ying1,2, ZHU Jun1,2, ZHU Guo-qiang1,2
(1. College of Veterinary Medicine Yangzhou University, Yangzhou 225009, China; 2. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China)

The function of E. coli Nissle 1917 Flagellin partial hypervariable domain was investigated, it provided a basis for the potential approach of using E. coli Nissle 1917 Flagellin as a carrier for foreign peptides. We constructed two EcNc fagellin variants with deletions in the hypervariable domain 859-888 bp and 829-858 bp as well as their complemented strains. The bacterial growth, biochemical characteristics, motility and antigenicity were tested and analyzed. There were no apparent difference in growth rate and biochemical characteristics among EcNc,variants and complemented strains. Two variants exhibited abrogated motility, while the complementation strains restored the phenotype of EcNc, meanwhile, two variants lost substantial H antigenicity compared with both EcNc and complemented strains. EcNc fagellin variants with partial deletions of the hypervariable domain lose motility and antigenicity but did not inf uence growth rate and biochemical characteristics. These results provided an important experimental data and clues forexploration of peptide display on EcN f agella in the future.

E. coli Nissle 1917; f agellin; hypervariable domain

S852.612

A

1674-6422（2014）01-0037-07

2013-11-07

國家自然科學(xué)基金（30571374；30771603；31072136；31270171）；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目；教育部創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)；科技部轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)（2009ZX08006-004B）；重大動物疫病防控技術(shù)引進(jìn)（國家農(nóng)業(yè)部948計(jì)劃，2011-G24）

楊穎，女，博士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

朱國強(qiáng)，E-mail：yzgqzhu@hotmail.com；yzgqzhu@yzu.edu.cn