高 飛，鄭 浩，姜一峰，李麗薇，鄭海紅，周艷君，韋祖樟，童光志

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2. 廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530005）

·研究論文·

豬繁殖與呼吸綜合征病毒5'非翻譯區(qū)一頂端莖環(huán)結(jié)構(gòu)是病毒復(fù)制轉(zhuǎn)錄必需的順式作用元件

高 飛1，鄭 浩1，姜一峰1，李麗薇1，鄭海紅1，周艷君1，韋祖樟2，童光志1

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2. 廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530005）

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）基因組5' 非翻譯區(qū) (untranslated region，UTR)對(duì)病毒復(fù)制轉(zhuǎn)錄等生物合成過(guò)程至關(guān)重要，但其作用機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)室分別在北美型（pAPRRS) 與歐洲型PRRSV（pSHE) 感染性克隆骨架的5' UTR與ORF1之間插入堿基”at”形成Nde I位點(diǎn)，構(gòu)建了兩個(gè)突變體pTLNd4和pSHEnde。結(jié)果顯示插入后的堿基未影響病毒感染性。以兩株突變體為骨架將兩株感染性克隆的5' UTR互換，構(gòu)建了突變體克隆pTLV8和pSHSP5。結(jié)果表明pTLV8仍具有感染性，而pSHSP5株拯救出病毒。對(duì)pSHSP5和pTLV8的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，雖然嵌合突變體pTLV8的5' 端與親本pAPRRS的二級(jí)結(jié)構(gòu)差異較大，但轉(zhuǎn)錄調(diào)控序（transcription-regulating sequence, TRS）仍位于頂端莖環(huán)結(jié)構(gòu)最突出的位置，并保證了TRS與ORF1之間的起始密碼子AUG位于該莖環(huán)結(jié)構(gòu)的頂端，而pSHSP5的頂端莖環(huán)結(jié)構(gòu)則遭到了破壞。本研究結(jié)果表明TRS所在的頂端莖環(huán)結(jié)構(gòu)在調(diào)控病毒復(fù)制轉(zhuǎn)錄過(guò)程中是關(guān)鍵的順式作用元件之一，對(duì)其結(jié)構(gòu)破壞的突變體將不能拯救出病毒。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒；5'非翻譯區(qū)；嵌合突變體；轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列；二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

單股正鏈RNA病毒基因組的5'非翻譯區(qū)（5' untranslated region，5'UTR）是病毒復(fù)制的關(guān)鍵，在許多的生物合成過(guò)程中也發(fā)揮作用。5' UTR中的一些重要的二級(jí)結(jié)構(gòu)能防止基因組RNA被核酸外切酶降解[1]，例如脊髓灰質(zhì)炎病毒5' 端的一個(gè)苜蓿葉狀的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)于基因組RNA的穩(wěn)定性至關(guān)重要[2]。5' UTR對(duì)RNA合成也是決定性的，在登革熱病毒中，5' 末端的一個(gè)莖環(huán)RNA結(jié)構(gòu)能夠作為病毒的RNA依賴的RNA聚合酶（RNA-dependent polymerase, RdRP）結(jié)合位點(diǎn)，通過(guò)長(zhǎng)距離的RNA-RNA相互作用促使5' 末端與基因組的3' 端模板識(shí)別啟動(dòng)特定的RNA的合成[3,4]。如脊髓灰質(zhì)炎病毒的苜蓿葉狀結(jié)構(gòu)不僅能穩(wěn)定基因組，還是病毒基因組正鏈和負(fù)鏈RNA合成所必需的[5,6]。在對(duì)動(dòng)脈炎病毒科的馬動(dòng)脈炎病毒的研究中發(fā)現(xiàn)，其5'末端的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列（transcriptional regulatory sequence，TRS）所在的先導(dǎo)序列中的頂端莖環(huán)結(jié)構(gòu)在病毒亞基因組轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮著啟動(dòng)子的作用。動(dòng)脈炎病毒科中其他成員及冠狀病毒的5'末端序列結(jié)構(gòu)分析中也預(yù)測(cè)了同樣的結(jié)構(gòu)，因此其很有可能是是病毒亞基因組mRNA轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵性結(jié)構(gòu)因子并且對(duì)TRS功能的發(fā)揮起著關(guān)鍵作用[7,8]。此外5' UTR還可對(duì)病毒蛋白的翻譯進(jìn)行調(diào)控，例如黃病毒科[9]和小RNA病毒科[10,11]的一些成員中，發(fā)現(xiàn)5' UTR中擁有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（internal ribosomal entry site，IRES）這樣的結(jié)構(gòu)元件對(duì)蛋白翻譯進(jìn)行調(diào)控。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒 (Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)，屬于套式病毒目、動(dòng)脈炎病毒科、動(dòng)脈炎病毒屬。根據(jù)血清型分型可以將PRRSV分為歐洲型（type I）和北美型（type II）兩種[12,13]。它是一種擁有單股正鏈RNA基因組的小囊膜病毒，病毒的基因組長(zhǎng)約為15 kb，兩端分別為5' 和3' UTR，在3' 末端還有一段poly (A)尾?；蚪M至少擁有9個(gè)開(kāi)放閱讀框 (open reading frame, ORF: ORF1a、1b、2a、2b、ORF3-7)[14]。根據(jù)序列分析，兩型5' UTR區(qū)域的長(zhǎng)度不同，序列同源性只有約50%。但是在所有株的PRRSV中，二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)不少保守的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，推測(cè)它們會(huì)在病毒復(fù)制過(guò)程中發(fā)揮作用。

