徐衛(wèi)東，錢元霞，高靜，趙映前

（1．江蘇大學藥學院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2．湖北中醫(yī)藥大學中醫(yī)臨床學院，湖北武漢430065）

四逆散含藥血清誘導大鼠肝臟干細胞分化及其調控機制

徐衛(wèi)東1，錢元霞1，高靜1，趙映前2

（1．江蘇大學藥學院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2．湖北中醫(yī)藥大學中醫(yī)臨床學院，湖北武漢430065）

目的：研究四逆散含藥血清對大鼠肝臟干細胞分化的影響并探討其治療肝病的作用機制。方法：采用HPLC-MS-MS法，梯度洗脫，測定血清中四逆散的有效成分；以四逆散含藥血清處理WB-F344細胞后，采用CCK-8法觀察細胞增殖情況，血糖儀檢測細胞培養(yǎng)液葡萄糖含量，乳酸測定試劑盒檢測細胞中乳酸含量，熒光素 熒光素酶法檢測ATP含量，蛋白質印跡法觀察表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、纖維母細胞生長因子受體（fibroblast growth factor receptor，F(xiàn)GFR）、轉化生長因子受體（transforming growth factor beta receptor typeⅠ，TGF-βRⅠ）、肝細胞生長因子受體（hepatocyte growth factor receptor，HGFR）蛋白表達情況。結果：在四逆散血清中，檢測到以原型入血芍藥苷、橙皮苷等成分，并檢測到橙皮素葡萄糖醛酸等部分代謝物。各濃度含藥血清作用WB-F344細胞48 h后，對細胞均無毒性作用，10%含藥血清顯示出較好的促進細胞增殖的效果。隨著藥物血清作用時間的延長，WBF344細胞葡萄糖消耗量、乳酸生成量降低，ATP生成增加，EGFR、FGFR、TGF-βRⅠ、HGFR蛋白表達水平上升。結論：四逆散含藥血清能夠促進肝臟干細胞WB-F344的增殖并誘導其分化，分化機制可能與影響數(shù)種細胞因子受體的表達有關。

四逆散；肝干細胞；糖代謝；分化；細胞因子受體

四逆散始載于《傷寒論》，為東漢張仲景所創(chuàng)疏肝解郁的祖方，主治肝胃氣滯，氣機不利，陽郁于里，不能透達四末所致的四逆證。近代臨床研究表明，四逆散對肝纖維化、乙醇性肝病、脂肪肝、肝炎等都有很好的療效［1－4］。四逆散治療肝病的機制與肝細胞保護、調節(jié)脂質代謝、對抗脂質過氧化、免疫調節(jié)等作用有關［5－8］，但有關其對干細胞的影響鮮有報道。

肝臟干細胞與肝細胞的生長、發(fā)育、增殖甚至纖維化程度等有著密切的關系［9－11］。卵圓細胞是肝干細胞的主要來源，被認為是原始的兼性多能干細胞，位于終末膽管，并可見于Hering管。在肝細胞再生能力不足等特定病理生理條件下，卵圓細胞可移行出門脈匯管區(qū)分化成肝細胞［12］，其數(shù)量與肝損傷的嚴重程度有關［13］。因此，卵圓細胞作為肝干細胞研究對象在肝臟疾病中的作用具有較好的實際價值。

本研究應用四逆散含藥血清處理大鼠肝卵圓細胞系WB-F344，檢測細胞糖代謝水平及細胞表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、纖維母細胞生長因子受體（fibroblast growth factor receptor，F(xiàn)GFR）、轉化生長因子受體（transforming growth factor beta receptor type I，TGF-βRⅠ）、肝細胞生長因子受體（hepatocyte growth factor receptor，HGFR）蛋白表達的變化，觀察四逆散是否能夠誘導細胞分化并探討其機制。

