黃燕，周月鵬，肖壽華，張志堅

（1．江蘇大學附屬醫(yī)院眼科，江蘇鎮(zhèn)江212001；2．江蘇大學附屬醫(yī)院檢驗科，江蘇鎮(zhèn)江212001；3．江蘇大學醫(yī)學院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

大鼠角膜穿通傷后局部應用IL-10抑制視網(wǎng)膜炎癥和抗神經(jīng)潰變的研究

黃燕1，周月鵬2，肖壽華1，張志堅3

（1．江蘇大學附屬醫(yī)院眼科，江蘇鎮(zhèn)江212001；2．江蘇大學附屬醫(yī)院檢驗科，江蘇鎮(zhèn)江212001；3．江蘇大學醫(yī)學院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

目的：觀察角膜穿通傷后局部應用IL-10對視網(wǎng)膜炎癥反應的抑制和對神經(jīng)潰變的保護作用。方法：將清潔級成年雌性SD大鼠50只，隨機分為對照組（8只）、損傷組和治療組，后兩組（每組21只）再分為損傷1 d、2 d和3 d組（每小組7只）。損傷組用無菌注射器刺穿眼球顳側(cè)角膜緣角膜，制作角膜穿通傷模型。治療組在角膜穿通傷后用IL-10溶液滴眼。各組2只大鼠用于制作眼球切片，免疫熒光染色觀察角膜穿通傷后炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α以及神經(jīng)絲蛋白-200（neurofilament protein-200，NF-200）、血影蛋白（α-Ⅱspectrin）及鈣蛋白酶2（m-calpain）在視網(wǎng)膜中的分布特征；另5只大鼠用于提取視網(wǎng)膜蛋白，采用免疫印跡法檢測各組大鼠于角膜穿通傷24，48，72 h后，視網(wǎng)膜組織內(nèi)NF-200和血影蛋白降解產(chǎn)物以及活性鈣蛋白酶2相對含量的動態(tài)變化。結(jié)果：對照組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)層次清楚，IL-1β、IL-6、TNF-α和m-calpain免疫熒光很弱；血影蛋白和NF-200免疫熒光染色可清晰顯示陽性神經(jīng)纖維；角膜穿通傷后，視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)層次模糊，TNF-α、IL-1β，IL-6和m-calpain免疫熒光增強，主要分布在內(nèi)層；NF-200和血影蛋白免疫熒光染色顯示陽性神經(jīng)纖維明顯減少；IL-10治療后，TNF-α、IL-1β，IL-6和m-calpain免疫熒光減弱，血影蛋白和NF-200陽性神經(jīng)纖維明顯多于損傷組。免疫印跡檢測結(jié)果表明，損傷組視網(wǎng)膜組織內(nèi)大分子的NF-200和血影蛋白含量逐漸減少，其小分子的降解產(chǎn)物以及小分子的活性m-calpain逐漸增加；在IL-10治療組，NF-200和血影蛋白的降解產(chǎn)物以及活性m-calpain的增加程度明顯減輕。結(jié)論：角膜穿通傷可刺激視網(wǎng)膜細胞高表達炎癥因子IL-1β，IL-6和TNF-α，導致組織的炎癥損傷，同時激活m-calpain，后者降解視網(wǎng)膜細胞骨架蛋白NF-200和血影蛋白，造成神經(jīng)潰變；局部應用IL-10可減輕炎癥反應，抑制m-calpain對骨架蛋白的降解，從而對視網(wǎng)膜細胞產(chǎn)生保護作用。