本研究基于反向遺傳操作技術(shù)，在北美型PRRSV（type 2）和歐洲型（type 1）PRRSV的感染性克隆骨架上（pAPRRS[15,16]、pSHE[17])，對(duì)二者 5' UTR進(jìn)行互換，構(gòu)建相應(yīng)的嵌合突變體pTLV8和pSHSP5。經(jīng)過(guò)DNA轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞，傳代至第2代能拯救出嵌合病毒vAPLV5，而pSHSP5則是一個(gè)致死性突變體。對(duì)pSHSP5以及pTLV8進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，嵌合突變體pTLV8保留了5'端TRS所在的頂端莖環(huán)結(jié)構(gòu)，而pSHSP5 的5'端TRS所在的頂端莖環(huán)結(jié)構(gòu)則遭到了破壞。對(duì)另一突變體pPa2的研究中也發(fā)現(xiàn)突變破壞了此莖環(huán)結(jié)構(gòu)。綜上所述，本研究證明了TRS和ORF1的起始密碼子所在的頂端莖環(huán)結(jié)構(gòu)是調(diào)控病毒復(fù)制轉(zhuǎn)錄過(guò)程的關(guān)鍵順式作用元件之一，任何對(duì)其破壞的突變都是致死性突變。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與病毒 乳倉(cāng)鼠腎細(xì)胞 （BHK-21, ATCC No. CCCL10) 和非洲綠猴腎細(xì)胞 （Marc-145，No. CRL-12219，Manassas，VA）由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所豬病實(shí)驗(yàn)室（以下簡(jiǎn)稱本實(shí)驗(yàn)室）保存；vAPRRS（GenBank 登錄號(hào)：GQ330474）在本實(shí)驗(yàn)室中作為親本病毒對(duì)照與其他嵌合病毒和突變病毒作比較，同時(shí)它也作為與vSHE（GenBank 登錄號(hào)：GQ461593）5' UTR替換的骨架。

1.1.2 試劑 突變PCR聚合酶為Pfu Turbo?Hotstart DNA Polymerase，購(gòu)自Strategene公司；限制性內(nèi)切酶購(gòu)自NEB和TaKaRa公司；TOP10感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自TIANGEN公司；化學(xué)轉(zhuǎn)染試劑FuGENE?HD購(gòu)自Roche公司；Lipofectamine LTX/PLUS試劑、OPTI-MEM購(gòu)自Invitrogen公司；RT-PCR反轉(zhuǎn)錄酶為AMV，購(gòu)自TaKaRa公司；Northern雜交試劑購(gòu)自Ambion公司。

1.1.3 主要儀器 超凈工作臺(tái)，上海三超凈化設(shè)備有限公司；PCR儀，DNA Thermal Cycler 480，美國(guó)PERKIN ELMER公司生產(chǎn)；恒溫培養(yǎng)搖床，型號(hào)THZ-C，江蘇太倉(cāng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；恒溫培養(yǎng)箱，上海醫(yī)療器械七廠；水平電泳儀，型號(hào)DY-a，上?？颠_(dá)電子儀器廠生產(chǎn)；熒光倒置顯微鏡，Olympas公司；離心機(jī)，型號(hào)5415D，Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 突變體構(gòu)建 type 1 PRRSV和type 2 PRRSV全長(zhǎng)感染性克隆pSHE 和 pAPRRS以及type 1 5' UTR type 2骨架嵌合克隆pTLV8由本研究室構(gòu)建[16]。在pSHE的5' UTR與ORF1之間插入“at”形成Nde I位點(diǎn)，由此形成的全長(zhǎng)突變體是pSHEnde，在pSHEnde的基礎(chǔ)上，將pAPRRS的5' UTR替換入pSHE中，構(gòu)建了嵌合突變體pSHSP5。所有突變質(zhì)粒均經(jīng)過(guò)突變位點(diǎn)測(cè)序及Sma I酶切鑒定。以pAPRRS為骨架，利用Afl II和Spe I酶切使其缺失1693～13 116 nt片段，構(gòu)建了復(fù)制功能缺失的質(zhì)粒pAS作為檢測(cè)復(fù)制的陰性對(duì)照[15,17]。所用到的引物見(jiàn)表1。

