姚逸正，王華，倪穎，沈以新，徐馳，孫鳳英，邵世和

（江蘇大學醫(yī)學院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

幽門螺桿菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)cag Q基因缺失株的構(gòu)建與鑒定

姚逸正，王華，倪穎，沈以新，徐馳，孫鳳英，邵世和

（江蘇大學醫(yī)學院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

目的：構(gòu)建幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，H．pylori）Ⅳ型分泌系統(tǒng)cag Q基因缺失株。方法：通過PCR擴增出cag Q基因編碼區(qū)側(cè)翼同源臂序列，經(jīng)TA克隆后進行雙酶切，并將純化后上下游同源臂連接至兩端含有卡那霉素抗生素基因的載體pBluscriptSK II（-），構(gòu)建為cag Q基因自殺質(zhì)粒。利用電穿孔法將自殺質(zhì)粒導入H．pylori，進行同源重組。培養(yǎng)后通過卡那霉素抗生素篩選出基因缺失株，并經(jīng)PCR及核酸序列分析進一步確定基因缺失株。結(jié)果：H．pylori的cag Q基因自殺質(zhì)粒pBlueKM40-△cag Q經(jīng)酶切驗證無誤，進行電轉(zhuǎn)化后經(jīng)PCR及核酸序列分析結(jié)果正確。結(jié)論：成功獲得H．pylori cag Q基因缺失株，命名為Hp26695-△cag Q。

幽門螺桿菌；Ⅳ型分泌系統(tǒng)；cag Q；基因缺失株

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 菌株與質(zhì)粒 H．pylori 26695、大腸埃希菌DH5α為本學院中心實驗室保存；pMD18-T載體購自TaKaRa公司；H．pylori自殺質(zhì)粒pBlueKM40［含卡那霉素抗性基因盒的pBluescriptSK（-）載體］由韓國慶尚大學Seung-chulBaik教授饋贈。

1．1．2 實驗儀器 PCR儀（Applied Biosystems公司）；化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（Syngene公司）；高速離心機（Eppendorf公司）；超微量分光光度儀、恒溫CO2培養(yǎng)箱（Thermo公司）；恒溫水浴箱（上海醫(yī)療器械公司）；恒溫培養(yǎng)搖床（上海福瑪實驗設(shè)備有限公司）；恒溫水浴箱（上海醫(yī)療器械公司）；電擊轉(zhuǎn)化儀（Bio-Rad公司）；瓊脂糖凝膠電泳儀（南京馳順科技有限公司）。

1．1．3 主要試劑 哥倫比亞血瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胰蛋白胨、酵母提取物購自O(shè)xoid公司；小牛血清購自杭州四季青生物工程材料生物公司；限制性核酸內(nèi)切酶Eco RⅠ、Bam HⅠ、KpnⅠ、XhoⅠ和T4DNA連接酶購自Thermo公司；DL2000 DNA、1 kb DNA標準參照物、Taq酶、dNTP、10×PCR緩沖液、膠回收試劑盒購自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自Promeg公司；PCR擴增引物由上海英濰捷基生物工程有限公司合成。

1．2 方法

1．2．1 cag Q基因兩側(cè)同源臂的擴增 根據(jù)基因庫中H．pylori26695基因組序列，設(shè)計引物擴增cag Q基因上下游同源臂F1、F2（表1）。圖1中1～381為cag Q基因編碼區(qū)，引物P1、P2用于擴增上游同源臂F1（734 bp），引物P3、P4用于擴增下游同源臂F2（803 bp）。提取H．pylori 26695基因組，進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為94℃5 min，94℃30 s，50℃40 s，72℃50 s，35個循環(huán)，72℃10 min。PCR擴增片段經(jīng)1．5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶染色后進行成像系統(tǒng)分析，然后通過膠回收試劑盒獲得純化的DNA擴增片段，于－20℃保存。

1．2．2 同源臂基因的TA克隆 將鑒定后膠回收純化的上、下游同源臂與pMD18-T載體在T4連接酶作用下，4℃連接過夜。然后將重組質(zhì)粒（F1-pMD18-T、F2-pMD18-T）轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)菌體內(nèi)，均勻涂布于含100μg／mL氨芐西林的固體LB營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)約14～18 h；挑取單克隆菌落至含100μg／mL氨芐西林的液體LB培養(yǎng)基中，37℃200 r／min搖床內(nèi)培養(yǎng)約12 h，抽提質(zhì)粒后進行酶切鑒定。

1．2．3 pBlueKM40-△cag Q自殺質(zhì)粒的構(gòu)建 酶切已連接至pMD18-T載體的上、下游同源臂，膠回收。T4DNA連接酶于16℃連接同源臂與pBlueKM40，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)內(nèi)，均勻涂布于含50μg／mL卡那霉素的固體LB營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37℃溫箱培養(yǎng)16 h；挑取單個菌落至含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，然后提取質(zhì)粒，利用相應(yīng)限制性內(nèi)切酶進行鑒定。

