徐煒，單秀紅，胡慧，諶業(yè)榮，陳建華，丁國(guó)文，范鈺，王亞非

（江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院1．影像科，2．病理科，3．胸外科，4．腫瘤科，江蘇鎮(zhèn)江212002）

CT定量反映非小細(xì)胞肺癌組織缺血壞死程度與葡萄糖代謝水平

徐煒1，單秀紅1，胡慧1，諶業(yè)榮1，陳建華2，丁國(guó)文3，范鈺4，王亞非1

（江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院1．影像科，2．病理科，3．胸外科，4．腫瘤科，江蘇鎮(zhèn)江212002）

目的：評(píng)價(jià)CT定量反映非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）組織缺血壞死程度及葡萄糖代謝水平的可行性。方法：選擇52例NSCLC患者，測(cè)量患者術(shù)前早期增強(qiáng)CT圖像上病灶的缺血壞死CT定量值（ischemia necrosis CT quantitative value，INCTQ）；免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)患者術(shù)后肺癌組織標(biāo)本中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（glucose transporter 1，Glut1）和碳酸酐酶Ⅸ蛋白的表達(dá)。結(jié)果：52例中，Glut 1表達(dá)0級(jí)、1級(jí)和2級(jí)的INCTQ分別為0．35±0．23、0．52±0．55和1．55±1．20，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝10．633，P＝0．000）；Glut1和碳酸酐酶Ⅸ無(wú)表達(dá)組、單表達(dá)組和共表達(dá)組的INCTQ分別為0．32±0．25、0．85±0．83和1．37±1．27，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝4．449，P＝0．017）。結(jié)論：NSCLC早期增強(qiáng)CT能較為準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)NSCLC的缺血壞死程度和葡萄糖代謝水平。

非小細(xì)胞肺癌；葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1；碳酸酐酶Ⅸ；X線(xiàn)計(jì)算機(jī)體層攝影術(shù)；缺血壞死

腫瘤細(xì)胞在惡變過(guò)程中最基礎(chǔ)的代謝改變是糖酵解增強(qiáng)［1］。該現(xiàn)象是由于腫瘤生長(zhǎng)速度過(guò)快，超過(guò)了腫瘤血管新生的速度，腫瘤細(xì)胞缺氧所致；腫瘤細(xì)胞通過(guò)缺氧誘導(dǎo)因子（HIF-1）表達(dá)增加，一方面促進(jìn)腫瘤血管生成［2］，另一方面促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（glucose transporter protein 1，Glut1）表達(dá)，增加葡萄糖攝取，進(jìn)行有氧氧化或無(wú)氧酵解，既能提供自身所需的ATP，又能利用糖酵解的中間產(chǎn)物進(jìn)行生物合成［3］。Airley等［4］發(fā)現(xiàn)，在包括非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）在內(nèi)的多種腫瘤組織標(biāo)本中，Glut 1主要在缺血壞死區(qū)周?chē)弑磉_(dá)，為腫瘤組織壞死標(biāo)志物。文獻(xiàn)報(bào)道，Glut 1在NSCLC組織中陽(yáng)性表達(dá)率達(dá)81．4%，其中鱗癌陽(yáng)性表達(dá)率為100%，而且分期越晚，強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率越高［5］，與預(yù)后密切相關(guān)。碳酸酐酶是含鋅金屬酶，具有調(diào)節(jié)體液pH的作用，參與體內(nèi)酸堿平衡調(diào)節(jié)及離子交換等過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，碳酸酐酶Ⅸ主要在腫瘤壞死區(qū)周?chē)磉_(dá)［6］，為腫瘤組織壞死的另一生物標(biāo)志物。早期增強(qiáng)CT可反映腫瘤的血管生成水平，但作為腫瘤的另一重要特征性表現(xiàn)——腫瘤組織的代謝水平能否被早期增強(qiáng)CT所反映，目前相關(guān)報(bào)道不多。CT成像密度分辨率高，根據(jù)其早期增強(qiáng)圖像能夠區(qū)分缺血壞死區(qū)，本研究擬通過(guò)早期增強(qiáng)CT對(duì)NSCLC病灶的缺血壞死區(qū)進(jìn)行密度和面積的定量，探討其與缺血壞死生物標(biāo)志物表達(dá)水平的關(guān)系。

