馬振江,丁 偉,張 凱,趙 杰

下腰痛是一種常見病、多發(fā)病，它影響人們的生活質(zhì)量和精神狀態(tài)，成為困擾人類的疾病之一[1-3]。很多因素都會導(dǎo)致下腰痛，其中椎間盤退變是最重要的因素之一[4]。目前臨床上針對椎間盤退變引起相關(guān)疾病的治療策略是解除椎間盤退變相關(guān)的脊髓、神經(jīng)和血管刺激或壓迫，并非針對椎間盤退變的病理過程，因而臨床癥狀可反復(fù)發(fā)作，而且手術(shù)后病變節(jié)段的相鄰節(jié)段椎間盤退變加速[5-6]。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，特別是分子生物學(xué)技術(shù)不斷進(jìn)步，延緩甚至逆轉(zhuǎn)椎間盤退變正成為可能。目前治療椎間盤退變的分子生物學(xué)技術(shù)主要包括三大類：細(xì)胞治療、組織工程治療及基因治療。本綜述主要著重基因治療。

1 椎間盤退變的病理機(jī)制

椎間盤由髓核、纖維環(huán)和軟骨終板構(gòu)成，其主要成分是椎間盤細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)。軟骨終板由圓形軟骨細(xì)胞組成。纖維環(huán)細(xì)胞分為3層，外層呈梭形，內(nèi)層與軟骨細(xì)胞相似，中間層則是移行帶。髓核細(xì)胞在幼兒時(shí)主要由脊索細(xì)胞組成，成年時(shí)則逐漸被纖維軟骨所取代。椎間盤細(xì)胞的密度較大多數(shù)組織細(xì)胞密度低，細(xì)胞分布也不均勻，細(xì)胞外基質(zhì)主要由膠原、蛋白多糖和彈性蛋白組成。正常情況下纖維環(huán)中含有Ⅰ型膠原，主要是抗張力；髓核含有Ⅱ型膠原，主要是抗壓力。蛋白多糖是椎間盤主要的大分子結(jié)構(gòu)，包括硫酸軟骨素、硫酸角質(zhì)素和透明軟骨素等，主要作用是維持椎間盤水分、濃度、滲透壓、正常代謝和均勻分布應(yīng)力。彈性蛋白與膠原纖維一樣固定椎間盤，具有彈性，起震蕩吸收作用。椎間盤是一封閉結(jié)構(gòu)，內(nèi)無血管，椎間盤細(xì)胞只能靠溶質(zhì)彌散獲取營養(yǎng)，這不利于損傷修復(fù)。但在封閉相對缺血的環(huán)境下卻可避免發(fā)生自身免疫反應(yīng)。這使得基因療法的應(yīng)用比其他組織更具優(yōu)勢。

到目前為止，椎間盤退變的確切機(jī)制尚不清楚，眾多因素(包括遺傳、生化和生物力學(xué)等)都可能引起椎間盤退變[7]。過去觀念認(rèn)為椎間盤退變主要與環(huán)境因素有關(guān)，比如司機(jī)駕車時(shí)震動[8]，舉重運(yùn)動員抓舉重物[9]，缺少運(yùn)動鍛煉的生活方式[10]。此外吸煙或者創(chuàng)傷也被認(rèn)為是重要因素之一[7-8]。但目前最新觀點(diǎn)認(rèn)為椎間盤退變過程中，遺傳因素的作用占70%，而其他環(huán)境因素的作用只占30%[11]。椎間盤退變最主要的標(biāo)志是蛋白多糖的進(jìn)行性減少，這與氧張力降低、自由基增加、PH降低、蛋白溶解酶增加有關(guān)[11-12]。由于蛋白多糖的丟失，髓核不能保持正常的流體靜力壓，最終導(dǎo)致椎間盤脫水變性[13]。另外，椎間盤中膠原的比例也發(fā)生改變，Ⅱ型膠原逐漸減少。最終導(dǎo)致纖維環(huán)和髓核發(fā)生退變，進(jìn)而影響椎間盤的生物力學(xué)特性[14-15]。