1 材料與方法

1．1 材料

SPF級SD大鼠，雄性，體質量180～200 g，由江蘇大學實驗動物中心提供［許可證號：SCXK（蘇）2009－0002］；大鼠肝干細胞WB-F344由中國醫(yī)學科學院藥物研究所李燕教授、陳暉老師惠贈，大鼠BRL肝細胞購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫；柴胡（批號：091211），白芍（批號：091109），枳實（炙）（批號：090701）購自安徽豐原銅陵中藥飲片有限公司，甘草（炙）購自安徽海鑫中藥飲片有限公司（批號：20110801）；對照品芍藥苷（批號：110736-201136）、柚皮苷（批號：110722-2011 11）、橙皮苷（批號：110721-201115）、甘草次酸（批號：110723-200612）、柴胡皂苷d（批號：110778-201208）均購自中國藥品生物制品檢定所；乙腈（色譜純）：國藥集團化學試劑有限公司。

DMEM高糖培養(yǎng)基，優(yōu)質胎牛血清（美國Gibco公司）；兔抗鼠EGFR、TGF-βRⅠ多克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；兔抗鼠HGFR、FGFR多克隆抗體（美國Bioworld公司）；細胞活性計數(shù)試劑盒CCK-8（日本Dojindo公司）；ATP檢測試劑盒（碧云天生物工程公司）；乳酸測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

LC-20A高效液相色譜儀（日本島津Prominence）；液相色譜 離子阱質譜聯(lián)用儀配備電噴霧離子源（美國Thermo Fisher Scientific公司）；525BR電泳儀（美國Bio-Rad公司）；TS100 Nikon倒置相差顯微鏡（日本尼康公司）；MD Spectra Max 190酶標儀（美國MD公司）。

1．2 方法

1．2．1 四逆散藥劑的制備 按四逆散處方等比例取炙甘草（6 g）、枳實（6 g）、柴胡（6 g）、白芍（6 g）藥材，加水10倍浸泡3 h，煎煮2次（第1次8倍量，第2次6倍量），每次1 h，分離藥渣。將所有藥液混勻濃縮至0．4 g／mL，合并濾液，置于4℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．2 含藥血清制備 將上述制備的四逆散藥劑連續(xù)給大鼠灌胃7 d（1次／d），對照組給予蒸餾水灌胃。給藥劑量為臨床成人劑量（即四逆散整方劑量）的10倍量（即整體模型動物的有效劑量），在采血前禁食不禁水12 h以上，末次給藥后2 h麻醉，心臟取血，靜置30min，離心（2 000 r／min）10min后分離血清，再用0．22μm微孔濾膜除菌，儲存于－70℃?zhèn)溆谩?/p>

1．2．3 四逆散含藥血清成分的測定

1．2．3．1 樣品的處理 隨機從兩只大鼠取血清約4 mL，加入20 mL甲醇后快速混勻振蕩，密閉超聲提取15min，3 000 r／min離心10min，取得上清液后于40℃恒溫條件下減壓回收，干燥后殘渣以1 mL甲醇溶解，0．45μm濾膜過濾，進樣分析。

1．2．3．2 色譜條件 Betasil C18色譜柱（4．6 mm× 250 mm，5μm）；流動相A：水，B：乙腈；流速：0．4 mL／min；柱溫：35℃；樣品室溫：4℃；檢測波長為210，240，280 nm，進樣量20μL；梯度洗脫條件見表1。

1．2．3．3 質譜條件 電噴霧離子源（ESI）；噴霧電壓：3．5 kV；負離子檢測；鞘氣（N2）流速：80 arb；輔助氣（N2）流速：5 arb；毛細管溫度：300℃；毛細管電壓：－30 V。采用全離子掃描方式，掃描范圍m／z：100－1 200，碰撞氣體為氦氣；碰撞室能量：35 V。

1．2．4 細胞培養(yǎng) 將細胞培養(yǎng)于含10%滅活新生牛血清和青霉素、鏈霉素（各100萬U／L）的DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃，5%CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞貼壁生長每2～3天傳代1次，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1．2．5 CCK-8法檢測細胞活力 取對數(shù)生長期WB-F344細胞，消化、計數(shù)，以4×104／mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100μL。培養(yǎng)24 h后，分為正常組和含藥血清處理組，分別以5%、10%、20%正常大鼠血清和5%、10%、20%含藥血清處理細胞。每個濃度設5個復孔，同時設5個空白調零孔，內加培養(yǎng)液。藥物作用48 h后，去上清，每孔加入10μLCCK-8試劑，振蕩混勻，繼續(xù)培養(yǎng)2．5 h，用酶標儀在450 nm處測定光密度值（D）。