表1 文中所用的引物和探針Table1 Primers and probes for this study

1.2.2 病毒拯救及鑒定 待六孔板的BHK-21細(xì)胞長(zhǎng)到密度大約為60%～80%時(shí)，用Lipofectamine LTX & PLUS試劑（Invitrogen，Carlsbad，CA） 以等量（3.75 μg） 全長(zhǎng)突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，在5% CO2、37℃溫箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染72 h后，收集上清，并接種于Marc-145細(xì)胞，每天觀察細(xì)胞病變（cytopathic effect，CPE）。當(dāng)出現(xiàn)80%的病變時(shí)，收集上清并保存于-70℃，作為初次拯救的病毒，標(biāo)記為P0。P0代病毒液稀釋1000倍后，接種于新鮮的MARC-145細(xì)胞，感染后d4收集病毒上清，標(biāo)記為P1，以相同的方式收集P2～P5代病毒。

傳代的病毒上清用QIAamp Viral RNA Mini Kit（QIAgen，Hilden，Germany）提取病毒RNA，參考說(shuō)明書進(jìn)行操作。以提取好的RNA為模板，使用TaKaRa公司的AMV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行病毒RNA反轉(zhuǎn)錄，引物Qst（序列見(jiàn)表1），得到相應(yīng)的cDNA，利用該模板及相應(yīng)的引物得到突變位點(diǎn)所在的PCR片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定及純化后，送Invitrogen公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用DNAStar軟件與vAPRRS和vSHE基因進(jìn)行比對(duì)。

1.2.3 負(fù)鏈基因組復(fù)制及亞基因組mRNA轉(zhuǎn)錄水平分析 以提取的細(xì)胞總RNA為模板，用引物Qst進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，共20 μL體系，接著42℃水浴1 h，最后冰浴2 min，接著進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

首先進(jìn)行β-actin內(nèi)參擴(kuò)增，PCR上下游引物為F-actin和 R-actin。共25 μL體系，PCR反應(yīng)參數(shù)為：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸20 s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，然后取5 μL PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳中鑒定結(jié)果。

以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板PCR擴(kuò)增sg mRNA 7，擴(kuò)增sg mRNA 7的4對(duì)引物：SF12/SR15284、SFLV1/ SR15284、SFLV1/SRLV14835、SF12/SRLV14835。共25 μL體系，PCR反應(yīng)參數(shù)：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，63℃（sg mRNA 7）退火30 s，72℃延伸30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。取25 μL PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳中鑒定結(jié)果。

用DNA-free? kit中的DNAase I（Ambion） 處理提取的細(xì)胞總RNA中殘余的質(zhì)粒DNA，具體處理方法參見(jiàn)產(chǎn)品說(shuō)明書。再以處理好的細(xì)胞總RNA為模板，用引物SF12/SFLV101進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，共20 μL體系，42℃恒溫水浴1 h，最后冰浴靜置2 min。

為了消除cDNA中殘留RNA對(duì)后續(xù)試驗(yàn)的影響，每10 μL cDNA中加入1 μL RNAase A，置于37℃水浴30 min，隨后95℃水浴滅活RNase A 10 min。

以處理好的cDNA為模板PCR擴(kuò)增負(fù)鏈基因組（(-) gRNA），第一輪PCR反應(yīng)所用的4對(duì)引物：SF12/SR683、SFLV101/SR683、SFLV101/ SRLV572、SF12/SRLV572。將第一輪PCR的產(chǎn)物進(jìn)行1:1000稀釋，以此為模板進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)，所用到的4對(duì)引物：SF12/SR343、SFLV101/SR343、SFLV101/SRLV378、SF12/SRLV378。