1 材料與方法

1．1 病例

收集江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院2010年12月至2013年5月，術(shù)前經(jīng)本院CT檢查的52例NSCLC病例，年齡39～87歲，平均61．6歲，男36例，女16例。其中，鱗狀細(xì)胞癌18例，腺癌31例，腺鱗癌3例。圖像存儲(chǔ)和傳輸系統(tǒng)（PACS）保存有完整的CT圖像資料，病理科有完整的石蠟包埋肺癌組織標(biāo)本。

1．2 設(shè)備、材料及數(shù)據(jù)采集方法

CT系統(tǒng)型號(hào)為西門(mén)子Sensation 64層CT和PHILIPSBrilliance iCT 256層螺旋極速CT機(jī)；碘海醇注射液（碘含量300 mg／mL）為對(duì)比劑；兔抗人Glut1多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Bioworld公司，兔抗人碳酸酐酶Ⅸ抗體購(gòu)自美國(guó)芝加哥Proteintech公司，抗體鏈霉抗生物素蛋白、過(guò)氧化物酶及二抗均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。病理組織石蠟切片機(jī)、切片攤片機(jī)、切片烤片機(jī)（常州中威電子儀器廠(chǎng)），電熱恒溫水浴箱（美國(guó)Pharmacia公司），CX41型光學(xué)顯微鏡、PX53型熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司），病理圖像分析系統(tǒng)（金仕達(dá)衛(wèi)寧軟件股份有限公司）。

胸部CT掃描及重建方案：120 kV，120 mAs；胸部平掃，依照1．5 mL／kg的劑量肘靜脈注射碘海醇，速率為3mL／s，延遲35 s全胸部掃描，2次序列容積數(shù)據(jù)采集層厚為0．5 mm或0．625 mm，軸位、冠狀位及矢狀位3 mm層厚縱隔模式重建增強(qiáng)序列的病灶層面。

缺血壞死CT定量值（ischemia necrosis CT quantitative value，INCTQ）測(cè)量：分別顯示增強(qiáng)序列的3 mm層厚的軸位、冠狀位和矢狀位的病灶最大層面，顯示窗位／窗寬為50／250，測(cè)量3層面密度明顯較低區(qū)（缺血壞死區(qū)）的面積（SN）和CT值（HN）、其他非缺血壞死區(qū)的面積（SC）和CT值（HC）（圖1），腫瘤病灶I(lǐng)NCTQ值按如下公式計(jì)算：（HC÷HN）×（SN÷SC）。由3位主治以上影像科醫(yī)師分別獨(dú)立測(cè)量，取所得數(shù)據(jù)的平均值。

1．3 免疫組織化學(xué)試劑及染色計(jì)數(shù)方法

采用EnVision兩步法對(duì)組織標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，簡(jiǎn)要步驟如下：肺癌組織石蠟切片3 μm，二甲苯浸泡15 min，梯度乙醇由高到低（無(wú)水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇）分別浸泡1min，自來(lái)水漂洗，H2O2泡10 min，自來(lái)水漂洗后浸泡于檸檬酸鹽緩沖液中；4℃過(guò)夜，自來(lái)水洗，PBS洗，加一抗后4℃孵育12 h；PBS洗，加二抗，37℃孵育30 min；PBS洗，DAB顯色4 s，自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染，自來(lái)水洗，1%鹽酸乙醇泡2 s，自來(lái)水洗，梯度乙醇由低到高（80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、無(wú)水乙醇）分別浸泡2 min，切片風(fēng)干后用中性樹(shù)膠封片。

