程龍飛，許利娜，林建生，陳紅梅，仇微紅，施少華，葉和佳，胡秀美，梁昭平，黃 瑜

（1. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福州 350013；2.廣州市華南生物藥品有限公司，廣州 511300）

·研究論文·

福建及鄰近省份禽源多殺性巴氏桿菌的分離鑒定

程龍飛1，許利娜2，林建生1，陳紅梅1，仇微紅2，施少華1，葉和佳2，胡秀美2，梁昭平2，黃 瑜1

（1. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福州 350013；2.廣州市華南生物藥品有限公司，廣州 511300）

本研究收集2007～2013年福建省及鄰近省份的疑似禽霍亂病死亡雞、鴨、鵝，進(jìn)行細(xì)菌分離，PCR進(jìn)行種和莢膜群的鑒定，瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)鑒定其Heddleston氏耐熱菌體抗原型。結(jié)果共分離鑒定多殺性巴氏桿菌95株，其中鴨源74株，雞源17株，鵝源4株。其莢膜群全為A型，1型耐熱菌體抗原型占67.4%。與20世紀(jì)80年代以來(lái)我國(guó)已有的報(bào)道相同，禽源（不含火雞）多殺性巴氏桿菌血清型仍然以A:1為主。

禽；多殺性巴氏桿菌；血清型

禽霍亂，又名禽出敗、禽巴氏桿菌病，是由多殺性巴氏桿菌引起的一種慢性或急性接觸性、敗血性傳染病，多發(fā)生于性成熟的禽類[1]。該病急性發(fā)作時(shí)，病程短促、死亡率高、以高熱下痢和呼吸困難為特征，雖然許多抗菌藥物能迅速控制本病，但停藥后極易復(fù)發(fā)，造成的損失極大。慢性型則發(fā)生肉髯水腫和關(guān)節(jié)炎。早在1880年，Pasteur即分離到這種微生物并在肉湯中獲得純培養(yǎng)。本病是危害養(yǎng)禽業(yè)最為重要的細(xì)菌性傳染病之一，至今仍是許多國(guó)家和地區(qū)列為重點(diǎn)預(yù)防的一種疾病。

多殺性巴氏桿菌的血清型由莢膜群和菌體抗原型組成，我國(guó)關(guān)于侵害家禽（結(jié)合我國(guó)的國(guó)情，這里的禽指的是雞、鴨和鵝，不包括火雞）的多殺性巴氏桿菌血清型的報(bào)道，在2000年以前比較多見(jiàn)。之后的相關(guān)報(bào)道較少。為探明近幾年來(lái)流行于我國(guó)部分地區(qū)的禽源多殺性巴氏桿菌的血清型，為禽霍亂疫苗的選擇提供理論依據(jù)，本研究對(duì)2007～2013年福建及鄰近省份的疑似禽霍亂病死亡雞、鴨進(jìn)行細(xì)菌分離、鑒定，現(xiàn)報(bào)道如下。

表1 各引物的序列Table 1 Sequences of the primers in this study

1 材料和方法

1.1 病料來(lái)源2007～2013年福建、浙江、江西、安徽、廣東、廣西、河北等省疑似禽霍亂死亡雞、鴨、鵝。剖檢見(jiàn)心冠脂肪出血；肝臟腫大，表面散在大量灰白色針尖大小的壞死點(diǎn)；腸道增粗，腸粘膜脫落，腸道內(nèi)容物呈膠凍樣。

1.2 培養(yǎng)基的配制改良TSA，稱取胰蛋白胨大豆瓊脂粉（Tryptic Soy Agar，Dfico公司）4 g，加入100 mL蒸餾水中，煮沸溶解，15磅高壓15 min，待其自然冷卻至60℃左右時(shí)加入2 mL的新生牛血清，混勻后分裝制成平板，4℃保存。

1.3 細(xì)菌的分離及初步鑒定無(wú)菌采集肝臟，接種于改良TSA，37℃培養(yǎng)20 h，挑取圓形突起、表面光滑濕潤(rùn)、露珠樣的單個(gè)菌落，再次接種改良TSA進(jìn)行純化。取純培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢，同時(shí)做生化鑒定。生化鑒定管購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.4 分離菌的種鑒定和莢膜群群鑒定

1.4.1 模板的制備 挑取適量純培養(yǎng)物，按DNA提取試劑盒（Genomic DNA Kit，北京全式金生物技術(shù)有限公司）說(shuō)明書(shū)提取基因組DNA，吸取2 μL以Thermo公司的NanoDrop超微量分光光度計(jì)測(cè)量核酸濃度，取50 ng做為模板。