1.2.4 間接免疫熒光（immunofluorescence analysis，IFA） BHK-21細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后，棄去維持液培養(yǎng)基。用冰甲醇固定10 min，1% BSA室溫封閉30 min，用1:600的PRRSV N蛋白的特異性單抗（美國(guó)South Dakota State University的Dr. Ying Fang惠贈(zèng)）37℃孵育2 h，再加入Alexa Red標(biāo)記羊抗鼠的二抗1: 800，37℃孵育1 h，PBS洗5遍后，在倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，并拍照保存。

1.2.5 拯救病毒的生物學(xué)特性分析

1.2.5.1 空斑形態(tài)學(xué)分析 將本研究中所有的第3代（P3）拯救病毒用DMEM系列稀釋后，取300 μL感染六孔板中的Marc-145細(xì)胞，37℃孵育1 h后，棄掉病毒液，加入等比例的2%低熔點(diǎn)瓊脂糖與2×MEM，再加入4% FBS（終濃度為含2%FBS的MEM，含1%的瓊脂糖），5 mL/孔鋪到細(xì)胞板中。室溫凝固后，于37℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)4～5 d，觀察，待出現(xiàn)空斑后，在孔中加入2 mL 4%的甲醛溶液固定1 h，甩掉凝膠，用5%結(jié)晶紫溶液（溶于20%乙醇溶液）染色。

1.2.5.2 第一輪（first cycle）拯救病毒滴度測(cè)定 將本研究中所有的全長(zhǎng)突變體按照1.2.2的轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染80%密度的六孔板BHK-21細(xì)胞。待轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清在Marc-145細(xì)胞上進(jìn)行第一輪病毒TCID50[18]滴定。具體操作步驟如下：90%密度的Marc-145細(xì)胞在96孔板上培養(yǎng)，用2% FBS的EMEM進(jìn)行10倍比稀釋，每孔100 μL上清及上清倍比稀釋液覆蓋細(xì)胞單層，每個(gè)稀釋度重復(fù)4孔，感染5 d后，根據(jù)每孔產(chǎn)生CPE的情況，按照計(jì)算公式，計(jì)算病毒滴度，用GraphPad軟件繪出病毒滴度的柱狀圖。

1.2.5.3 多步生長(zhǎng)曲線的繪制 將300 μL系列傳代的P5代病毒上清（0.01MOI）接種于Marc-145細(xì)胞，37℃孵育1 h后，棄掉病毒液，每孔補(bǔ)充3 mL含有2%FBS的MEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，并在不同時(shí)間點(diǎn)（6、12、24、36、48、60、72、84、96、108、120 h）收集200 μL細(xì)胞上清，同時(shí)補(bǔ)充200 μL新的含2%FBS的MEM培養(yǎng)基。測(cè)定每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的病毒滴度并以TCID50[18]表示，并根據(jù)計(jì)算出的病毒滴度用GraphPad軟件繪制病毒的多步生長(zhǎng)曲線。

1.2.6 RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 利用mfold 網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器V2.3對(duì)PRRSV 5′UTR比對(duì)后形成的保守序列進(jìn)行RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，服務(wù)器地址為 http：// frontend.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/cgi-bin/ rna-form1-2.3.cgi。使用服務(wù)器默認(rèn)的參數(shù)（37℃, 1 mol/L Nacl，no divalent ions, and no limit on distance between paired bases），預(yù)測(cè)得到的二級(jí)結(jié)構(gòu)用RNAviz 2.0 （http://rnaviz.sourceforge.net/）進(jìn)行編輯。

2 結(jié)果

2.1 兩型5'UTR互換嵌合突變?nèi)L(zhǎng)克隆的構(gòu)建與感染性檢測(cè)基于北美型全長(zhǎng)感染性克隆pAPRRS，在其ORF1的起始密碼子和TRS之間通過(guò)PCR-based mutagenesis插入“at”形成Nde I以及“ttaa”形成Pac I構(gòu)建的突變體pTLNd4以及pPa2，并在pTLNd4的基礎(chǔ)上將5'UTR與歐洲型進(jìn)行替換構(gòu)建pTLV8突變體。同樣的，在歐洲型全長(zhǎng)感染性克隆pSHE的基礎(chǔ)上，通過(guò)SOE PCR構(gòu)建一個(gè)中間質(zhì)粒pBzgSHEnde，由此中間質(zhì)粒構(gòu)建全長(zhǎng)pSHEnde，最后將歐洲型5'UTR替換為北美型5'UTR，構(gòu)建成嵌合中間克隆pBzgSPnde，最后再通過(guò)與pSHE的Xba I和Kas I的各自雙酶切產(chǎn)物的連接構(gòu)建成全長(zhǎng)嵌合克隆pSHSP5。質(zhì)粒酶切圖譜見(jiàn)圖1。對(duì)得到的全部全長(zhǎng)突變體進(jìn)行測(cè)序和Sma I酶切鑒定確定均構(gòu)建成功，見(jiàn)圖1。將所有突變體克隆及親本全長(zhǎng)克隆直接DNA轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染24 h后收集上清傳代于新鮮的Marc-145細(xì)胞，每天觀察CPE情況。pTLNd4、pSHEnde、pTLV8及親本克隆都能夠產(chǎn)生CPE，值得注意的是，pTLV8是在Marc-145細(xì)胞上傳代2次之后才產(chǎn)生CPE的；pPa2 和pSHSP5均無(wú)法拯救出活病毒，無(wú)法產(chǎn)生CPE，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖1 突變嵌合克隆的構(gòu)建及Sma I 酶切鑒定圖譜Fig.1 Construction of chimeric mutants and identifi cation of full-length cDNA clone by Sma I digestion