很多研究表明蛋白多糖的減少是分解代謝和合成代謝不平衡所致，原因在于基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)和解聚素樣金屬蛋白酶表達(dá)上調(diào)，同時(shí)膠原和蛋白多糖的合成減少[16-17]。隨著分子生物學(xué)的技術(shù)不斷進(jìn)步，基因治療在改變椎間盤細(xì)胞代謝和生物力學(xué)性能方面發(fā)揮著重要作用。

2 基因治療

基因治療是指將外源正?；?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補(bǔ)償基因缺陷和異常以治療相關(guān)疾病，也就是將外源基因通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)插入患者適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中，通過外源基因制造的產(chǎn)物治療某種疾病。具體到椎間盤的基因治療，包括以下幾部分：①充分明確椎間盤退變的機(jī)制；②目的基因的選擇與修飾；③轉(zhuǎn)基因載體的選擇與應(yīng)用；④轉(zhuǎn)基因的調(diào)控。根據(jù)對靶細(xì)胞處理方法的不同分為2種：一是直接基因療法；二是間接基因療法。直接基因療法操作比較簡單，但是安全性較差，而間接基因療法操作復(fù)雜，細(xì)胞特性容易發(fā)生改變，基因表達(dá)不一定滿意，但是比較安全。Wehling等[18]1997年首次報(bào)道逆轉(zhuǎn)錄病毒作為載體攜帶β-半乳糖苷酶和白介素受體-1拮抗劑基因轉(zhuǎn)染牛軟骨細(xì)胞，48 h后盡管只有1%細(xì)胞被轉(zhuǎn)染，但是白介素受體-1拮抗劑基因較對照組表達(dá)增加。這是首次提出應(yīng)用間接基因療法治療椎間盤退變。基因轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞一般有以下方法：①電穿孔法；②顯微注射法；③粒子轟擊法；④超聲波法；⑤磷酸鈣共沉淀法。

2.1 基因治療載體

轉(zhuǎn)基因載體是研究基因治療中最重要和最艱難的部分之一。理想的基因載體具有以下特征：①容易進(jìn)入靶細(xì)胞；②能夠在靶細(xì)胞中持續(xù)高水平表達(dá)；③外源性基因含有自主復(fù)制的構(gòu)件或整合于基因組活化區(qū); ④操作比較安全；⑤容易大量生產(chǎn)[17]。基因載體分為兩大類：一類是病毒載體，其轉(zhuǎn)染效率高，基因表達(dá)水平高，持續(xù)性好，但是毒副作用大，安全性差，比如腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、細(xì)小RNA病毒等；一類是非病毒載體，轉(zhuǎn)染效率及表達(dá)水平不高，但是安全性較好，比如脂質(zhì)體和DNA配體復(fù)合物。目前病毒載體是椎間盤細(xì)胞的首選載體，其中腺病毒、腺相關(guān)病毒、慢病毒載體應(yīng)用較多，具體如下。

2.1.1 腺病毒載體

腺病毒為線性雙鏈DNA，分為6個(gè)亞屬，近50個(gè)亞型。目前主要用以構(gòu)建載體的是2型和5型腺病毒，其能夠轉(zhuǎn)染分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞，病毒基因并不整合到宿主細(xì)胞，所以其選擇的范圍很廣。1998年Nishida等[19]首次應(yīng)用腺病毒載體介導(dǎo)，將標(biāo)記基因LacZ轉(zhuǎn)染體內(nèi)外兔椎間盤髓核細(xì)胞。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)基因LacZ全部表達(dá)，無明顯細(xì)胞毒性，而且基因LacZ持續(xù)表達(dá)3周未減退。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明基因LacZ不僅局限在注射部位而且彌漫到周圍椎間盤，持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)12周，組織學(xué)上未發(fā)現(xiàn)明顯炎癥改變。以上表明腺病毒載體轉(zhuǎn)染椎間盤細(xì)胞是可行的。1999年Nishida等[20]再次報(bào)道應(yīng)用腺病毒載體介導(dǎo)，將基因hTGF-T1轉(zhuǎn)染體內(nèi)的兔椎間盤髓核細(xì)胞,免疫組化提示轉(zhuǎn)染的髓核細(xì)胞中hTGF-T1的表達(dá)比對照組增加5倍，同時(shí)蛋白多糖的含量增加了1倍。此實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明腺病毒載體轉(zhuǎn)染椎間盤細(xì)胞是可行的。2000年Moon等[21]報(bào)道應(yīng)用腺病毒載體介導(dǎo)，將基因LacZ和熒光素酶轉(zhuǎn)染退變和未退變的椎間盤細(xì)胞，結(jié)果表明椎間盤細(xì)胞達(dá)到100%轉(zhuǎn)染，需要的最小病毒量是150 mol,同時(shí)在退變和未退變的細(xì)胞中熒光素酶活性沒有明顯差異。此實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)腺病毒載體轉(zhuǎn)染人椎間盤細(xì)胞可行，為進(jìn)一步治療人椎間盤退變提供了一種途徑。但是由于腺病毒載體不整合到宿主細(xì)胞，同時(shí)容易產(chǎn)生抗原，進(jìn)一步導(dǎo)致應(yīng)答反應(yīng)，故其表達(dá)時(shí)間不是很長[22]。有學(xué)者使用腺病毒作為載體嘗試轉(zhuǎn)染牛髓核細(xì)胞，使其表達(dá)多種骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMPs)和Sox9基因，此研究表明，經(jīng)過BMP-2和BMP-7轉(zhuǎn)染的牛髓核細(xì)胞能合成大量的多聚糖蛋白[23]。