角膜穿通傷；視網(wǎng)膜；炎癥；神經(jīng)潰變；白介素-10；大鼠

各種組織和器官的原發(fā)性損傷均可使機體產(chǎn)生全身和局部的應激反應，刺激損傷組織細胞過度表達各種炎癥因子，引起炎癥反應，造成原發(fā)性損傷組織及其周邊組織的繼發(fā)性損傷。眼球穿通傷是一種常見的眼外傷，如果不進行有效的治療將會導致嚴重的繼發(fā)性損傷，如視網(wǎng)膜神經(jīng)潰變。我們先前的研究發(fā)現(xiàn)，大鼠角膜穿通傷可刺激眼球壁組織分泌熱休克蛋白90和大量炎癥因子（IL-1β、IL-6、TNF-α），導致視網(wǎng)膜產(chǎn)生炎癥損傷，并激活鈣蛋白酶2（m-calpain），降解視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞中的骨架蛋白，如神經(jīng)絲蛋白-200（neurofilament protein-200，NF-200）和血影蛋白（α-Ⅱspectrin）等，最終導致神經(jīng)潰變［1－2］。已有文獻報道，IL-10為重要的抗炎因子，可抑制炎癥因子的產(chǎn)生，減輕組織損傷后的炎癥反應［3］。IL-10還具有神經(jīng)營養(yǎng)作用，可以防止神經(jīng)潰變和促進神經(jīng)再生［4－7］。本研究基于IL-10的上述生物學作用，在大鼠角膜穿通傷后，局部應用IL-10，觀察其抑制視網(wǎng)膜炎癥反應和抗神經(jīng)潰變的療效，為臨床應用IL-10治療角膜穿通傷導致的繼發(fā)性視網(wǎng)膜損傷提供實驗和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 主要試劑

兔抗m-calpain抗體、小鼠抗NF-200單克隆抗體、小鼠抗血影蛋白單克隆抗體及小鼠抗β-肌動蛋白單克隆抗體均為Santa Cruz公司產(chǎn)品；兔抗小鼠IgG-cy3、羊抗兔IgG-cy3為Sigma公司產(chǎn)品；羊抗兔IgG-HRP、兔抗小鼠IgG-HRP購自武漢博士德生物工程有限公司。

1．2 實驗動物及分組

清潔級成年雌性SD大鼠50只（100眼），由江蘇大學實驗動物中心提供，體質(zhì)量為250 g左右。所有大鼠均健康、無眼疾，飼養(yǎng)與使用均遵照視覺與眼科研究協(xié)會制定的科研動物使用規(guī)范。將大鼠隨機分為正常對照組（8只），角膜穿通傷組（損傷組）和IL-10治療組，后兩組（每組21只）再分為損傷1 d、2 d和3 d組。

1．3 動物模型的制作方法

制作模型前24 h大鼠眼部涂抹紅霉素眼膏預防感染。經(jīng)0．3%戊巴比妥鈉（30 mg／kg）腹腔注射麻醉，雙側(cè)眼眶周圍采用碘伏消毒，用75%的乙醇脫碘，0．4%鹽酸奧布卡因滴眼液結(jié)膜囊表面麻醉，無菌生理鹽水沖洗雙眼結(jié)膜囊。在雙眼顳側(cè)（左眼3點鐘方向，右眼9點鐘方向）角膜緣前2 mm處用1 mL無菌注射器迅速刺穿角膜，針尖指向鼻側(cè)，進針約0．5 mm，眼球內(nèi)無出血、有房水外溢為造模成功，術(shù)后眼部涂抹紅霉素眼膏預防感染。IL-10治療組于角膜穿通傷后立即給予球旁注射質(zhì)量濃度為10μg／mL的IL-10液體10μL（凈含量為100 ng），并每隔12 h用微量注射器給予傷眼上述濃度液體20μL滴眼，滴眼后眼浴1 min。對照組用生理鹽水代替IL-10治療。