1: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（DL2000）; 2: pSHE Xba I 和Kas I雙酶切產(chǎn)物; 3: pBzgSPnde Xba I 和Kas I雙酶切產(chǎn)物; 4: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（DL15000）; 5: DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)（DL15000）;

6: DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)（DL2000）; 7～12: pAPRRS、pTLNd4、pTLV8、pSHE、pSHEnde、pSHSP5 Sma I 酶切產(chǎn)物

1: DNA Marker(DL2000); 2: Product of pSHE digested by Xba I and Kas I; 3: Product of pBzgSPnde digested by Xba I and Kas I; 4: DNA Marker (DL15000); 5: DNA Marker (DL15000);

6: DNA Marker (DL2000); 7-12: Product of pAPRRS, pTLNd4, pTLV8, pSHE, pSHEnde, pSHSP5 digested by Sma I , respectively

2.2 突變對(duì)病毒結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)的影響將等量上述突變病毒與親本毒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，用間接免疫熒光的方法檢測(cè)核衣殼蛋白（Nucleocapsid protein, N）的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)除pSHSP5之外所有的全長(zhǎng)克隆轉(zhuǎn)染孔中均能產(chǎn)生抗N蛋白的特異性熒光。pPa2轉(zhuǎn)染孔視野中熒光量較少，如圖3。將各自的BHK-21轉(zhuǎn)染上清分別轉(zhuǎn)移至Marc-145細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)pPa2和pSHSP5傳代孔中無(wú)法檢測(cè)到抗N蛋白的特異性熒光，其余病毒傳代孔中都出現(xiàn)了大范圍的抗N蛋白的特異性熒光。

圖2 突變?nèi)L(zhǎng)cDNA克隆的感染性檢測(cè)Fig.2 The infectious identifi cation for the mutant viruses and the parental viruses

圖3 嵌合突變病毒及其親本病毒的間接免疫熒光（N蛋白特異性抗體）檢測(cè)Fig.3 IFA detection (N-protein McAb) of the mutant viruses and the parental virus on BHK-21 cells and Marc-145 cells

2.3 突變對(duì)病毒基因組復(fù)制與亞基因組轉(zhuǎn)錄的影響分析將所有全長(zhǎng)克隆轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，24 h后提取細(xì)胞總RNA，RT-PCR檢測(cè)亞基因組及負(fù)鏈基因組，引物見(jiàn)表1，pAS為復(fù)制酶 (1693-13116) 缺失的陰性對(duì)照質(zhì)粒。結(jié)果顯示，所有的突變克隆均能檢測(cè)到負(fù)鏈基因組的復(fù)制，其中嵌合克隆pTLV8和pSHSP5的負(fù)鏈合成水平很低；而所有的全長(zhǎng)突變克隆除pSHSP5之外均能檢測(cè)到sg mRNA 7的合成，但是pTLV8嵌合突變體sg mRNA 7的含量明顯少于其他突變體，如圖4所示。結(jié)果表明嵌合突變體較親本野毒會(huì)降低或阻斷亞基因組的有效合成；異源5' UTR的替換不會(huì)阻斷負(fù)鏈基因組合成，但會(huì)使負(fù)鏈合成水平下降。

圖4 突變對(duì)病毒的基因組復(fù)制與亞基因組轉(zhuǎn)錄的影響分析Fig.4 Analysis of genomic RNA replication and sg mRNA transcription for mutant viruses and WT

