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(昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院創(chuàng)傷外科，云南 昆明 650101)

高遷移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein，HMGB1)是一種普遍存在于哺乳動物真核細(xì)胞內(nèi)的非組蛋白，最早被發(fā)現(xiàn)是在1973年，Goodwin等[1]利用羧甲基纖維素色譜法從小牛胸腺中分餾并進(jìn)行氨基酸分析和分子量測定。但是首先有報告證明這種蛋白質(zhì)在后期炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要的功能卻是在1999年，Wang等[2]利用小鼠建立的內(nèi)毒素血癥模型，從開始檢測到腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)或白細(xì)胞介素1(interleukin1-1，IL-1)的8 h后，小鼠體內(nèi)開始出現(xiàn)HMGB1。因其在炎癥反應(yīng)中出現(xiàn)的時間晚，持續(xù)時間長，故為晚期炎癥反應(yīng)提供了治療靶標(biāo)。在細(xì)胞內(nèi)，HMGB1可連接DNA起修飾染色體和調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄作用，在細(xì)胞外，HMGB1是一種促炎因子，可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、促進(jìn)細(xì)胞分化等，具有普遍的生物學(xué)效應(yīng)。近年來，不斷有學(xué)者發(fā)現(xiàn)HMGB1與許多疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系，例如腫瘤、動脈粥樣

硬化、風(fēng)濕免疫性疾病，骨關(guān)節(jié)疾病等，本文重點介紹HMGB1在骨關(guān)節(jié)疾病中的研究進(jìn)展。

1 HMGB1的分子結(jié)構(gòu)

HMGB1是一種核DNA結(jié)合蛋白，由215個氨基酸組成，在進(jìn)化上高度保守，他作為一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控的輔助因子，在哺乳動物之間具有99%的同源性，人類HMGB1a蛋白與嚙齒類動物的HMGB1僅在C末端重復(fù)序列中存在2個氨基酸的差異[3]。HMGB1蛋白由3個獨立的結(jié)構(gòu)域組成(A-box、B-box和C-box)。A-box介于第2到第79個氨基酸之間，是肝素結(jié)合位點，該區(qū)域的作用相當(dāng)于是拮抗總HMGB1蛋白，重組A-box蛋白在科研研究中可以作為HMGB1的拮抗劑使用，他對HMGB1產(chǎn)生競爭性抑制的作用。B-box介于第89到第163個氨基酸之間，其所在的區(qū)域即是引起炎癥反應(yīng)的結(jié)構(gòu)域，HMGB1的前炎癥因子活性即存在于B-box的前20個氨基酸序列，他具有促炎活性和與晚期糖化終產(chǎn)物受體(the receptor for advanced glycation end products，RAGE)結(jié)合的能力，A-box和B-box與DNA非特異性結(jié)合。C-box介于第186到第215個氨基酸之間，幾乎完全由天冬氨酸和谷氨酸構(gòu)成，故呈酸性，該區(qū)域的作用是在HMGB1核細(xì)胞遷移的過程中保護(hù)A-box和B-box[4]。需要特別提出的是，在23和45的位置上出現(xiàn)的2個半胱氨酸在低電勢下氧化還原形成二硫鍵，可以激活1個beklinα自噬。在106位的半胱氨酸負(fù)責(zé)結(jié)合到TOLL樣受體4(TOLL like reportor4，TLR-4)，并從活化的巨噬細(xì)胞釋放細(xì)胞因子[5]。

2 HMGB1的釋放

2.1 主動分泌

無論是炎性因子刺激還是細(xì)胞應(yīng)激，均可刺激單核巨噬細(xì)胞、成熟的樹突狀細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞核等核池內(nèi)的HMGB1乙?；偈顾诩?xì)胞中重新分布，以保持胞漿和胞核的動態(tài)平衡[6]。但是HMGB1蛋白不具有前導(dǎo)肽序列，故不能通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的經(jīng)典途徑分泌。他是由單核巨噬細(xì)胞通過專門的分泌性溶酶體產(chǎn)生囊泡，以出胞的方式分泌至細(xì)胞外 。

2.2 被動釋放

除了主動分泌之外，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生損傷和死亡后可被動釋放HMGB1[3]。凋亡細(xì)胞有著一定的特殊性：在細(xì)胞凋亡早期，因為HMGB1與胞核DNA緊密結(jié)合在一起，故不能釋放至細(xì)胞外。但在細(xì)胞凋亡的晚期，HMGB1可與DNA和細(xì)胞殘體分開，從而釋放到細(xì)胞外促進(jìn)炎癥發(fā)生，且HMGB1的被動釋放可能與凋亡細(xì)胞的類型相關(guān)[7]。同時，當(dāng)?shù)蛲黾?xì)胞被巨噬細(xì)胞吞噬之后，也可刺激巨噬細(xì)胞主動分泌HMGB1。