1．4 眼球的取材、切片制作及免疫熒光染色

正常組、角膜穿通傷組和IL-10治療組大鼠按預定時間，以0．3%戊巴比妥鈉（30 mg／kg）麻醉，經(jīng)左心室-主動脈弓依次灌注生理鹽水400 mL和4℃的4%低聚甲醛溶液400 mL后摘取眼球，并置入4%低聚甲醛溶液中，4℃固定24 h。將固定后的眼球取出置入30%蔗糖磷酸鹽緩沖液中4℃浸泡12 h，至眼球下沉后取出。經(jīng)OCT包埋后在恒冷箱切片機（Leica公司）中沿瞳孔視神經(jīng)軸進行切片，片厚20μm，貼片、晾干6 h后將眼球組織切片置入4℃的4%低聚甲醛溶液中固定2 h，按以下步驟進行免疫熒光染色：磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗切片5 min，0．25%TritonX-100溶液37℃孵育1 h，PBS漂洗5 min；用3%牛血清白蛋白溶液37℃封閉1 h。分別用抗炎癥因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）、抗細胞骨架蛋白NF-200、血影蛋白和抗m-calpain的抗體4℃孵育過夜，再37℃孵育1 h，PBS漂洗5 min后分別用Cy3標記的相應第二抗體（1∶300稀釋度）孵育1 h，PBS漂洗5 min，用Hochest33342復染細胞核，PBS漂洗5 min，中性甘油封片。陰性對照用PBS代替第一抗體，其余步驟同上。染色后切片用Leica熒光顯微鏡觀察上述蛋白在視網(wǎng)膜的分布。

1．5 視網(wǎng)膜組織蛋白的提取和免疫印跡檢測

各組大鼠分別用0．3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，摘取眼球，切開眼球壁，剝離視網(wǎng)膜組織，放入含100μL 4℃裂解液的EP管，用超聲粉碎儀于冰浴中粉碎組織，將裂解后的視網(wǎng)膜組織勻漿于4℃離心后吸取上清，與等體積2×電泳上樣緩沖液混勻后煮沸5 min，使蛋白變性，－70℃凍存?zhèn)溆?。常?guī)配置8%聚丙烯酰胺凝膠，以每泳道10μL等體積上樣，電泳并轉(zhuǎn)膜。用脫脂奶粉溶液封閉已轉(zhuǎn)印蛋白的PVDF膜1 h。分別用抗NF-200、血影蛋白和抗m-calpain抗體（1∶200）室溫孵育2 h，同時用GAPDH抗體（1∶200）孵育，以顯示內(nèi)參條帶；再用HRP標記的相應第二抗體（1∶5 000），室溫孵育1 h，用ECL增強發(fā)光劑顯示蛋白條帶，用Typhoon 9400分子成像系統(tǒng)（美國通用公司）掃描，保存圖片。測定目的蛋白免疫印跡條帶的光密度值。NF-200和血影蛋白降解產(chǎn)物以及活性m-calpain的相對含量用小分子質(zhì)量蛋白條帶的光密度值與大分子質(zhì)量蛋白條帶的光密度值比值的均數(shù)表示。

1．6 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13．0統(tǒng)計軟件，對各組大鼠視網(wǎng)膜組織內(nèi)目的蛋白的小分子質(zhì)量蛋白條帶的光密度值與大分子質(zhì)量蛋白條帶的光密度值比值進行配對t檢驗，分析各組間、組內(nèi)的NF-200和血影蛋白降解產(chǎn)物以及活性m-calpain的相對含量差異，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2．1 視網(wǎng)膜組織切片的免疫熒光染色結(jié)果

正常對照組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)層次清楚，IL-1β、IL-6和TNF-α免疫熒光很弱。角膜穿通傷后24、48和72 h組的視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)免疫熒光表達存在差異，其中變化明顯的時間段為損傷后48 h。角膜穿通傷后48 h，IL-1β、IL-6和TNF-α免疫熒光明顯增強，主要分布在雙極細胞層、節(jié)細胞層和視神經(jīng)纖維層；IL-10治療后，IL-1β、IL-6和TNF-α免疫熒光明顯減弱（圖1）。在正常對照組，NF-200和血影蛋白免疫熒光染色可清晰顯示視神經(jīng)纖維層的陽性神經(jīng)纖維，m-calpain免疫熒光很弱；角膜穿通傷后48 h，NF-200和血影蛋白免疫熒光染色顯示陽性神經(jīng)纖維明顯減少，m-calpain免疫熒光明顯增強；IL-10治療后，NF-200和血影蛋白陽性神經(jīng)纖維明顯多于損傷組，m-calpain免疫熒光較損傷組減弱（圖2）。

