王 剛 董言德 趙彤言

(軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所， 病原微生物生物安全國家重點實驗室，北京 100071)

物種鑒定是認識和描述生物多樣性的基礎，是人類認識自然的第一步。因此，無論是在生物利用或防治、生物多樣性的保護，以及生態(tài)系統(tǒng)的維系，正確認識和區(qū)分物種都有著重要的理論和現(xiàn)實意義。

目前物種鑒定都是以經(jīng)典的形態(tài)特征為主要依據(jù)，然而形態(tài)鑒定有兩個方面的局限(肖金花等,2004)，第一是形態(tài)學分類方法本身固有的缺陷，如表型可塑性、遺傳可變性、隱存分類單元的存在以及受生物性別和發(fā)育階段的限制等，容易導致不正確的鑒定；第二是分類學家識別能力以及數(shù)量的局限，使形態(tài)分類學的發(fā)展面臨巨大的挑戰(zhàn)。因此，目前最有前途的方法之一是利用分子標記，而不是形態(tài)數(shù)據(jù)識別物種，這長期以來一直是許多生物學家的研究目標(Busseetal.,1996; Blaxter,2003)。DNA測序技術的進展使研究人員通過快速的DNA分析，讓生物多樣性的研究更為簡單和高效。同時，生物技術的迅猛發(fā)展，以及目前形態(tài)分類所面臨的危機，推動了DNA條形碼的產(chǎn)生。

1 DNA條形碼概述

Tautz等人首先提出要用DNA序列作為生物分類系統(tǒng)的主要平臺(即DNA Taxonomy)(Tautzetal.,2002; Tautzetal.,2003)，隨后Paul Hebert于2003年首次提出利用來源于線粒體細胞色素C氧化酶亞基I(Cytochrome C oxidase subunit I，COⅠ)基因前半部分的一段包含650 bp的這一特定區(qū)段來做DNA條形碼的基礎，期待給所有生物種進行編碼(Remigioetal.,2003; Hebertetal.,2003a; Hebertetal.,2003b)，并將其取名為“DNA條形碼”。2004年，正式成立的生命條形碼協(xié)會(CBOL)，旨在開發(fā)一套標準的DNA條形碼制備方法和構建一個全面的DNA條形碼庫。最近，生命條碼項目進入一個新的階段，推出國際生命條碼項目(iBOL)。iBOL是一個由26個國家和地區(qū)組成的國際合作項目，旨在建立一種基于所有真核生物DNA條形碼文庫的自動識別系統(tǒng)。截至2012年9月，BOLD數(shù)據(jù)庫已經(jīng)有2 410 651個標本記錄，1 737 588個標本的DNA條形碼記錄，160 117個物種的DNA條形碼記錄，包括了動物界、真菌界、植物界、原生生物界的物種，最終目標是為全球生物鑒定活動提供數(shù)據(jù)支持與服務。

2 DNA條形碼在物種鑒定中的優(yōu)勢

DNA條形碼作為一個行之有效的生物鑒定手段，與現(xiàn)有的物種識別方法比較有以下優(yōu)勢：(1) DNA條形碼可用于所檢測對象的任何生命周期。同種生物的DNA序列信息在不同的生命周期是相同的，DNA序列不會在個體發(fā)育過程中改變，所以此技術可檢測生物生命周期中的每一時期，如成蟲、幼蟲、蟲卵等。擴大了樣本檢測的范圍。(2) DNA條形碼可用于所檢測對象的任何組織材料。同一個體或同種生物不同個體的不同組織材料的同源DNA擁有一致的序列信息。(3) 非專家鑒定。由于DNA技術是可機械重復的，可設計一套簡單實驗技術。(4) 準確性高。形態(tài)鑒別特征常有的變異和趨同會導致無害與有害物種間的誤差鑒定，而特定的物種具有特定的DNA片段信息。(5) 迅速、大量?？赏ㄟ^，利用建立的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫、網(wǎng)絡傳輸、試劑盒、基層的分子生物實驗室等，一次性大量、快速地鑒定樣本。(6) 對于世界范圍內(nèi)面臨的缺乏合格分類學家的問題，通過DNA條形碼鑒定技術的運用可以得到大大的緩解。條形碼數(shù)據(jù)庫一旦建立起來，將成為永久性資料，分類學家新的研究成果將不斷地加入數(shù)據(jù)庫，使數(shù)據(jù)庫趨于完善。另外，這項技術本身的發(fā)展，要求一系列更快、更好、更廉價技術的產(chǎn)生，這勢必會推動相關的分子生物學技術的進步，從而讓其他相關的生物科學受益。再者，一旦解決了鑒定的問題，將給構建系統(tǒng)發(fā)育樹提供足夠可靠的信息，從而推進生物進化歷史研究。