2.3 其他方式

某些細(xì)胞還可通過自分泌的形式分泌HMGB1，但是只對該細(xì)胞周圍的組織器官起作用，不參與全身炎癥反應(yīng)

3 HMGBl的受體

HMGB1經(jīng)過一系列的翻譯后修飾，如乙?；?，磷酸化，甲基化和多聚核糖基化等，最終釋放到細(xì)胞外激活免疫和炎癥反應(yīng)，其中包括RAGE、TLR、多配體蛋白聚糖、絡(luò)氨酸磷酸酶、血栓素等受體，目前研究較多的是RAGE和TLR。

3.1 RAGE

RAGE是一種免疫球蛋白，位于細(xì)胞表面，和HMGB1結(jié)合可促進(jìn)腫瘤生長，參與炎癥反應(yīng)。他是由一個N端序列、一個V形區(qū)域和兩個C型區(qū)域組成。V形區(qū)域和C1區(qū)域連接在一起形成一個結(jié)構(gòu)單元，該結(jié)構(gòu)單元在識別配體上起重要作用。RAGE有一個跨膜域和一個胞質(zhì)域，該區(qū)域?qū)π盘杺鲗?dǎo)至關(guān)重要[8]。HMGB1的生物學(xué)功能是通過其B-box與RAGE的V形結(jié)構(gòu)域相結(jié)合實現(xiàn)的。HMGB1與RAGE的結(jié)合還取決于肝素、細(xì)胞表面蛋白聚糖等多種因素。有研究表明[9]，和HMGB1相比，RAGE更容易與肝素形成復(fù)合物，且更穩(wěn)定，這為肝素拮抗HMGB1提供了新的依據(jù)。另外，HMGB1-RAGE的相互作用可能與炎性骨質(zhì)流失和骨重建有關(guān)[10]。最近有研究人員開發(fā)了一種新型蛋白質(zhì)骨架為基礎(chǔ)的HMGB1抑制劑，在體外能抑制HMGB1-RAGE的相互作用，且呈劑量依賴性[11]。

3.2 TLR

TLR是一組橫跨膜的蛋白質(zhì)(TLR1到TLR10)，和HMGB1結(jié)合可以刺激固有免疫，誘導(dǎo)新生血管。他們是由胞外域、跨膜域和胞質(zhì)域組成。胞外域是一組富含亮氨酸的重復(fù)序列，用來調(diào)節(jié)配體的識別,而胞質(zhì)域包含TOLL/IL-1受體，對信號傳導(dǎo)起著關(guān)鍵作用[12]。目前報道的與HMGB1有關(guān)的TLR包括TLR2，TLR4和TLR9，但很少有HMGB1與這些受體之間結(jié)合機(jī)制的研究，肝素可能在介導(dǎo)的HMGB1-RAGE相互作用中起重要作用，但不知道他是否介導(dǎo)HMGB1-TLR的相互作用[9],還需要進(jìn)一步的研究來探討HMGB1-TLR結(jié)合的機(jī)制。