2.1.2 腺相關(guān)病毒載體

腺相關(guān)病毒為線性單鏈DNA，無致病性，其基因組的整合對細(xì)胞的復(fù)制無任何不良影響，可以在19號染色體上進(jìn)行定點(diǎn)特異整合，穩(wěn)定性好，且能轉(zhuǎn)染分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞，但病毒小，最大插入列僅4.5 kb，而且不容易獲得高滴度。Lattermann等[24]的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，分別在體內(nèi)、體外比較腺病毒和腺相關(guān)病毒載體轉(zhuǎn)染髓核細(xì)胞的效率，腺相關(guān)病毒載體表達(dá)時(shí)間長達(dá)6周，而且目的基因LacZ表達(dá)水平也較高。盡管腺相關(guān)病毒有很多缺點(diǎn)，但目前仍受到很多關(guān)注

2.1.3 慢病毒

慢病毒是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒，以人類免疫缺陷I型病毒(human immunodeficiency virus-1,HIV-1)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體，與一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體不同，既能感染分裂細(xì)胞又能感染非分裂細(xì)胞，同時(shí)保留了整合到宿主染色體上的特點(diǎn)，可轉(zhuǎn)移較大的基因片段、目的基因表達(dá)時(shí)間長、而且不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)[25]。

2.2 椎間盤細(xì)胞的相關(guān)基因

研究表明許多細(xì)胞因子與膠原、蛋白多糖有關(guān)。膠原和蛋白多糖隨著時(shí)間的延長會逐漸失去彈性和張力，進(jìn)而水含量減少，使得細(xì)胞外基質(zhì)承受過度負(fù)荷，導(dǎo)致基質(zhì)降解，椎間盤發(fā)生變形，生物力學(xué)性能發(fā)生改變，最終導(dǎo)致椎間盤退變。根據(jù)作用的不同將細(xì)胞因子分為4類：①抗分解代謝因子，如MMP抑制劑、白介素-1受體拮抗劑；②促細(xì)胞分裂因子，如胰島素生長因子、生長分化因子；③骨誘導(dǎo)形成細(xì)胞因子，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白；④細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)因子，如軟骨特異性基因Sox-9。典型因子具體如下。

2.2.1 抗分解代謝因子

MMP組織抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP)家族目前發(fā)現(xiàn)有4種：TIMP1、TIMP2、TIMP3、TIMP4。其中TIMP1具有多種生物學(xué)功能，并且在細(xì)胞外基質(zhì)改建和椎間盤病理過程中發(fā)揮生物學(xué)作用[26]。其主要是對MMP的抑制作用，并能促進(jìn)細(xì)胞增殖抑制細(xì)胞凋亡[27]。Sobajima等[28]報(bào)道兔椎間盤退變早期TIMP1表達(dá)下降，3周后表達(dá)量約為退變前的10%，此研究表明早期可以向椎間盤注射TIMP1以延緩?fù)俗儭allach等[29]報(bào)道腺病毒載體轉(zhuǎn)染TIMP1基因和BMP-2基因，結(jié)果表明細(xì)胞外基質(zhì)降解減少，同時(shí)TIMP1與BMP-2促進(jìn)細(xì)胞合成代謝效果相當(dāng)。