3 DNA條形碼與分類學

分子標記在分類中的應用，包括DNA條碼技術，存在有相當多的爭議。主要有以下兩個問題：物種鑒定及物種的發(fā)現(xiàn)。

使用條形碼進行的物種鑒定，取決于包括每一個代表物種的數(shù)據(jù)庫。獲得一個能準確地反映一個物種DNA條形碼的最可靠的方法，是基于該物種的模式標本。Brown等(2003)首次使用正模標本(holotype)的DNA條形碼描述新物種：Xenothictis(鱗翅目：卷蛾科)。自此，許多無論節(jié)肢動物或是其他動物類群的新物種，都通過其正模或副模標本(paratype)的DNA條形碼被描述和保存(Burnsetal.,2007a; Bortolus,2008; Dabertetal.,2008; Vagliaetal.,2008; Yassinetal.,2008; Yoshitakeetal.,2008; Adamskietal.,2009)。

與此相反，物種發(fā)現(xiàn)被定義為將一簇個體或/和一個類群辨認為一個單一物種的分類學過程。DNA條形碼能加快物種發(fā)現(xiàn)的進程。首先，DNA條形碼可用于隱藏種的識別(Hebertetal.,2004b; Burnsetal.,2007b)。其次，DNA條形碼信息有助于分類全部相關類群的標本，尤其是對于一些研究不足的類群(Smithetal.,2012)。

然而，DNA條形碼不能檢測到所有未描述的潛在物種，尤其是最近分化的類群。另外，應該指出的是，DNA條形碼本身僅是提示而并不能提供足夠的信息將未知樣本界定為潛在的新物種(Wittetal.,2006; Burnsetal.,2007b; Brownetal.,2003)，新物種的描述需要結合其他重要信息，如地理分布、生態(tài)信息、生理結構等。

4 影響DNA條形碼識別準確性的因素

4.1 雜交和基因滲入

通過線粒體基因解決全部物種的分類關系是不可能的。比如，由于基因滲入或者雜交而使物種的邊界顯得模糊不清，因此需要同時聯(lián)合分析線粒體及核內(nèi)基因。另外，當物種新近起源于多倍體化，就需要更多基因組尺度上分析；盡管該技術已比較成熟，但是極少被應用，因為在絕大多數(shù)動物類群中，存在雜交、多倍體化和線粒體基因滲入的個體不到1%。在用mtDNA條形碼對物種進行鑒定的時候，種間mtDNA的重組也是考慮因素之一。盡管線粒體基因的種間重組可能會增加種內(nèi)mtDNA的多樣性，但是鑒于種間雜交后下一代生存力和生殖力的降低，這種多樣性的增加也不會太明顯(Ciborowskietal.,2007)。

然而，原麗蠅屬受Wolbachia菌感染后出現(xiàn)的細胞質(zhì)不親和(Cytoplasmic Incompatibility,CI)，使得群體間的基因多樣性降低，從而導致用DNA條形碼技術對原麗蠅屬進行鑒定時，正確鑒定的成功率僅僅為40%，甚至其中4個物種擁有相同的條形碼。如果說原麗蠅屬的這種情況不是例外的話，鑒于Wolbachia在昆蟲界的感染率為15%～75%，這將導致基于線粒體條形碼技術在對昆蟲的種的鑒定上出現(xiàn)問題。不過，因為與Wolbachia相關的mtDNA的基因滲入現(xiàn)象僅僅存在于親緣關系非常近的物種之間，所以對昆蟲種以上的分類單元的鑒定是不受影響的(Whitworthetal.,2007)。