4 HMGB1與骨關(guān)節(jié)疾病的關(guān)系

4.1 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一種自身免疫性疾病，其特征為慢性滑膜炎癥和關(guān)節(jié)軟骨侵蝕,該疾病全世界患病率是0.51%?；ぜ?xì)胞、巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞生產(chǎn)的促炎細(xì)胞因子(如TNF-α，IL-1和IL-6)和金屬蛋白酶在RA患者關(guān)節(jié)骨與軟骨破壞中發(fā)揮重要作用。HMGB1也已被證明了在發(fā)病中是重要的促炎因子，在大多數(shù)RA患者的血清中，HMGB1的水平比健康對照組顯著高，并且與疾病活動的程度相關(guān)。Kokkola等[13]首次發(fā)現(xiàn)在RA患者及佐劑性關(guān)節(jié)炎實驗大鼠滑膜組織中，無論是細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)，還是在細(xì)胞外，HMGB1均高度表達(dá)。Taniguchi等[14]發(fā)現(xiàn)RA患者的血清，關(guān)節(jié)液和滑膜組織中HMGB1水平均高于健康人。Ostberg等[15]將重組的HMGB1純化蛋白注入DNaseII(-/-)×IFNRI(-/-)小鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)，建立了一個很好的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型，進(jìn)一步證明了HMGB1在RA發(fā)病機(jī)制中的作用。在RA關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞中，HMGB1主要表達(dá)在滑膜上皮細(xì)胞，以巨噬細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)為主，而滑膜下細(xì)胞基本上無HMGB1的表達(dá)[16]。血管翳是巨噬細(xì)胞、破骨細(xì)胞等侵入的滑膜組織，逐漸侵蝕軟骨、軟骨下骨和骨骼，在RA患者的血管翳內(nèi)，有高表達(dá)的HMGB1、IL-1和TNF-α等促炎因子，提示HMGB1可能參與軟骨破壞的病理過程。在RA患者的關(guān)節(jié)中，破骨細(xì)胞是軟骨和支撐結(jié)構(gòu)被破壞的關(guān)鍵因素，破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞均可釋放HMGB1，成骨細(xì)胞主要是受甲狀旁腺素的刺激釋放，并且可能會介導(dǎo)骨重建。同時HMGB1也是一種破骨細(xì)胞激活劑，對軟骨及軟骨下骨有直接的破壞作用[10]。骨髓內(nèi)，骨凋亡細(xì)胞也可釋放HMGB1，作為骨吸收信號導(dǎo)致炎性骨質(zhì)流失。HMGB1還可以加速的組織型纖溶酶原激活物(tissue-type plasminogen activator,t-PA)催化纖溶酶原和金屬蛋白酶的活動，在關(guān)節(jié)炎的早期即可通過該過程引起軟骨和骨的破壞。

4.2 強(qiáng)直性脊柱炎

強(qiáng)直性脊柱炎(Ankylosing Spondylitis，AS)是一種慢性風(fēng)濕性疾病，其特點是骶髂關(guān)節(jié)疼痛，脊柱關(guān)節(jié)附著部位局部炎癥、骨化，最終導(dǎo)致患者殘疾和功能受限[17]。對于該疾病的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全了解。雖然尚未找到微生物與AS發(fā)病機(jī)制的直接聯(lián)系，但是目前已經(jīng)證實微生物可能通過泌尿系統(tǒng)或消化系統(tǒng)刺激TLR引發(fā)慢性炎癥，而壞死細(xì)胞釋放的HMGB1可通過RAGE和TLR介導(dǎo)，從而參與AS的發(fā)病過程。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對AS患者血清HMGB1的表達(dá)做了一系列研究，李宏芬等[18]分別對40例AS患者和健康對照組的血清HMGB1進(jìn)行了對比，他們認(rèn)為AS患者血清中HMGB1的水平高于健康對照者，且與AS活動期指標(biāo)C反應(yīng)蛋白(C reactive protein，CRP)、紅細(xì)胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR),血小板(blood platelet，PLT)均呈正相關(guān)。劉小軍等[19]認(rèn)為，AS患者血清HMGB1的水平與ESR、強(qiáng)直性脊柱炎常用療效評分標(biāo)準(zhǔn)(Bath Ankylosing Spondylitis Disease Activity Index，BASDAI)呈正相關(guān)，而與CRP無關(guān)。但最近，Oktayoglu等[20]發(fā)表了一項研究，他們利用30名AS患者和29名健康對照組，檢測其血清HMGB1含量和各項AS指標(biāo)，包括強(qiáng)直性脊柱炎功能性指數(shù)(Bath Ankylosing Spondylitis Functional Index，BASFI)、BASDAI、ESR、CRP、PLT等，發(fā)現(xiàn)在AS患者的血清HMGB1水平高于健康對照組，但是與其他AS的指標(biāo)均不相關(guān)，最后他們建議盡管在AS的發(fā)病機(jī)制中HMGB1可能發(fā)揮重要作用，但并不是一個反應(yīng)疾病活動的好指標(biāo)。對于HMGB1在AS發(fā)病機(jī)制中的作用還需進(jìn)行大樣本的進(jìn)一步的研究。

4.3 骨肉瘤

骨肉瘤是一種常發(fā)生在20歲以下的青少年或兒童的惡性骨腫瘤，在小兒骨惡性腫瘤中最多見，約占小兒腫瘤的5%。在骨肉瘤的化療過程中，常會有化療藥物耐藥的情況出現(xiàn)[21]。有研究發(fā)現(xiàn)，阿霉素、順鉑、甲氨蝶呤都能促進(jìn)人骨肉瘤細(xì)胞HMGB1表達(dá)增強(qiáng)，而HMGB1介導(dǎo)的細(xì)胞自噬[22](程序性細(xì)胞存活機(jī)制，與細(xì)胞凋亡相對)將顯著提高化療藥物的耐藥性。采用短發(fā)夾核糖核酸(short hairpin Ribonucleic Acid,shRNA)介導(dǎo)的方式敲出HMGB1后，無論是在體內(nèi)還是體外均可促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞死亡和抑制其生長。因此，降低HMGB1的表達(dá)可抑制骨肉瘤細(xì)胞自噬，增加骨肉瘤細(xì)胞的死亡和化療藥物的敏感性[23]。另外，維持HMGB1 A-box的氧化還原狀態(tài)，可能會調(diào)節(jié)順鉑的抗腫瘤活性[24]?？傊?，對于HMGB1的研究將作為骨肉瘤治療的一個新的目標(biāo)。