2.4 突變病毒與野毒在病毒生物學(xué)水平的比較對(duì)突變病毒和野毒進(jìn)行第一輪拯救病毒的滴定，結(jié)果如圖5所示，從中可見(jiàn)在BHK-21細(xì)胞上轉(zhuǎn)染的第一輪親本毒vAPRRS是1×103.67TCID50/mL ，而vTLV8在P1代不產(chǎn)生CPE，無(wú)法拯救出病毒，因此滴度為0。另外一組vSHE的病毒滴度為1×104TCID50/mL， vMSHEnde的病毒滴度與親本比較差異不顯著，為1×103.67TCID50/mL。同時(shí)對(duì)這些病毒（選取P5代毒）進(jìn)行空斑形態(tài)學(xué)比較（圖6），結(jié)果表明這些突變病毒在空斑形態(tài)、數(shù)目上均與親本病毒無(wú)顯著差異。結(jié)合多步生長(zhǎng)曲線結(jié)果（圖7）證明了突變嵌合病毒與親本病毒在病毒學(xué)水平差異不顯著。

圖5 突變病毒的第一輪拯救病毒濃度滴定Fig.5 The fi rst cycle viral titration the mutant viruses

圖6 突變病毒的空斑形態(tài)學(xué)比較Fig.6 Plaque morphology comparison for the mutant viruses1: vAPRRS; 2: vTLNd4; 3: vTLV8; 4: vSHE; 5: vSHEnde; 6: Mock1: vAPRRS; 2: vTLNd4; 3: vTLV8; 4: vSHE; 5: vSHEnde; 6: Mock

圖7 突變病毒與親本病毒的多步生長(zhǎng)曲線Fig.7 The multi-step growth curves of the mutant viruses and the parental viruses

2.5 嵌合突變體二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)對(duì)pSHSP5以及pTLV8的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)中發(fā)現(xiàn)（圖8），嵌合突變體pTLV8的5' 端雖然與親本pAPRRS的二級(jí)結(jié)構(gòu)差異很大，但保留了TRS所在的頂端莖環(huán)（C-SL5）結(jié)構(gòu)，且TRS與ORF1的AUG均位于C-SL5上。而pSHSP5的頂端C-SL5則遭到了破壞，TRS不再位于相應(yīng)環(huán)上。由此推測(cè)TRS和ORF1的起始密碼子“AUG”所在的頂端莖環(huán)結(jié)構(gòu)是調(diào)控病毒復(fù)制轉(zhuǎn)錄過(guò)程的關(guān)鍵順式作用元件之一，對(duì)其破壞的突變都是致死性突變。

圖8 嵌合全長(zhǎng)克隆的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.8 The secondary structure prediction for the 5' proximal sequences of chimeric full length cDNA clones

3 討論

PRRSV有兩個(gè)血清型，歐洲型（1型）和北美型（2型），二者序列同源性只有約60%，而其基因組成是一致的[12]。目前PRRSV仍處于通過(guò)隨機(jī)點(diǎn)突變及基因型之間的RNA重組快速進(jìn)化過(guò)程中。

目前已證實(shí)許多單股正鏈RNA病毒的5' UTR包含了病毒基因組復(fù)制及亞基因組mRNA轉(zhuǎn)錄所需要的順式作用元件[2-4,6]。在馬動(dòng)脈炎病毒（Equinearteritisvirus，EAV）亞基因組mRNA轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，位于5' UTR 中的頂端莖環(huán)結(jié)構(gòu)上的Leader-TRS（轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列）以及位于下游基因組中Body-TRS的互補(bǔ)配對(duì)介導(dǎo)了此轉(zhuǎn)錄過(guò)程[7]。這個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)同時(shí)發(fā)現(xiàn)于其他動(dòng)脈炎病毒基因組的5' 端，也存在于許多冠狀病毒中[8]。在本研究中，利用Mfold RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)軟件，基于能量最低原則，對(duì)兩種血清型PRRSV 5'端序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，雖然其一級(jí)序列同源性只有60%，但是莖環(huán)結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)相當(dāng)程度的相似性，尤其是頂端莖環(huán)結(jié)構(gòu)。與動(dòng)脈炎病毒的原型病毒EAV的相應(yīng)結(jié)構(gòu)比較發(fā)現(xiàn)，EAV的5' 端莖環(huán)結(jié)構(gòu)較多，單鏈區(qū)較PRRSV的更多，但是頂端的莖環(huán)結(jié)構(gòu)在PRRSV中則更突出。在病毒RNA合成的模板交換（template switching）過(guò)程中，頂端莖環(huán)結(jié)構(gòu)被認(rèn)為能夠?yàn)長(zhǎng)eader TRS作為一個(gè)接頭提供便利，EAV此結(jié)構(gòu)較PRRSV大。雖然二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)并不能保證有100%的正確性，但是有研究已經(jīng)證明用酶法和化學(xué)法檢測(cè)的真實(shí)的RNA結(jié)構(gòu)與mfold軟件預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)有極高的一致性。