4.2 新近起源物種

用條形碼對物種進行成功的鑒定依賴于物種種內(nèi)的遺傳差異要顯著的低于種間的(Hebertetal.,2004b)。基因條形碼鑒定的成功率因種而異。特別是那些年輕的物種、有效種群較大的種用基因條形碼進行成功鑒定就相對比較困難，比如大多熱帶昆蟲就是這樣(Eliasetal.,2007)。

4.3 分子進化速率差異

由于譜系分子進化速率不一致會導致二次突變的存在，此時，在這種類群中很難鑒定出進化速率慢的物種。不過，超過98%的物種堿基對的差異都大于2%，除了腔腸動物以外，大部分同屬物種的堿基序列都顯示出足夠的差異來保證物種的區(qū)分。事實上，500 bp COⅠ基因中的50多個堿基對差異就能產(chǎn)生平均11.3%的堿基序列的差異。而對于某些屬內(nèi)種間低于2%的堿基序列差異，也許反映了短期的生殖隔離(Hebertetal.,2003b)。

在大多數(shù)動物類群中COl基因的進化速率比較慢，Hebert利用鱗翅目的序列數(shù)據(jù)分析結果表明，同屬各種COl序列的平均差異程度是11.3%，而種內(nèi)的COⅠ序列差異程度通常都很低，低于2%，因此不妨礙物種鑒定。對于種內(nèi)的物種鑒定，首先，種內(nèi)差異很少能超過2%，大部分低于1%。其次，當出現(xiàn)稍大的差異時，這些變種通常因為地理隔離產(chǎn)生，也僅僅反映了它們起源于過去由于偶然事件而分開的同一基因庫(Hebertetal.,2003b)。

4.4 假基因

研究表明，當線粒體DNA整合進入核DNA后，由于假基因不參與編碼，失去了功能性限制的壓力，即3個位置上的堿基理論上擁有相同的突變率，不過，在同一核基因組內(nèi)，不同的插入序列進化程度不同，與其對應的線粒體基因相比，具有不同的進化模式。

在實際運用中，有一個特別需要注意的問題。由于線粒體基因的進化速度為核基因的10倍以上，因此，當線粒體基因整合進入核基因后，雖然不再參與編碼，突變速率會提高，但如果整合時間較近，它與真正線粒體COⅠ基因的差異未達到一個明顯的值，比如低于3%的時候，很容易將此個體當成是同種或隱藏種，而此時假基因的擁有者可能與鑒定結果已經(jīng)分化為不同的種，從而造成后續(xù)工作的偏差。最好的辨別假基因的辦法就是觀察其密碼子3個位點的堿基替代率。除此之外，也不排除父本mtDNA滲漏造成的異質(zhì)性，盡管此現(xiàn)象目前僅在高等動物中偶有發(fā)現(xiàn)(<0.004%)。

5 DNA條形碼的應用

5.1 物種的鑒定

應用條形碼可以對已知種類和新采標本進行快速準確的鑒定，這已經(jīng)在植物、動物等多個領域都得以證明。

在植物方面，由于COⅠ基因在植物中進化速率遠慢于在動物中的進化速率，不適合作為大多數(shù)植物的編碼基因，所以植物條形碼需要采用多個片段組合。當前多數(shù)研究者傾向于matK和trnH-psbA這兩個片段參與組合，而第3個片段將可能是Kim等提出的atpF-atpH或psbK-psbI片段(Folmeretal.,1994)。Kress等(2007)應用一段約450 bp葉綠體同源片段間隔區(qū)trnH-psbA 作為植物的條形碼并成功鑒定顯花植物。

在脊椎動物方面，生物學家們利用600多bp線粒體COⅠ基因?qū)︳~類、兩棲類、鳥類以及家養(yǎng)禽類進行分子鑒定，并成功將其在種的水平上進行分類(Vencesetal.,2005; Wardetal.,2005; 屠云潔等,2007; 雷忻等,2007)，為分類系統(tǒng)的研究提供了分子水平證據(jù)。