1．2．6 葡萄糖消耗量的測定 用6孔板接種WBF344細胞，以10%含藥血清作用于WB-F344細胞0、7、14、21 d后，換取新鮮培養(yǎng)基，每孔2 mL，24 h后收集培養(yǎng)基，用血糖儀檢測血糖濃度，從而計算細胞消耗的血糖量。取對數(shù)期BRL細胞，按上述方法同步進行。

1．2．7 兩類肝臟細胞乳酸含量的檢測 以10%含藥血清作用于WB-F344細胞，分別在第0、7、14、21天，用PBS洗2次，將培養(yǎng)板置于冰上，每孔加入300μL細胞裂解液，充分裂解細胞，裂解后置于Eppendorf管中，4℃12 000×g離心10 min，取上清。按試劑盒說明書操作，最后計算乳酸含量。乳酸含量（mmol／g）＝（測定管D值－空白管D值）／（標準管D值－空白管D值）×標準管濃度÷待測組織樣本蛋白含量。取對數(shù)期BRL細胞，按上述方法同步進行。

1．2．8熒光素 熒光素酶法測定細胞內ATP含量

接種WB-F344細胞于6孔板，加入10%含藥血清，分別于第0、7、14、21天用PBS洗2次，將培養(yǎng)板置于冰上，每孔加入300μL細胞裂解液，充分裂解細胞，裂解后置于Eppendorf管中，4℃12 000×g離心10 min，取上清。取96孔化學發(fā)光專用培養(yǎng)板，每孔加入100μL ATP檢測試劑，反應2 min，扣除本底后每孔加入相同體積的樣本，用化學發(fā)光酶標儀檢測熒光強度，計算樣本中ATP的濃度。測定樣本蛋白含量，計算每毫克蛋白ATP的量。取對數(shù)期BRL細胞，按上述方法同步進行。

1．2．9 蛋白質印跡法檢測肝干細胞受體蛋白的水平 提取經10%含藥血清作用0、7、14、21 d的WBF344細胞總蛋白，進行蛋白定量后，樣品按比例加入3×SDS凝膠上樣緩沖液溶解，煮沸5 min。以20 μg蛋白進行上樣，電泳。80 V恒壓4 h將蛋白轉至PVDF膜。封閉液封閉1 h，一抗孵育4℃過夜，TBST清洗3次，二抗孵育，室溫1 h，TBST清洗3次，ECL發(fā)光液發(fā)光，暗室內X光片感光、顯影、定影、觀察。檢測肝干細胞受體EGFR、FGFR、TGF-βRⅠ、HGFR水平。

1．2．10 統(tǒng)計學方法 采用SAS 9．0統(tǒng)計軟件，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用q檢驗，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義，各實驗至少重復3次。

2 結果

2．1 含藥血清中四逆散的有效成分

應用HPLC-MS-MS法對血清有效成分進行定性分析，得到（－）ESI-MS的質譜總離子流圖，見圖1。通過與對照品比對及對碎片離子的分析，經本方法檢測出7個化合物原型成分，包括芍藥苷、橙皮苷等，同時還檢測出部分藥物的代謝產物，包括甘草次酸、柚皮素葡萄糖醛酸、橙皮素葡萄糖醛酸等，見表2。

2．2 藥物血清對細胞活性的影響

CCK-8檢測結果顯示，以5%、10%、20%濃度含藥血清處理WB-F344細胞48 h后，與對照組比較，四逆散血清均未顯示細胞毒性作用。其中，10%含藥血清濃度組的細胞活性明顯高于對照組細胞活性，差異有統(tǒng)計學意義（q＝6．199，P＜0．05）。見圖2。

2．3 藥物血清影響細胞葡萄糖的消耗量

如圖3所示，隨著藥物血清作用時間的延長，WB-F344細胞葡萄糖消耗量有降低的趨勢，第14、21天與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05），至第21天時與BRL組相當，而正常血清處理的WB-F344細胞葡萄糖消耗水平無明顯改變。