2.2.2 促細(xì)胞分裂因子

2.2.2.1 胰島素生長因子(insulin like growth factor， IGF)

IGF-1具有促進(jìn)軟骨細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)的作用，同時(shí)通過降低MMP-2來減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解。Osada等[30]應(yīng)用原位雜交方法證實(shí)髓核細(xì)胞中有IGF-1 mRNA表達(dá)，同時(shí)這些細(xì)胞有自分泌和旁分泌功能。Gruber等[31]2002年報(bào)道將體外單層培養(yǎng)的椎間盤細(xì)胞加入IGF-1，細(xì)胞凋亡延緩。Allen等[32]2005年報(bào)道IGF-1通過調(diào)控Bcl/Bax平衡或者磷脂酰肌醇3-激酶和原蛋白激酶有絲分裂通路來抑制細(xì)胞凋亡。

2.2.2.2 BMP

BMP屬于轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming grouth factor-β,TGF-β)超家族成員，目前主要研究BMP-2和BMP-7。BMP-2是一種多功能生長因子，能刺激細(xì)胞外基質(zhì)合成，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長分化和凋亡，對軟骨形成和維持細(xì)胞表型有重要作用。Kim等[33]報(bào)道重組BMP-2能促進(jìn)人退變椎間盤細(xì)胞Ⅰ型膠原和Ⅱ型膠原mRNA的表達(dá)和蛋白多糖合成。Li等[34]2004年報(bào)道在大鼠椎間盤細(xì)胞加入BMP-2后Ⅱ型膠原mRNA的表達(dá)和蛋白多糖合成增加，TGF合成也增加。Gamradt等[35]2006年報(bào)道成功應(yīng)用腺病毒載體攜帶重組BMP-2基因轉(zhuǎn)染兔骨髓細(xì)胞并在體內(nèi)持續(xù)表達(dá)12周。綜上，重組BMP-2可以延緩甚至逆轉(zhuǎn)椎間盤退變。BMP-7又稱成骨蛋白,對膠原合成及蛋白質(zhì)合成積聚起刺激作用。Takegami等[36]2002年報(bào)道BMP-7促進(jìn)蛋白多糖合成，還能通過抑制白介素-1減少蛋白多糖分解。An等[37]2005年報(bào)道向正常兔椎間盤中注射BMP-7，2周后注射組椎間盤高度較對照組增加15%，4～8周后效果仍顯著。以上結(jié)果表明重組BMP-7可以促進(jìn)蛋白多糖合成。

2.2.3 TGF-β

TGF-β是目前研究最廣也是最深入的一種細(xì)胞因子。它是一種具有多種功能的蛋白多肽，廣泛存在于動物正常組織細(xì)胞以及轉(zhuǎn)化細(xì)胞中。Thompson等[38]一項(xiàng)體外實(shí)驗(yàn)中，外源性TGF-β1促進(jìn)犬髓核細(xì)胞蛋白多糖合成，這也是首次應(yīng)用細(xì)胞因子延緩椎間盤退變。此后，不斷有報(bào)道提示TGF-β促進(jìn)椎間盤細(xì)胞合成蛋白多糖和Ⅱ型膠原。

2.2.4 細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)因子

Sox-9基因是Sox基因家族成員之一，軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原合成過程的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。Paul等[39]2003年報(bào)道將Sox-9基因轉(zhuǎn)染至兔退變的椎間盤細(xì)胞中，5周后Ⅱ型膠原合成增加，軟骨細(xì)胞維持原有表型，而對照組中髓核細(xì)胞的數(shù)量已經(jīng)下降，并被成纖維細(xì)胞取代。2007年Liu等[40]報(bào)道通過重組病毒Sox-9基因轉(zhuǎn)染至退變的椎間盤細(xì)胞中結(jié)果提示Sox-9基因可以在體內(nèi)表達(dá)。以上結(jié)果表明Sox-9基因能夠延緩椎間盤的退變。