Glut1和碳酸酐酶Ⅸ表達(dá)等級(jí)記錄：腫瘤細(xì)胞膜呈棕黃色為表達(dá)陽(yáng)性（含或不含胞質(zhì)染色）。Glut 1和碳酸酐酶Ⅸ表達(dá)及記錄方法：根據(jù)腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)數(shù)的百分比分為0～2級(jí)。在10×10視野下連續(xù)觀察整個(gè)切片，腫瘤細(xì)胞沒(méi)有染色為0級(jí)，≤20%為1級(jí)，＞20%為2級(jí)。

1．4 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS 17．0統(tǒng)計(jì)軟件，采用單因素方差分析比較不同Glut 1和碳酸酐酶Ⅸ表達(dá)級(jí)別的INCTQ，如方差齊性檢驗(yàn)顯示方差不齊，則進(jìn)行對(duì)數(shù)矯正，達(dá)到方差齊性后再行單因素方差分析，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 NSCLC組織中Glut1表達(dá)

Glut1陽(yáng)性表達(dá)的腫瘤細(xì)胞主要分布在壞死區(qū)周?chē)臀⒀芟∩賲^(qū)，陽(yáng)性表達(dá)率為71．2%（37／52），其中表達(dá)0、1和2級(jí)分別為15、13和24例。

2．2 NSCLC組織中碳酸酐酶Ⅸ表達(dá)

碳酸酐酶Ⅸ陽(yáng)性表達(dá)的腫瘤細(xì)胞主要分布在壞死區(qū)周?chē)?，?yáng)性表達(dá)率為48．1%（25／52），其中表達(dá)0、1和2級(jí)分別為27、12和13例。

2．3 INCTQ與Glut1表達(dá)的關(guān)系

Glut1表達(dá)0級(jí)、1級(jí)和2級(jí)者相應(yīng)的INCTQ分別為0．35±0．23、0．52±0．55和1．55±1．20，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝10．633，P＝0．000），表明肺癌組織INCTQ越高，Glut1表達(dá)水平越高。見(jiàn)圖2。

2．4 INCTQ與碳酸酐酶Ⅸ表達(dá)的關(guān)系

52例NSCLC組織中，碳酸酐酶Ⅸ表達(dá)0級(jí)、1級(jí)和2級(jí)者相應(yīng)的INCTQ分別為0．69±0．77、1．10±1．27和1．34±1．18，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝1．980，P＝0．149），表明肺癌組織INCTQ高低與碳酸酐酶Ⅸ表達(dá)水平無(wú)明顯相關(guān)性。見(jiàn)圖3。

2．5 INCTQ與Glut1和碳酸酐酶Ⅸ共表達(dá)的關(guān)系

52例NSCLC組織中，11例Glut 1和碳酸酐酶Ⅸ表達(dá)均呈陰性（無(wú)表達(dá)組），20例Glut1或碳酸酐酶Ⅸ表達(dá)呈陽(yáng)性（單表達(dá)組），21例Glut1和碳酸酐酶Ⅸ表達(dá)均呈陽(yáng)性（共表達(dá)組）。3組INCTQ分別為0．32±0．25，0．85±0．83，1．37±1．27（F＝4．449，P＝0．017），說(shuō)明這兩種壞死標(biāo)志物不表達(dá)時(shí)，壞死不明顯；共表達(dá)時(shí)，壞死程度明顯。見(jiàn)圖3。

3 討論

壞死是惡性腫瘤的特征之一，由于惡性腫瘤生長(zhǎng)過(guò)快，超過(guò)了其新生血管提供營(yíng)養(yǎng)的范圍，缺血區(qū)發(fā)生缺氧、壞死，如無(wú)明顯液化，平掃CT則難以分辨，而早期增強(qiáng)CT圖像則能很好地顯示。因此，本課題組利用延遲35 s的CT增強(qiáng)圖像顯示來(lái)測(cè)量肺癌病灶的缺血壞死區(qū)。本課題組前期對(duì)乳腺癌的INCTQ與壞死標(biāo)志物的關(guān)系進(jìn)行探討發(fā)現(xiàn)，CT反映的壞死程度與缺血和壞死標(biāo)志物的表達(dá)有一定聯(lián)系［7］，本研究進(jìn)一步推廣至NSCLC的研究。