在無脊椎動物方面研究，主要集中在節(jié)肢動物門，如：Barrett等(2005)應用660 bp COⅠ基因序列，將168種蜘蛛和35種其他的蛛形綱動物100%準確區(qū)分開。Ball等(2005)應用630 bp COⅠ基因序列對蜉蝣目進行研究，結果顯示種內(nèi)和種間序列平均差異分別為1%和18%，DNA條形碼可以有效的區(qū)分蜉蝣目昆蟲。Shufran等(2000)和Anstead等(2002)分析麥二叉蚜SchizaphisgraminumCOⅠ基因的一段1.2 kbp序列，研究結果表明，應用COⅠ基因的一個片段序列能快速準確的鑒定蚜蟲物種。另外DNA條形碼技術在等翅目(Fosteretal.,2004)，跳蟲類(Hoggetal.,2004)和鞘翅目(Cardosoetal.,2005; Monaghanetal.,2005)等諸多領域均有應用。本文作者也已使用COⅠ基因?qū)ξ覈每浦饕孟x進行研究，并能成功在種的水平上進行鑒別(Wangetal.,2012)。

5.2 隱藏種的發(fā)現(xiàn)

在很多動物類群中都存在形態(tài)相似的隱存分類單元，這給分類學的研究帶來許多混亂，而增加了基因信息的DNA條形碼技術是發(fā)現(xiàn)隱存分類單元的有效途徑之一。如:在馬達加斯加熱帶水生甲蟲研究中，Monaghan等(2005)應用DNA序列在鑒定已記述種的同時發(fā)現(xiàn)了幾個隱藏種(Cryptic species)。Brown等(2003)結合形態(tài)學和DNA條形碼，發(fā)表巴布亞新幾內(nèi)亞的鱗翅目新種Xenothictisgnetivora；Hebert等(2004a)領導的研究小組對北美260種鳥類進行了DNA條形碼的序列分析。結果表明，每個鳥種都有一個獨有的條形碼，種間的變異平均是種內(nèi)變異的19～24倍。而且發(fā)現(xiàn)其中4種鳥分別出現(xiàn)了2種不同的COⅠ基因序列，這證明北美鳥類中發(fā)現(xiàn)了4個新種；另外，Hebert等(2004b)通過研究被認為屬于同一個種的2 500多只哥斯達黎加普通蝴蝶，發(fā)現(xiàn)這些蝴蝶的DNA條形碼很清楚地歸入不同的10個組中，說明這些蝴蝶應該屬于10個不同的種，而這些蝴蝶的成蟲單靠形態(tài)學特征無法區(qū)分，最后結合其顏色和食物偏好的不同，將這些蝴蝶分成10個不同的類群。

5.3 系統(tǒng)發(fā)育關系的探討

用于DNA條形碼的COⅠ基因，包含了一定的系統(tǒng)發(fā)育信息，可以用于探討近緣種或種群等低級階元的系統(tǒng)發(fā)育關系(Zhangetal.,1997)。目前，國內(nèi)外的研究也大都集中在節(jié)肢動物門以及扁形動物門等較為低等的生物類群上。各國專家利用COⅠ作為系統(tǒng)發(fā)育研究的工具，成功對魚類、節(jié)肢動物類及鉤蟲等的系統(tǒng)發(fā)育進行了深入的研究，成功證明了COⅠ在系統(tǒng)發(fā)育研究中的重要地位(Wardetal.,2005; 王劍峰等,2007; 師永霞等,2008)。

在實際運用中，DNA條形碼將在以下領域獲得應用：(1)以已描述過的物種為基礎，對農(nóng)業(yè)害蟲、寄生蟲、病原微生物或復雜的環(huán)境樣品進行鑒定(Kumaretal.,2007)；海關檢驗部門可利用這一科學的標準化鑒定工具對瀕危物種貿(mào)易進行監(jiān)控；在生物安全部門，可應用該技術用于入侵種鑒定和疾病傳播媒介的檢測(Armstrongetal.,2005)；亦可廣泛應用于法醫(yī)鑒定領域(Lorenzetal.,2005)。(2)以DNA序列聚類分析為基礎協(xié)助分類學家進行物種鑒定，輔助發(fā)現(xiàn)新的物種，同時為親緣關系、遺傳多樣性和物種定界等方面提供參考；該技術尤其適合對淡水、海洋和土壤中的小型底棲生物，以及以魚為代表的海洋生物進行研究，其在與熱帶地區(qū)生態(tài)環(huán)境有關的研究中受到的關注尤為明顯，如對熱帶雨林中昆蟲的多樣性進行調(diào)查等(Burnsetal.,2007b; Markmannetal.,2005; Shanderetal.,2005)。(3)其不受物種發(fā)育狀態(tài)的影響，可對不同階段的個體進行鑒定，尤其是對相似形態(tài)的物種進行鑒定，可提高生態(tài)研究的準確性和效率；在物種保護研究中，英國達爾文物種生存計劃一直在利用條形碼技術研究中美地區(qū)蘭花和仙人掌的保護優(yōu)先權(Rubinof,2006)。