1.4.2 引物 引物序列[2]見(jiàn)表1，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4.3 PCR反應(yīng) PCR反應(yīng)體系為50 μL：25 μL 2×Dream TaqTMGreen PCR Master Mix、3對(duì)引物各1 μL、1 μL模板、18 μL ddH2O。反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s ，56℃退火40 s，72℃延伸60 s, 30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察。同時(shí)以雙蒸水為空白對(duì)照，以多殺性巴氏

桿菌CVCC44801株、CVCC392株（購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所）提取的基因組DNA分別為莢膜群A型和D型的陽(yáng)性對(duì)照。

1.5 分離菌的Heddleston氏耐熱菌體抗原型鑒定采用瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行[3]。用含0.3%福爾馬林的8.5% NaCl溶液3 mL將改良TSA上的新鮮菌落洗下，制成含菌混懸液，沸水中煮沸1 h，自然冷卻后8000×g離心15 min，取上清液即為耐熱菌體抗原。按1%比例將優(yōu)質(zhì)瓊脂加到8.5% NaCl溶液中，加熱熔化后取15 mL加入直徑90 mm的平皿中，凝固后打成7孔梅形圖案，孔徑及孔距均為4 mm，中央孔加熱穩(wěn)定抗原標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清（購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所），周邊1和4孔分別加陰、陽(yáng)性熱穩(wěn)定抗原，其余每孔加1株待鑒定菌制備的熱穩(wěn)定抗原，置37℃濕盒1～3 d，每天觀察1次，見(jiàn)白色沉淀線者為陽(yáng)性。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離和鑒定純化后的細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢呈陰性的進(jìn)行生化試驗(yàn)，能分解葡萄糖，甲基紅試驗(yàn)和VP試驗(yàn)均為陰性，產(chǎn)生硫化氫的菌株視為初步鑒定陽(yáng)性菌株，共有95株（74株來(lái)源于鴨、17株來(lái)源于雞、4株來(lái)源于鵝）。

2.2 細(xì)菌的種鑒定和莢膜群群鑒定95株初步鑒定陽(yáng)性的菌株，提取基因組DNA，定量后取50 ng進(jìn)行PCR，均能擴(kuò)增出與CVCC44801株相同的兩個(gè)特異性條帶，其中一個(gè)約460 bp，另一個(gè)約1044 bp，說(shuō)明這些細(xì)菌均為莢膜群A型的多殺性巴氏桿菌（圖1）。

2.3 耐熱菌體抗原型鑒定瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，1型64株，占67.4%，為最常見(jiàn)的血清型。1（14）型14株，占14.7%；1（4、14）型9株，占9.5%。除此外，還有1（2、14）、5、12、14型等。

圖1 多殺性巴氏桿菌分離株的多重PCR鑒定Fig.1 Multiple PCR identifi cation of P. multocida isolatesM: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（DL2000）; 1: 空白對(duì)照;2: CVCC44801; 3: CVCC392; 4～8: 分離菌株M: DNA Marker(DL2000); 1: Bland control; 2: CVCC44801;3: CVCC392; 4-8: P. multocida isolates

3 討論

關(guān)于多殺性巴氏桿菌的血清學(xué)分型方法，Carter等（1955）用間接血凝試驗(yàn)將莢膜群抗原分為A、B、C、D四個(gè)血清型，后取消了C型，增加了E、F型[4,5]。Namioka等[6]以鹽酸處理菌體制備菌體抗原，用試管凝集試驗(yàn)將其分為12個(gè)血清型，但由于交叉反應(yīng)比較廣泛，可操作性不強(qiáng)。Heddleston等[3]以煮沸法制備菌體耐熱抗原，用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)將其分為16個(gè)血清型，該方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確。Namioka分型方法中的5、8、9型相當(dāng)于Heddleston分型方法中的1、3、16型。至今，將Carter莢膜群抗原分型（大寫英文字母）和Heddleston耐熱菌體抗原分型（阿拉伯?dāng)?shù)字，加括號(hào)表示較弱的反應(yīng)）相結(jié)合的方法已被大多數(shù)人接受[7,8]。