2．4 四逆散對細胞內乳酸含量的影響

應用乳酸測定試劑盒檢測細胞中乳酸的含量，結果顯示隨著藥物血清作用時間的延長，WB-F344細胞中乳酸含量有降低的趨勢，與對照組比較，第7天時即有明顯差異（P＜0．05），至第14天時細胞中乳酸含量與正常肝細胞乳酸含量相當，而正常血清處理的WB-F344細胞乳酸含量無明顯改變。見圖4。

2．5 藥物血清對細胞ATP水平的影響

藥物血清作用于WB-F344細胞后，至第21天時細胞ATP水平比對照組明顯升高（q＝16．34，P＜0．05），但與正常肝細胞相比還有差距，對照組的WB-F344細胞ATP水平無明顯改變。見圖5。

2．6 四逆散對細胞因子受體表達的影響

蛋白質印跡法檢測細胞因子受體的表達，結果顯示，隨著四逆散作用時間的延長，WB-F344細胞EGFR、FGFR、TGF-βR I、HGFR等都有一定的升高，正常血清處理的WB-F344細胞的各細胞因子受體表達無明顯改變。見圖6。

3 討論

近年來有文獻報道，含中藥血清可以誘導干細胞的分化［14－15］，這不僅對細胞移植具有重大意義，而且也闡明了藥物治療疾病新的作用機制。本研究結果顯示，給予大鼠四逆散灌胃后，血清中出現(xiàn)的有效成分及代謝物包括芍藥苷、橙皮苷、甘草次酸、柚皮素葡萄糖醛酸等。然后我們采用不同濃度的四逆散含藥血清作用于WB-F344細胞，以CCK-8法檢測細胞活性，顯示10%含藥血清具有較好的促進細胞增殖的效果，再用10%含藥血清處理干細胞，從糖代謝及分子水平上研究四逆散含藥血清對肝干細胞分化的影響，并探討調控分化的機制。

干細胞處于未分化狀態(tài)時，細胞維持自我更新或增殖狀態(tài)，細胞糖代謝途徑主要為無氧糖酵解［16－17］，這也是細胞維持其干性的一個指標。無氧糖酵解不僅存在于胚胎干細胞，在骨髓、造血及成體干細胞中也有文獻報道［18－19］。在一些因素的刺激下，細胞進行分化，能量代謝途徑發(fā)生改變，細胞耗氧量、ATP水平、糖酵解等代謝相關的酶類都有可能受分化進程的影響產生變化［20－22］。本實驗考察了WB-F344細胞的葡萄糖消耗量、乳酸的生成量以及ATP含量這幾個指標，并與正常大鼠肝細胞進行對照。結果顯示，隨著藥物血清作用時間的延長，細胞的葡萄糖消耗量、乳酸的生成量有降低趨勢，而細胞ATP水平有升高趨勢，提示細胞糖代謝水平可能發(fā)生改變，藥物血清誘導了肝干細胞的分化，但與正常肝細胞相比還有一定差距。