6 關于DNA條形碼的爭議

DNA條形碼技術一提出就引起了很大的爭議，眾多專家在著名刊物上發(fā)表一系列相關文章對其進行熱烈的討論。許多學者對該技術的應用持肯定態(tài)度，認為DNA條形碼可以用于解決形態(tài)學難以鑒定甚至不能鑒定的物種，如寄生蟲以及他們的寄主蚊子，并且有助于界定物種界線和解釋物種進化關系。Janzen(2004)甚至認為，隨著DNA條形碼技術的發(fā)展，鑒定物種可以簡便到僅使用一個手機樣的儀器，就可以讓任何人得到他想鑒定物種的名稱。

但是，有學者持反對意見，他們認為DNA僅僅是數(shù)據(jù)，在校正不同長度的基因序列以及選擇適當基因時具有一定的主觀性，而且條形碼技術缺乏傳統(tǒng)理論基礎，可能將分類變得簡單，從而造成科學的倒退(Lipscombetal.,2003; Wheeler,2004)。在使用線粒體DNA對動物進行生物地理學和系統(tǒng)學分析時經(jīng)常會得到與形態(tài)學研究不一致的結論，特別是在醫(yī)學媒介害蟲和農(nóng)業(yè)害蟲等領域，這也使得研究者必須重新對研究對象在行為習性、生態(tài)和形態(tài)等方面的特征進行描述。首先，存在很多限制性因素，比如基因連鎖對線粒體DNA的選擇作用、性別對基因流會產(chǎn)生影響、如何保持祖先遺傳的多樣性、雜交會引起基因滲入、線粒體基因向細胞核轉(zhuǎn)移等，線粒體DNA變異尚不能成為物種界定的主要指標；其次，若忽略核基因?qū)z傳分化的作用，研究者將可能不會注意到那些由于分化選擇或多倍體形成等原因而產(chǎn)生的新的或快速分化的物種，從而片面地得出物種形成需要長期分離的結論。再者，很多標本由于用于提取DNA而被毀壞，從此也許不再存在，這對于傳統(tǒng)分類學模式標本的保存來說是個很大的損失(Scbrgetal.,2003)。Ebach 等(2005)認為分類學家的工作應該是提供給生物知識，而不是單純的核酸序列，因此DNA條形碼所產(chǎn)生的僅僅是信息，而不是知識，不能夠替代應用其他特征的分類(Willetal.,2004; Schindeletal.,2005a)。

總而言之，無論是對動物還是植物，條形碼研究最大的爭議還是在于是否單一的小片段600多堿基序列能給全球的物種編碼，尤其是能否適用于近緣和近期分化的物種，這也是DNA條形碼研究的難點。腔腸動物Cnidaria94.1%COⅠ序列差異小于2%的結果表明COⅠ不適于該類群的鑒定(Hebertetal.,2003b)，Sperling根據(jù)他所在實驗室一系列昆蟲COⅠ序列的數(shù)據(jù)，認為至少有1/4的物種是不容易用DNA條形碼的方法來區(qū)分的(Caterinoetal.,2000)，Vences等(2005)研究發(fā)現(xiàn)，馬達加斯加蛙類中18S rRNA的擴增效率為100%，而COⅠ則低，因為在種團和近緣種水平COⅠ的引物位點具有快速的變異率，在脊椎動物中18S rRNA引物位點具有高保守性；18S rRNA在馬達加斯加蛙類幼體和成體的種間差異1%～17%，種內(nèi)差異0%～1%，因此建議兩棲類動物編碼時使用線粒體18S rRNA。植物條形碼的分析方法也不夠成熟，需要生物信息學進一步發(fā)展開發(fā)出適合多片段和針對某些特殊片段(如trnH-psbA)的分析方法(寧淑萍等,2008)。而對于動物中的水母和海參，也有可能因為DNA的演化較慢而無法用DNA條形碼鑒定。對于這樣的類群可能應采用更多的分子標記(如SNP，SSR，AFLP等)來解決，而不是局限于少量片段的序列。Mallet等(2003)建議最好應用多個基因片段區(qū)分形態(tài)相近的物種。DNA條形碼僅靠單個基因片段可能會顯得力度不夠，同時要跟形態(tài)學數(shù)據(jù)結合起來，不能完全拋棄形態(tài)學手段(Lipscombetal.,2003; Tautzetal.,2003)。因此針對不同類群，選取不同的基因片段或者增加多個片段在某些時候也是十分必要的。