在本研究中，對(duì)嵌合PRRSV 5' 端260 bp的序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)pTLV8和pSHSP5之間以及其與各自母本相比差異都很大，但是pTLV8的Leader TRS仍然位于頂端的莖環(huán)結(jié)構(gòu)上，pSHSP5的頂端莖環(huán)結(jié)構(gòu)則完全遭到了破壞。對(duì)突變嵌合病毒的感染性試驗(yàn)等發(fā)現(xiàn)pTLV8在傳代2次之后能夠產(chǎn)生CPE，而pSHSP5則是一個(gè)致死性突變體。而為了便于構(gòu)建兩型5'UTR嵌合的全長(zhǎng)突變體，在TRS與ORF1的起始密碼子“AUG”之間插入“at”形成Nde I酶切位點(diǎn)的兩個(gè)突變體pSHEnde和pTLNd4，二者頂端莖環(huán)結(jié)構(gòu)沒(méi)有改變，轉(zhuǎn)染后具有感染性。綜上所述，PRRSV 5' 末端頂端的莖環(huán)結(jié)構(gòu)在病毒生命活動(dòng)中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。本研究證明Leader TRS所在的莖環(huán)結(jié)構(gòu)以及TRS和ORF1起始密碼子AUG的相對(duì)位置是調(diào)控病毒復(fù)制轉(zhuǎn)錄過(guò)程的關(guān)鍵順式作用元件之一，任何對(duì)其結(jié)構(gòu)破壞的突變都會(huì)成為致死性突變。

本研究首次報(bào)道了PPRSV 1型5'UTR在2型的基因組骨架上能完全發(fā)揮調(diào)控作用，在功能上可以替換，并對(duì)Leader TRS所在的莖環(huán)結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步解析，為進(jìn)一步剖析PRRSV 5' UTR的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，及病毒致病機(jī)理等提供了科學(xué)依據(jù)。

[1] Gallie D R. A tale of two termini: a functional interaction between the termini of an mRNA is a prerequisite for efficient translation initiation[J]. Gene, 1998, 216(1): 1-11.

[2] Barton D J, O'Donnell B J, Flanegan J B. 5' cloverleaf in poliovirus RNA is a cis-acting replication element required for negative-strand synthesis[J]. Embo J, 2001, 20(6): 1439-1448.

[3] Filomatori C V, Lodeiro M F, Alvarez D E, et al. A 5' RNA element promotes dengue virus RNA synthesis on a circular genome[J]. Genes Dev, 2006, 20(16): 2238-2249.

[4] Lodeiro M F, Filomatori C V, Gamarnik A V. Structural and functional studies of the promoter element for dengue virus RNA replication[J]. J Virol, 2009,83(2): 993-1008.

[5] Andino R, Rieckhof G E, Baltimore D. A functional ribonucleoprotein complex forms around the 5' end of poliovirus RNA[J]. Cell, 1990, 63(2): 369-380.

[6] Herold J, Andino R. Poliovirus requires a precise 5' end for efficient positive-strand RNA synthesis[J]. J Virol, 2000, 74(14): 6394-6400.

[7] Van Den Born E, Gultyaev A P, Snijder E J. Secondary structure and function of the 5'-proximal region of the equine arteritis virus RNA genome[J]. RNA, 2004, 10(3): 424-437.

[8] Van Den Born E, Posthuma C C, Gultyaev A P, et al. Discontinuous subgenomic RNA synthesis in arteriviruses is guided by an RNA hairpin structure located in the genomic leader region[J]. J Virol, 2005, 79(10): 6312-6324.

[9] Dumas E, Staedel C, Colombat M, et al. A promoter activity is present in the DNA sequence corresponding to the hepatitis C virus 5' UTR[J]. Nucleic Acids Res, 2003, 31(4): 1275-1281.

[10] Rijnbrand R, Abell G, Lemon S M. Mutational analysis of the GB virus B internal ribosome entry site[J]. J Virol, 2000, 74(2): 773-783.