1．2．4 H．pylori cag Q基因缺失株的構(gòu)建與鑒定H．pylori26695菌株按照微需氧環(huán)境培養(yǎng)72 h，刮取哥倫比亞培養(yǎng)基上菌落至3 mL 10%甘油 蔗糖溶液，重懸細菌，4℃4 700 r／min離心5 min；棄上清，加8 mL 10%甘油蔗糖溶液，重懸細菌，4℃4 700 r／min離心5 min（重復(fù)2次）；將沉淀重懸于200μL 10%甘油蔗糖溶液，4℃孵育20 min，然后加入10 μg pBlueKM40-△cag Q自殺質(zhì)粒并混勻，置于冰上或4℃再次孵育20 min，移入冰預(yù)冷的0．2 cm電擊杯，進行電擊。設(shè)定電擊條件：25 F，2．5 kV，200Ω，約5 s。電擊轉(zhuǎn)化后迅速將全部菌液均勻涂布于含50μg／mL卡那霉素的哥倫比亞培養(yǎng)基上，于37℃微需氧條件下培養(yǎng)72 h。

收集cag Q基因缺失株，經(jīng)尿素酶活性檢測和革蘭染色鑒定為H．pylori后，提取細菌基因組，分別以上游同源臂的引物P1和下游同源臂的引物P4作為一對引物進行PCR反應(yīng)，以H．pylori 26695及雙蒸水分別作為陽性、陰性對照。PCR條件：94℃5 min，94℃40 s，55℃40 s，72℃3 min，35個循環(huán)，72℃10 min。PCR擴增片段經(jīng)1．5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶染色后通過凝膠成像系統(tǒng)鑒定。擴增片段送上海英駿生物技術(shù)有限公司進行核酸序列分析。

2 結(jié)果

2．1 制備的cag Q基因同源臂

以H．pylori26695菌株為模板，進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳顯示上游同源臂F1（734 bp）和下游同源臂F2（803 bp），見圖2。膠回收目的片段，得到純化的同源臂PCR產(chǎn)物。

2．2 成功構(gòu)建同源臂F1和F2的TA克隆

將同源臂F1和F2的PCR純化產(chǎn)物分別與pMD18-T載體連接，提取質(zhì)粒，分別經(jīng)KpnⅠ、XhoⅠ和Eco RⅠ、Bam HⅠ雙酶切鑒定，出現(xiàn)上游同源臂F1（734 bp）、下游同源臂F2（803 bp），pMD18-T載體約為2 900 bp，見圖3。結(jié)果表明，成功構(gòu)建F1-pMD18-T、F2-pMD18-T質(zhì)粒。

2．3 pBlueKM40-△cag Q自殺質(zhì)粒的鑒定

構(gòu)建成功的pBlueKM40-△cag Q自殺質(zhì)粒經(jīng)KpnⅠ、XhoⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切后，出現(xiàn)約734 bp片段，即為上游同源臂F1；經(jīng)Eco R、Bam HⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切后，出現(xiàn)約803 bp片段，即為下游同源臂F2；經(jīng)KpnⅠ、Bam HⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切后，出現(xiàn)約2 900 bp片段，即為F1＋Kmr（卡那霉素抗性基因盒）＋F2三者片段和，符合預(yù)期設(shè)計結(jié)果，見圖4。

2．4 H．pylori cag Q基因缺失株的鑒定

PCR擴增結(jié)果顯示，H．pylori 26695出現(xiàn)約1 800 bp擴增片段，缺失株則出現(xiàn)約2 900 bp擴增片段，陰性對照無條帶，見圖5。結(jié)果符合同源重組法的設(shè)計目的，且核酸序列分析結(jié)果無誤，表明成功構(gòu)建Hp26695-△cag Q基因缺失株。

3 討論

H．pylori是人類常見的致病菌之一，呈全球性分布，與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)，WHO將其列為Ⅰ類致癌原［5］。H．pylori的致病因子主要包括細胞毒素相關(guān)基因A蛋白（cytotoxin-associated gene A，CagA）、空泡細胞毒素（vaculating cytotoxin，VacA）等。而Ⅳ型分泌系統(tǒng)的主要功能是將CagA轉(zhuǎn)運至宿主細胞，隨著CagA的磷酸化，進而干擾細胞內(nèi)信號傳導［6－7］，誘導炎癥反應(yīng)及胃癌的產(chǎn)生［8］。然而，關(guān)于該分泌系統(tǒng)的研究較少，其轉(zhuǎn)運機制尚未明確。