2．2 免疫印跡檢測結(jié)果

在損傷組，視網(wǎng)膜組織內(nèi)大分子質(zhì)量的NF-200和血影蛋白含量逐漸減少，其小分子質(zhì)量的降解產(chǎn)物以及小分子質(zhì)量的活性m-calpain逐漸增加；在IL-10治療組，NF-200和血影蛋白的降解產(chǎn)物以及活性m-calpain的增加程度明顯減輕（圖3）。

統(tǒng)計學處理結(jié)果表明，IL-10治療組的小分子NF-200（表1）和血影蛋白（表2）降解產(chǎn)物以及活性m-calpain（表3）的相對含量明顯低于損傷組（P＜0．05）。我們前期的實驗已觀察過對照組與損傷組間的蛋白表達存在差異［2］，故本文只列出損傷組與治療組間蛋白表達差異。

表1 大鼠視網(wǎng)膜NF-200降解產(chǎn)物的相對含量n＝5±s

24 h 48 h 72 h損傷組組別1．35±0．15 1．57±0．18 5．17±0．53治療組 0．75±0．07 1．15±0．13 1．87±0．18 t值8．10 4．23 13．18 P值 ＜0．05 ＜0．05 ＜0．05

表2 血影蛋白降解產(chǎn)物的相對含量 n＝5，±s

24 h 48 h 72 h損傷組5．15±0．65 8．71±0．85 13．57±1．35治療組 1．95±0．21 5．15±0．47 7．19±0．75 t值10．40 8．19 9．24 P值 ＜0．05 ＜0．05 ＜0．05組別

表3 大鼠視網(wǎng)膜活性鈣蛋白酶2相對含量n＝5，±s

24 h 48 h 72 h損傷組組別2．15±0．15 2．75±0．19 3．55±0．33治療組 1．35±0．11 1．73±0．18 2．19±0．23 t值9．62 8．71 7．56 P值 ＜0．05 ＜0．05 ＜0．05

3 討論

已有研究結(jié)果表明，角膜穿通傷可引起眼球組織的應激反應，刺激組織細胞產(chǎn)生多種炎癥因子，如IL-1β、IL-6和TNF-α等［1］。上述炎癥因子可損傷細胞膜，導致細胞內(nèi)Ca2＋超載，激活鈣依賴性蛋白酶m-calpain［8－9］。激活的m-calpain亦可以促進上述因子的過度表達，從而形成惡性循環(huán)，加重組織損傷［10］。此外，激活的m-calpain可降解神經(jīng)細胞中NF-200和血影蛋白等骨架蛋白，造成神經(jīng)細胞的壞死和神經(jīng)纖維的潰變［11－15］。因此，應用藥物抑制眼球損傷后的眼球壁組織炎癥因子的表達，減輕細胞內(nèi)Ca2＋超載，將可降低m-calpain的活性，減輕NF-200和血影蛋白等骨架蛋白的降解，對視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞和神經(jīng)纖維起到保護作用。

IL-10是一重要的抗炎因子，可抑制促炎因子的產(chǎn)生，發(fā)揮下調(diào)炎癥反應的生物學作用［3］。新近的研究表明，IL-10除了抑制炎癥反應以外，還具有抑制組織損傷后細胞內(nèi)Ca2＋超載的作用，應用IL-10可通過降低鈣蛋白酶和caspases活性，減輕腦缺氧導致的神經(jīng)細胞凋亡［16－18］。IL-10還具有直接的神經(jīng)營養(yǎng)作用和促進神經(jīng)細胞分化和突觸形成的作用［19－20］。本研究利用IL-10的上述抗炎和對神經(jīng)細胞損傷的保護作用，在角膜穿通傷后局部應用IL-10藥液滴眼，以評價其對角膜穿通傷后視網(wǎng)膜炎癥損傷和神經(jīng)潰變的治療效果。實驗結(jié)果表明，角膜穿通傷后，視網(wǎng)膜細胞廣泛表達炎癥因子TNF-α、IL-1β，IL-6和鈣蛋白酶m-calpain，同時NF-200和血影蛋白免疫熒光染色顯示視網(wǎng)膜的陽性神經(jīng)纖維明顯減少，說明角膜穿通傷可導致視網(wǎng)膜炎癥損傷和神經(jīng)纖維的潰變；IL-10治療后，上述炎癥因子和mcalpain免疫熒光明顯減弱，血影蛋白和NF200陽性神經(jīng)纖維明顯多于損傷組。免疫印跡檢測結(jié)果亦顯示IL-10治療后，視網(wǎng)膜組織內(nèi)NF-200和血影蛋白的降解產(chǎn)物以及活性m-calpain相對含量減少。