[11] Rijnbrand R, van der Straaten T, van Rijn P A, et al. Internal entry of ribosomes is directed by the 5' noncoding region of classical swine fever virus and is dependent on the presence of an RNA pseudoknot upstream of the initiation codon[J]. J Virol, 1997, 71(1): 451-457.

[12] Nelsen C J, Murtaugh M P, Faaberg K S. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus comparison: divergent evolution on two continents[J]. J Virol, 1999, 73(1): 270-280.

[13] Wang Y, Liang Y, Han J, et al. Attenuation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus strain MN184 using chimeric construction with vaccine sequence[J]. Virology, 2008, 371(2): 418-429.

[14] Cho J G, Dee S A. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J]. Theriogenology, 2006, 66(3): 655-662.

[15] Zhou Y, Zheng H, Gao F, et al. Mutational analysis of the SDD sequence motif of a PRRSV RNA-dependent RNA polymerase[J]. Sci China Life Sci, 2011, 54(9): 870-879.

[16] Yuan S, Wei Z. Construction of infectious cDNA clones of PRRSV: separation of coding regions for nonstructural and structural proteins[J]. Sci China C Life Sci, 2008, 51(3): 271-279.

[17] 莊金山, 袁世山, 張建武. 歐洲型PRRSV解毒株全長(zhǎng)基因cDNA克隆的構(gòu)建與分析[J]. 中國(guó)獸醫(yī)科學(xué), 2008, (8): 658-664.

[18] Zheng H, Sun Z, Zhu X Q, et al. Recombinant PRRSV expressing porcine circovirus sequence reveals novel aspect of transcriptional control of porcine arterivirus[J].Virus Res, 2010, 148(1-2): 8-16.

[19] Pizzi M. Sampling variation of the fifty percent endpoint, determined by the Reed-Muench (Behrens) method[J]. Hum Biol, 1950, 22(3): 151-190.

[20] Warter L, Cohen L, Benureau Y, et al. A cooperative interaction between nontranslated RNA sequences and NS5A protein promotes in vivo fitness of a chimeric hepatitis C/GB virus B[J]. PLoS One, 2009, 4(2): e4419.

[21] Kang H, Feng M, Schroeder M E, et al. Putative cisacting stem-loops in the 5' untranslated region of the severe acute respiratory syndrome coronavirus can substitute for their mouse hepatitis virus counterparts[J]. J Virol, 2006, 80(21): 10600-10614.

A PROMINENT STEM-LOOP STRUCTURE IN 5' UNTRANSLATED REGION OF PORCINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME VIRUS IS ESSENTIAL FOR VIRAL REPLICATION AND TRANSCRIPTION

GAO Fei1, ZHENG Hao1, JIANG Yi-feng1, LI Li-wei1, ZHENG Hai-hong1, ZHOU Yan-jun1, WEI Zu-zhang2, TONG Guang-zhi1
(1. Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2. College of Animal Science and Technology, Guangxi University, Nanning 530005, China )

The 5' untranslated region (UTR) of the genomic RNA is believed to be vital for the replication and transcription of Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), yet its functional mechanism remains unclear. Based on infectious full-length cDNA clones pAPRRS and pSHE of type 1 and type 2 PRRSV, exogenous “at” was inserted between 5' UTR and ORF1 to form Nde I digestion site, then pTLNd4 and pSHEnde were obtained. After transfection and passage on cell monolayers, the infectiousness of pTLNd4 and pSHEnde was demonstrated. Afterwards, the 5' UTR chimeric mutants pTLV8 and pSHSP5 were obtained. Interestingly,pTLV8 developed cytopathic effect (CPE) on MARC-145 cells while pSHSP5 was a lethal mutant. Comparison of the secondary structures of 5' proximal sequences revealed that a signifi cant change occurred in pSHSP5 but not in pTLV8. The prominent stem-loop structure remained functional in pTLV8 as TRS and AUG of ORF1 were located in the top loop. Taken together, the prominent stem-loop structure where TRS is located is one of the crucial cis-acting elements in regulating viral replication and transcription. Therefore, any changes that alter the stem-loop structure would be lethal for mutant viruses.

Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV); 5' untranslated region (5'UTR); chimeric virus; transcriptionregulating sequence (TRS); secondary structure

S852.659.6

A

1674-6422（2014）04-0007-10

2014-03-24

國(guó)家自然科學(xué)基金（31300140）；863計(jì)劃（2011AA10A208-2）；科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)（2013JB01，2013JB02）

高飛，女，博士，助理研究員，主要從事分子病毒學(xué)研究

童光志，E-mail: gztong@shvri.ac.cn