用CT評(píng)價(jià)肺癌病灶的缺血壞死程度，首先要考慮到缺血壞死區(qū)與非缺血壞死區(qū)的密度差別程度，密度越低，說(shuō)明缺血壞死越重；其次要考慮到缺血壞死區(qū)的面積，面積越大表明缺血壞死越重。因此，我們應(yīng)用肺癌病灶的缺血壞死CT定量公式反映病灶內(nèi)缺血壞死區(qū)面積和密度下降程度，較為客觀全面。Ganeshan等［8］用專(zhuān)業(yè)組織質(zhì)地分析軟件檢測(cè)平掃NSCLC病灶密度的混雜程度，該混雜程度反映NSCLC病灶的高細(xì)胞密度、壞死、出血以及黏液變，研究顯示NSCLC組織高混雜程度與組織內(nèi)Glut1表達(dá)密切相關(guān)，即反映了組織葡萄糖代謝水平的高低。

本研究結(jié)果顯示，NSCLC的INCTQ與Glut 1表達(dá)相關(guān)，而與碳酸酐酶Ⅸ表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)；但與Glut 1和碳酸酐酶Ⅸ共表達(dá)的關(guān)系顯示，共表達(dá)組INCTQ最高，無(wú)表達(dá)組最低。由此說(shuō)明，在肺癌的早期CT增強(qiáng)圖像上測(cè)量缺血壞死程度較為準(zhǔn)確，并且能反映NSCLC組織葡萄糖代謝水平的高低，對(duì)中晚期肺癌而言，可無(wú)創(chuàng)地提示個(gè)體對(duì)放化療的敏感性程度，指導(dǎo)臨床制定合理的綜合治療計(jì)劃，提高中晚期肺癌的療效。

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CT quantitative analysis reflects the degree of ischem ic necrosis and the level of glucosemetabolism of non-small cell lung cancer

XUWei1，SHAN Xiu-hong1，HU Hui1，CHEN Ye-rong1，CHEN Jian-hua2，DINGGuo-wen3，F(xiàn)AN Yu4，WANG Ya-fei1
（1．Department of Radiology，2．Department of Pathology，3．Department of Thoracic Surgery，4．Department of Oncology，Affiliated People′s Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212002，China）

Objective：To evaluate the feasibility of CT quantitative analysis reflecting the degree of ischemic necrosis and glucosemetabolism level of non-small cell lung cancer（NSCLC）．M ethods：Fifty-two caseswith NSCLC were enrolled in the study，the ischemia necrosis CT quantitative value（INCTQ）for NSCLC tumor on early enhancement CT images before surgery weremeasured．Glucose transporter 1（Glut 1）and carbonic anhydraseⅨ（CAⅨ）protein expression with paraffin embedded specimen after operation were detected by immunohistochemical staining．Results：The INCTQ values of expression of Glut1-negative，grade 1 and grade 2 were 0．35±0．23，0．52±0．55 and 1．55±1．20，respectively（F＝10．633，P＝0．000）；the INCTQ values of the Glut1 and CA IX non-expression group，single expression group and co-expression group were 0．32±0．25，0．85±0．83 and 1．37±1．27，respectively（F＝4．449，P＝0．017）．Conclusion：The early enhancement CT could be used to appraise the ischemia necrosis degree，and reflect the level of glucosemetabolism of NSCLC．

non-small cell lung cancer；glucose transporter protein 1；carbonic anhydraseⅨ；X-ray computed tomography；ischemia necrosis

R977．3

A

1671－7783（2014）06－0470－04

10．13312／j．issn．1671-7783．y140137

徐煒（1982—），男，碩士研究生；單秀紅（通訊作者），副教授，博士，E-mail：13913433095＠163．com

2014－04－13 ［編輯］ 劉星星