近幾年來，國內(nèi)外學者對H．pyloriⅣ型分泌系統(tǒng)的部分蛋白做了相關(guān)研究。CagW、CagT、CagV、CagX和CagY組成跨膜通道橫穿細胞內(nèi)外膜［9－10］；CagW有5或6個跨膜螺旋，與CagV和CagY形成內(nèi)膜復(fù)合體，而CagT和CagX沿著菌毛的長度定植，CagT在菌毛的基部環(huán)形分布，對穩(wěn)定其他蛋白起著重要作用；有報道稱，CagT在CagA轉(zhuǎn)運中起到伴侶蛋白的作用［11］；此外，對CagL、CagF等初步研究表明，CagL不僅與整合素α5β1受體相互作用［12］，也與αVβ3及αVβ5相互聯(lián)系［13－14］，而且其氨基酸的多態(tài)性與胃癌有著密切聯(lián)系［15］；CagF參與CagA蛋白的募集作用［16］。CagG與細菌的黏附和定植密切相關(guān)［17］；有報道指出，CagI作為Ⅳ型分泌系統(tǒng)重要組分［18－19］，同CagA的N端，CagY的C端，均與整合素具有相互作用［20］；CagD可能是一個多功能的Ⅳ型分泌系統(tǒng)蛋白［21］。Olbermann等［22］認為cag Q基因編碼蛋白可能影響H．pylori的分泌，其可能與CagA蛋白相互作用，因為cag Q基因中有兩條遺傳譜系與CagA具有高度同源性。

因此，本研究選擇cag Q基因作為研究對象，利用同源重組原理，通過PCR擴增其編碼區(qū)兩側(cè)翼上、下游同源臂F1（734 bp）、F2（803 bp），然后進行TA克隆，經(jīng)雙酶切后與pBluscriptSKⅡ（-）自殺質(zhì)粒經(jīng)T4連接酶連接。將構(gòu)建成功的自殺質(zhì)粒通過電穿孔法導入H．pylori。培養(yǎng)后經(jīng)過抗性篩選、PCR驗證、核酸序列分析驗證無誤后，確定基因缺失株構(gòu)建成功。目前H．pylori的Ⅳ型分泌系統(tǒng)中仍有很多基因編碼的蛋白質(zhì)（包括cag Q）功能尚不清楚，Hp26695-△cag Q基因缺失株的成功構(gòu)建對于下一步深入研究cag Q在H．pylori致病機制中的作用，如對于cag A蛋白的轉(zhuǎn)運，刺激靶細胞IL-8炎癥因子的分泌，激活NF-κB信號通路等奠定了一定的基礎(chǔ)。

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Construction and identification of cag Q gene-deleted mutant in typeⅣsecretion system of H．pylori

YAO Yi-zheng，WANG Hua，NIYing，SHEN Yi-xin，XU Chi，SUN Feng-ying，SHAO Shi-he
（School of Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

Objective：To construct the cag Q gene-deleted mutant of Helicobacter pylori（H．pylori）M ethods：Polymerase chain reaction（PCR）was used to amplify the homologous gene fragments（upstream and downstream of the openreading frames）of cag Q gene．The homologous gene fragmentswere connected to pMD18-T vector and the fragmentswere cut down by restriction enzyme．Then the homologous fragments were inserted into the pBluescript SK II（-）which includes kanamycin resistance gene．The suicide plasmid pBlueKM40-△cag Q was transferred into H．p ylori through electroporation．The complete recombinant strain grown on agar plates supplemented with kanamycin was selected by PCR and confirmed through sequences analysis．Results：The suicide plasmid pBlueKM40-△cagQ was identified by restriction enzyme digestion and was transferred into H．pylori．The result of the gene-deleted mutantwas confirmed through PCR and sequencing．Conclusion：We generated the cag Q gene-deleted mutant of H．pylori（Hp26695-△cag Q）．

Helicobacter pylori；typeⅣsecretion system；cag Q；gene-deleted mutant

姚逸正（1990—），男，碩士研究生；邵世和（通訊作者），教授，博士生導師，E-mail：shaoshihe2006＠163．com

R378．99

A

1671－7783（2014）06－0487－04

10．13312／j．issn．1671-7783．y140238

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，H．pylori）是一類微需氧、革蘭染色陰性螺桿菌，主要定植于人胃黏膜表面及十二指腸球部［1］，全球感染率達50%，慢性感染常導致胃炎，甚至胃十二指腸潰瘍、胃癌［2］。H．pylori中含有長度約40 kb的基因片段，即cag致病島（cytotoxin-associated gene-pathogenicity island，cag PAI），其部分編碼蛋白組成Ⅳ型分泌系統(tǒng)，后者由29條肽鏈組成［3］。然而目前對于Ⅳ型分泌系統(tǒng)的cag Q基因功能研究甚少，生物信息學預(yù)測其為膜相關(guān)蛋白［4］。

本文以cag PAI編碼基因cag Q為研究對象，構(gòu)建其基因敲除自殺質(zhì)粒，獲得了cag Q基因缺失株，并利用同源重組方法獲得了H．pylori的cag Q基因缺失株，現(xiàn)報告如下。

江蘇省自然科學基金青年基金資助項目（BK20130542）；江蘇省科技創(chuàng)新與成果轉(zhuǎn)化（生命健康科技）專項基金資助項目（BL2012047）；高等學校博士學科點專項科研基金資助項目（20123227110008）

2014－09－02 ［編輯］ 劉星星