7 DNA條形碼研究展望

DNA條形碼既是分類專家的有力工具，也是那些需要進行物種鑒定的非專家的有益工具。DNA庫、序列標記和組織庫(分類憑證標本)是標準化條形碼目標實現(xiàn)的關鍵。大規(guī)模測序計劃會產(chǎn)生海量的數(shù)據(jù)，過去采用條形碼進行分類鑒定研究以DNA為基礎，目前又有了新的內(nèi)涵。同時，包括核核糖體DNA、質(zhì)體、較短的低拷貝核基因等多個基因位點在內(nèi)的多組成條形碼(multiple component barcode)的出現(xiàn)，將有效克服在植物物種定界和鑒定研究中由于經(jīng)常出現(xiàn)的雜交和多倍體事件所帶來的問題。另外。在真菌研究領域，新一代微型條形碼(micro-barcodes)技術的出現(xiàn)也受到了眾多學者的關注(Summerbell,2005)。

事實上，用DNA條形碼對物種進行鑒定與分類學家過去建立的物種命名法的物種概念是一致的。另一方面，新物種的發(fā)現(xiàn)是一項及其復雜的工作，因此并不能單獨地用DNA條形碼下定義。新物種的發(fā)現(xiàn)需要基于物種的概念，而且需要聯(lián)合別的資源數(shù)據(jù)——比如分子生物學、形態(tài)學、生態(tài)學、行為學等。但是，我們?nèi)匀粦撝赋龅氖牵珼NA序列是發(fā)現(xiàn)新物種的“領航者”。另外，現(xiàn)在DNA條形碼所使用的遺傳距離法還有很大的缺陷，特別是當用于界定物種邊界的時候。原因之一是線粒體DNA的進化速率在種內(nèi)和種間是不一樣的，而且不同的兩個屬會存在種內(nèi)和種間的重疊。當用遺傳距離法進行操作時，這些重疊可能會隱藏了序列中的一些重要信息，特別對一些研究不充分的分類群(Rachetal.,2008)。不過有理由相信，隨著條形碼序列數(shù)據(jù)的不斷積累及其研究范圍的不斷擴大，條形碼技術將逐漸實現(xiàn)與世界范圍內(nèi)其他分類學研究計劃的協(xié)調(diào)發(fā)展，作為一種物種鑒定工具，勢必在系統(tǒng)生物學、分類學和生態(tài)學等研究中得到廣泛應用。在農(nóng)業(yè)害蟲和醫(yī)學媒介害蟲的DNA條形碼研究方面，發(fā)展趨勢是將DNA芯片技術與DNA條形碼相結合(Plunderetal.,2004; Garaizaretal.,2006; Pepliesetal.,2006; Hebertetal.,2003b)，最終目標是建立一低成本、高通量快速、靈敏準確的成套檢測技術，通過快速分析一小段DNA，即可鑒定出地球上每一個植物和動物物種。DNA條形碼將使檢疫檢驗工作和科研更加高效，使過去專家才能掌握的知識更好的大眾化。

綜上所述，雖然DNA條形碼技術還受到部分專家的置疑以及存在一定的缺陷，但DNA序列信息的豐富性、唯一性和可重復性，都將使DNA條形碼成為分類學家的有用工具(Schindeletal.,2005b)，DNA條形碼技術也將成為生物分類發(fā)展的必然趨勢。