我國(guó)1979年開(kāi)始對(duì)多殺性巴氏桿菌進(jìn)行血清學(xué)分型研究。何昭陽(yáng)[9]鑒定了52株分離株（雞源46株、鴨源5株、鵝源1株）的血清型，39株的莢膜群群為A型，13株未能定型；45株的菌體型為5型，7株為8型（Namioka分型方法），按現(xiàn)在的表述方式即A:1為主。劉國(guó)卿等[10]收集了1978年至1982年間158株禽源多殺性巴氏桿菌（雞源153株，鴨源3株，鵝源2株），144株的莢膜群群為A型，14株未能定型。133株莢膜群A型菌中，132株的菌體型為5型（Namioka分型方法），按現(xiàn)在的表述方式也是A:1為主。之后，鄭明（1984）[11]、胡東良（1986）[12]、林錦鴻等（1987）[13]、陳篤生等（1987）[14]、吳范庚（1987）[15]、吳彤等（1987）[16]、胡東良（1989）[17]、吳范庚（1993）[7]、劉亞剛等（1996）[18]、吳范庚（1997）[19]、程安春等（1997）[20]、王英珍等（1999）[8]、高明燕等（2011）[21]均報(bào)道了我國(guó)禽源（結(jié)合我國(guó)的國(guó)情，這里的禽指的是雞、鴨和鵝，不包括火雞）多殺性巴氏桿菌的血清型，均以A:1為主。其中，劉亞剛等[18]報(bào)道了1株鴨源莢膜群B型菌株，認(rèn)為可能是混養(yǎng)在一起的豬傳染給鴨的；吳范庚[19]報(bào)道了1株雞源莢膜群D型菌株。

Townsend 等[2]根據(jù)莢膜群特異性基因hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecbJ和fcbD設(shè)計(jì)引物，建立了快速鑒別多殺性巴氏桿菌莢膜群型的特異方法。間接血凝法對(duì)莢膜群進(jìn)行分型時(shí)，對(duì)莢膜的量要求較高，如果細(xì)菌體外培養(yǎng)時(shí)丟失了較多莢膜，則無(wú)法鑒定。而針對(duì)基因的PCR方法則不存在這方面的缺點(diǎn)。趙耘等[22]利用該多重PCR法對(duì)42株分離自不同動(dòng)物的不同莢膜群的多殺性巴氏桿菌進(jìn)行鑒定，其結(jié)果與間接血凝法的結(jié)果相同，進(jìn)一步證實(shí)了該方法的準(zhǔn)確性。孫翠平等[23]、于成接等[24]均是以PCR方法鑒定出A型莢膜群的多殺性巴氏桿菌分離株。本試驗(yàn)綜合關(guān)于禽源多殺性巴氏桿菌血清型鑒定文獻(xiàn)報(bào)道，僅以種鑒定引物、莢膜群A、D型引物，建立三重PCR方法，進(jìn)行禽源多殺性巴氏桿菌的種和莢膜群鑒定，結(jié)果證實(shí)是可行的。

檢測(cè)結(jié)果表明，74株鴨源、17株雞源和4株鵝源多殺性巴氏桿菌分離株的血清型以A:1為主，結(jié)合國(guó)內(nèi)眾多學(xué)者的研究結(jié)果，我們認(rèn)為，20世紀(jì)80年代至今三十多年來(lái)，流行于我國(guó)的禽源（不含火雞）多殺性巴氏桿菌的莢膜群和耐熱菌體抗原型均沒(méi)有發(fā)生大的變化，仍以A:1為主。

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CHARACTERIZATION OF AVIAN PASTEURELLA MULTOCIDA ISOLATES FROM FUJIAN AND ITS NEIGHBOR PROVINCES

CHENG Long-fei1, XU Li-na2, LIN Jian-sheng1, CHEN Hong-mei1, QIU Wei-hong2, SHI Shao-hua1, YE He-jia2, HU Xiu-mei2, LIANG Zhao-ping2, HUANG Yu1
(1. Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350013, China; 2. Guangzhou South China Biological Medicine Co. Ltd., Guangzhou 511300, China)

Dead chickens, ducks and geese suspected of fowl cholera were collected in 2007～2013 from Fujian and its neighbor provinces and subject to isolation of Pasteurella multocida. A total of 95 Pasteurella multocida isolates were obtained, among which 74 isolates were isolated from ducks, 17 from chickens and 4 from geese. These bacterial strains were then determined for species and capsular types in PCR and for heat-stable somatic antigens in agar diffusion test. All isolates belonged to capsular type A and 64 isolates to heat-stable somatic antigens 1. These results have indicated that the main serotype of Pasteurella multocida isolates from avian (excluding turkey) in China has been remained A:1 since 1980’s.

Avian; Pasteurella multocida; serotype

S852.612

A

：1674-6422（2014）04-0040-05

2014-01-24

國(guó)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金（CARS-43）；福建省農(nóng)業(yè)五新工程項(xiàng)目（閩發(fā)改投資（2012）931號(hào)）

程龍飛，男，碩士，研究員，主要從事家禽傳染病研究

黃瑜，E-mail:huangyu_815@163.com