4.4 骨關(guān)節(jié)炎

骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種以關(guān)節(jié)軟骨退變、骨贅形成、軟骨下骨化為特點的慢性炎性關(guān)節(jié)炎，還可以誘發(fā)繼發(fā)性滑膜炎，其發(fā)病機(jī)制仍未完全明了。以前有學(xué)者認(rèn)為，在OA的發(fā)病中，HMGB1的表達(dá)和炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-8一樣會上調(diào)[25]。最近，Heinola等[26]已經(jīng)證實，在牛膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎中，HMGB1通過基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)來介導(dǎo)組織蛋白的降解和重塑。Kyostio等[27]利用STR/ORT小鼠制造了一個很好的自發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎的模型，該模型骨關(guān)節(jié)炎增生的滑膜組織中。HMGB1相對于對照組明顯升高。Terada等[28]利用PT-PCR和免疫組化對27例OA患者關(guān)節(jié)軟骨和4例正常關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在OA患者關(guān)節(jié)軟骨中，無論是mRNA還是HMGB1的表達(dá)均遠(yuǎn)大于正常關(guān)節(jié)軟骨，且HMGB1在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)主要是在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，在細(xì)胞核內(nèi)OA患者和對照組無明顯區(qū)別，故可推測在OA的發(fā)病機(jī)制中核外HMGB1可能起重要作用。

5 HMGB1拮抗劑

HMGB1的拮抗劑包括特異性HMGB1中和抗體，丙酮酸乙酯，HMGB1 A-box蛋白，硬脂酰溶血磷脂酰膽堿，他汀類藥物等。丙酮酸乙酯是一種氧自由基清道夫，也是目前研究較多的一種HMGB1拮抗劑。他可能的機(jī)制是抑制核因子kB(NF-kB)和酪氨酸蛋白激酶(Janus Kinase,JAK)/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducers and activators of transcription,STAT)信號通路，以及其抗氧化的作用。他可以抑制多種炎癥介質(zhì)的釋放，顯著降低血清HMGB1的水平[29]。Yang J等[30]利用單克隆抗HMGB1抗體和HMGB1 A-box蛋白，在膠原性關(guān)節(jié)炎(Collagen-induced arthritis，CIA)動物模型上成功的改善了其關(guān)節(jié)炎的癥狀。Otoshi等[31]也在動物實驗上證實了HMGB1阻斷治療對于髓核移植引起的神經(jīng)根性痛有一定的效果，但抗HMGB1抗體和A-box蛋白制備困難，且價格比較昂貴，離臨床應(yīng)用還有一定的距離。有報道稱[32]RA患者血清HMGB1水平與膽堿能抗炎途徑的活性有關(guān)，在CIA實驗動物模型中，通過增強(qiáng)迷走神經(jīng)的信號傳導(dǎo)，可以明顯減少HMGB1的釋放和抑制HMGB1的促炎活性，因此將來可以通過增加迷走神經(jīng)的活動來減低HMGB1的水平。近年來，也有學(xué)者研究中草藥制劑對HMGB1的抑制作用，如甘草酸等，特別是在抗腫瘤方面[33]。

6 小結(jié)與展望

HMGB1作為一種核因子和一種分泌蛋白，他是動植物生存所必須的蛋白，他在細(xì)胞內(nèi)可以起到修飾染色質(zhì)和調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的作用。在細(xì)胞外，它與RAGE，TLR等受體以高親和力結(jié)合，在炎癥晚期誘導(dǎo)促炎因子活化，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。也正是由于他出現(xiàn)在炎癥晚期這一特點，為臨床上的治療提供了明確的治療靶標(biāo)和足夠的治療時間。但對于HMGB1的作用機(jī)制還需進(jìn)一步的研究，如HMGB1-TLR相互作用的機(jī)制，HMGB1在AS發(fā)病過程中的作用等。這些問題的闡明將有助于為這些疾病提供新的治療策略

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