HGF是由728個氨基酸組成的糖蛋白，屬于肝源性因子，能刺激肝細胞生長和DNA合成，由間質細胞分泌，并以旁分泌方式作用于鄰近細胞［23］。HGF的受體是一種跨膜蛋白，由原癌基因cmet編碼，又被稱為Met，HGF與受體結合后可以誘導酪氨酸激酶的激活并促進Met的酪氨酸殘基磷酸化，進而磷酸化多種相關蛋白，激活多種信號通路而產生不同的生物學效應，如促進細胞分裂、啟動肝再生、誘導血管生成、促進細胞遷移、侵襲等［24－26］。EGFR家族包括EGFR、C2erbB22（HER-2）、C2erbB23、C2erbB24四個成員，調控多種細胞間信號和生物學活動。EGFR的配體主要包括TGF-α和EGF，HGF／c-Met和EGFR信號都可調控肝干細胞增生，凋亡，形態(tài)形成等［27－28］。FGFR主要包括FGFR1和FGFR2。FGFR1主要在卵圓細胞中表達，F(xiàn)GFR2主要存在于卵圓細胞中，肝星狀細胞亦有表達，F(xiàn)GF的乙酰肝素蛋白聚糖能夠與跨膜酪氨酸激酶受體結合，在肝干細胞分化的不同階段發(fā)揮作用，刺激來源于所有中胚層和內胚層細胞的增殖，同時具有促進內皮細胞趨化和有絲分裂的作用，也可以影響胚胎肝臟的形成和發(fā)育，在肝臟的發(fā)育和再生過程中起重要作用［29－31］。TGFβ家族包括TGF-β1，TGF-β2及TGF-β3，其中TGF-β1在體細胞中比例最高、活性最強且分布廣泛。TGF-β1與TGF-βRⅡ結合形成復合物，被TGF-βRⅠ識別，進一步被TGF-βRⅡ磷酸化后活化，進而啟動細胞下游信號通路［32］。TGF-β是一種調控肝干細胞分化生長的多效因子，一方面促進肝干細胞擴增、分化，另一方面又能誘導肝干細胞凋亡，抑制肝干細胞的過度增殖，以維持肝臟再生后保持其原有的形態(tài)與結構，這對肝損傷的修復、防止干細胞突變及肝腫瘤的發(fā)生有重要意義［33］。本研究結果顯示，四逆散血清作用于WB-F344細胞后，隨著作用時間的延長，細胞的EGFR、FGFR、TGF-βRⅠ、HGFR蛋白水平都有增加的趨勢，提示四逆散含藥血清誘導肝干細胞分化的機制可能與調控這些細胞因子受體的表達有關。

綜上所述，四逆散含藥血清具有促進肝干細胞增殖分化的作用，能夠改變肝干細胞的糖代謝水平，誘導細胞分化，其分化機制可能與調控細胞因子受體體系有關。這為臨床應用提供了可靠的理論依據(jù)，也為進一步的研究提供了新的思路。

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Effect of drug-containing serum of Si-Ni-San on inducing differentiation of rat′s hepatic stem cells and its regulatory mechanism

XUWei-dong1，QIAN Yuan-xia1，GAO Jing1，ZHAO Ying-qian2
（1．School of Pharmacy，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013；2．Clinical School of Traditional Chinese Medicine，HubeiUniversity of TCM，Wuhan Hubei430065，China）

Objective：To study the effectof drug-containing serum of Si-Ni-San on differentiation of rat′s hepatic stem cells and its mechanism，and explore the scientific basis for treatment of liver disease．M ethods：HPLC-MS-MSmethod was used to detect drug-containing serum of Si-Ni-San；WB-F344 cells were treated with drug-containing serum，the activity of cells was detected by CCK-8 assay，the glucose consumption was assessed by glucometer，generation of lactic acid was determined by LA kit，ATP content wasmeasured by luciferin luciferase method，and the expressions of epidermal growth factor receptor（EGFR），fibroblast growth factor receptor（FGFR），transforming growth factor beta receptor type I（TGF-βRⅠ），hepatocyte growth factor receptor（HGFR）were observed by western blotting．Results：In drug-containing serum of Si-Ni-San，some ingredients in prototype like paeoniflorin and aurantiamarin，others in metabolite type such as naringenin-glucuronic acid and glycyrrhetinic acid．Different concentrations of drugcontaining serum showed no toxic effects on WB-F344 cells after been incubated with drug-containing serum，10%concentration of drug-containing serum could significantly promote proliferation of WB-F344 cells．The levels of glucose consumption and lactic acid decreased with the time of differentiation，but ATP took on a up-regulating trend．the expressions of EGFR，F(xiàn)GFR，TGF-βRI and HGFR also increased as drug-containing serum incubation．Conclusion：The Si-Ni-San containing serum could promote hepaticstem cells′proliferation and induce their differentiation，and maybe the regulatory mechanism is related to cytokine receptors，such as EGFR，HGFR．

Si-Ni-San；hepatic stem cells；glycometabolism；differentiation；cytokine receptors

R285．5

A

1671－7783（2014）05－0369－06

10．13312／j．issn．1671-7783．y140094

國家中醫(yī)藥管理局基礎研究基金資助項目（04-05JP39）；江蘇大學高級專業(yè)人才科研啟動基金資助項目（11JDG133）

徐衛(wèi)東（1971—），男，河南永城人，博士，講師，主要從事中藥復方作用機制研究。

2014－06－11 ［編輯］ 陳海林