綜上所述，IL-10可抑制角膜穿通傷導致的視網(wǎng)膜炎癥因子的表達，降低m-calpain的活性，減輕NF-200和血影蛋白的降解，防止視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞的壞死和神經(jīng)纖維的潰變。本研究結(jié)果為臨床應用IL-10治療角膜穿通傷導致的繼發(fā)性視網(wǎng)膜損傷提供了實驗和理論依據(jù)。

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Topical application of IL-10 inhibits inflammation and reduces neural degeneration of the retina after corneal penetrating injury in rats

HUANG Yan1，ZHOU Yue-peng2，XIAO Shou-hua1，ZHANG Zhi-jian3
（1．Department of Ophthalmology，2．Department of Laboratory，the Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001；3．School of Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

Objective：To investigate the mechanisms of that IL-10 inhibits inflammation and reduces neural degeneration of the retina after corneal penetrating injury in rats．M ethods：A total of 50 adult female ratswere randomly divided into three groups：A，the normal control group（8 rats）；B，the corneal penetrating injury group（21 rats）；and C，the IL-10 treated group（21 rats）．B and C groupswere subdivided into the subgroups suffered from corneal penetrating injury for 24 hours，48 hours and 72 hours，respectively．The animals of C group suffered from corneal penetrating injury and then were treated with topical application of IL-10．Two rats in each group were used tomake tissue sections of eyeball．The sections were immunofluorescence stained with antibodies against IL-1β，IL-6，TNF-α，neurofilament protein-200（NF200），α-Ⅱspectrin and m-calpain．The relative contents of activated m-calpain and the degradationproducts of NF200 andα-Ⅱspectrin of the retina tissueswere detected by western blotting．Results：The immunofluorescence staining of IL-1β，IL-6，TNF-αand m-calpain in normal retina were very weak，and became stronger in the retina of corneal penetrating injury groups．After treated with IL-10，the intensity of immunofluorescence staining of IL-1β，IL-6，TNF-αand m-calpain reduced．The immunofluorescence staining of NF200 andα-Ⅱspectrin wereweaker in the corneal penetrating injury group than those in the normal group；after treated with IL-10，the intensity of immunofluorescence staining of NF200 andα-Ⅱspectrin became stronger than those in the corneal penetrating injury group．Western blotting showed that the relative contents of activated m-calpain and the degradation products of NF200 andα-Ⅱspectrin of the retina tissues in IL-10 treated group were lower than those in the corneal penetrating injury group．Conclusion：The expressions of IL-1β，IL-6 and TNF-αwere up-regulated after corneal penetrating injury and then activate them-calpain localized in retinal tissues．The activatem-calpian could degrade the cytoskeleton proteins NF200 andα-Ⅱspectrin leading to nerve degeneration of retina；treatmentwith topical application of IL-10 could reduce the expressions of IL-1β，IL-6 and TNF-αand inhibit the activity ofm-calpian，which protect the animals from nerve degeneration of the retina after corneal penetrating injury．

corneal penetrating injury；retina；inflammation；neural degeneration；IL-10；rat

R774．1

A

1671－7783（2014）06－0461－05

10．13312／j．issn．1671-7783．y140269

江蘇大學臨床醫(yī)學科技發(fā)展基金資助項目（JLY2010146）

黃燕（1972—），女，江蘇鎮(zhèn)江人，主治醫(yī)師，主要從事眼科疾病臨床研究；肖壽華（通訊作者），主任醫(yī)師，E-mail：0511syj＠163．com

2014－09－21 ［編輯］ 陳海林