2.3 基因治療的安全調(diào)控

引入非特異性基因的治療模式中應(yīng)用較多的是cDNA。它是一種結(jié)構(gòu)基因，自身沒有調(diào)控表達(dá)的能力，這種基因的表達(dá)調(diào)控依賴于轉(zhuǎn)基因的載體。同時(shí)基因表達(dá)的調(diào)控具有多層次性，其中轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)是基因表達(dá)的基本控制點(diǎn)。它包括啟動子、增強(qiáng)子、沉默子、加尾PolyA信號等[41]。由于基因載體大多數(shù)都是病毒，不可避免的都有毒副作用，因此需要病毒的量盡可能少。Moon等[42]2008報(bào)道人髓核細(xì)胞在體內(nèi)外分別予以腺病毒載體TGF-β1、BMP-2、IGF-1單獨(dú)或者聯(lián)合轉(zhuǎn)染，結(jié)果提示蛋白多糖在使用單一治療基因時(shí)增加180%～295%，而在聯(lián)合使用2種治療基因時(shí)蛋白多糖增加322%～398%，更令人鼓舞的是，聯(lián)合使用3種治療基因時(shí)蛋白多糖增加471%。將來的研究趨勢是否能夠與抗分解因子聯(lián)合使用來進(jìn)一步減少病毒量。另外，當(dāng)前還有一些轉(zhuǎn)基因表達(dá)系統(tǒng)，比如熱休克蛋白、類固醇激素啟動子、四環(huán)素等。這些表達(dá)系統(tǒng)大多數(shù)都是通過活化載體上的治療基因，類似于開關(guān)系統(tǒng)。Chtarto等[43]2003報(bào)道使用四環(huán)素調(diào)節(jié)系統(tǒng)調(diào)節(jié)腺相關(guān)病毒載體轉(zhuǎn)染。Ueblacker等[44]2004年報(bào)道應(yīng)用四環(huán)素調(diào)節(jié)系統(tǒng)在兔骨軟骨缺損模型中獲得成功。下一步的目標(biāo)是使四環(huán)素系統(tǒng)更加高效、加載藥量更小、副作用更小。

另外，目前比較流行的RNA干擾技術(shù)，可以特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達(dá)。因此在椎間盤退變中將促分解代謝因素的基因抑制或者降低表達(dá)是另外一種可選擇的治療途徑。Kakutani等[45]2006年報(bào)道使用RNA干擾技術(shù)分別在體外培養(yǎng)大鼠和人髓核細(xì)胞，結(jié)果提示大鼠中熒光酶基因表達(dá)下降94.7%，在人髓核細(xì)胞中熒光酶基因表達(dá)下降93.7%，并且這種抑制效應(yīng)持續(xù)3周。

3 展 望

自從1997年Wehling等首先提出轉(zhuǎn)基因逆轉(zhuǎn)椎間盤退變的設(shè)想，椎間盤退變基因治療研究已達(dá)16年，目前仍處于實(shí)驗(yàn)研究初級階段，要真正運(yùn)用于臨床仍需要深入開展大量的研究工作。具體一些策略如下：①進(jìn)一步明確椎間盤退變的分子生物學(xué)機(jī)制，找出更多的相關(guān)基因。②深入研究目前關(guān)注的一些細(xì)胞因子cDNA轉(zhuǎn)染椎間盤細(xì)胞后的表達(dá)及其副作用，以進(jìn)一步證明其在基因治療方面上的臨床意義。③尋找新的更有效的細(xì)胞因子，同時(shí)研究各種細(xì)胞因子之間的相互作用，在此基礎(chǔ)上嘗試多基因轉(zhuǎn)移的可能性。④深入研究外源性基因表達(dá)調(diào)控，使得目的基因適時(shí)適量表達(dá)，最終發(fā)揮生物效應(yīng)。⑤目前采取的病毒載體在轉(zhuǎn)染椎間盤細(xì)胞方面存在一些問題，需通過不斷改進(jìn)逐步解決一些困難，同時(shí)努力開發(fā)新的更高效更安全的載體。⑥探索和改進(jìn)組織工程技術(shù)，在基因轉(zhuǎn)移的策略上堅(jiān)持從間接基因療法上突破。⑦擴(kuò)大基因治療模式，如基因增補(bǔ)或者反義技術(shù)等。

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