關(guān) 皎,朱鶴云

(吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林 吉林 132013)

·綜 述·

藥物代謝檢測技術(shù)的研究進展

Research progress on detection methods of drug metabolism

關(guān) 皎,朱鶴云*

(吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林 吉林 132013)

藥物代謝在新藥研發(fā)的各個階段都起著至關(guān)重要的作用，并且日益受到制藥行業(yè)的重視。本文以國內(nèi)外大量有代表性的文獻為依據(jù)進行分析、整理和歸納，介紹藥物代謝檢測技術(shù)的國內(nèi)外研究進展。

藥物代謝；檢測技術(shù)；進展

藥物代謝也稱生物轉(zhuǎn)，是指藥物被機體吸收后，在體內(nèi)各種酶以及體液環(huán)境作用下發(fā)生的一系列化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)上的轉(zhuǎn)變。近年來，我國的新藥創(chuàng)制快速發(fā)展，目前每年約有30余種新化學(xué)結(jié)構(gòu)藥物被批準(zhǔn)進行臨床試驗。美國作為制藥工業(yè)強國，每年進入臨床試驗的新藥多達1 000種以上。在新藥研發(fā)的各個階段，藥物代謝研究都起著重要的作用。在藥物發(fā)現(xiàn)中，進行代謝研究的目的是選擇吸收、分布、代謝和排泄性質(zhì)優(yōu)越的化合物，并剔除具有潛在風(fēng)險的化合物；在藥物開發(fā)中，進行代謝研究的目的是選定化合物在動物和人體內(nèi)處置的詳細(xì)數(shù)據(jù)。因此，自20世紀(jì)80年代起，藥物代謝研究受到制藥行業(yè)的高度重視，并越來越早地介入到藥物設(shè)計、篩選和評價中，成為新藥設(shè)計和開發(fā)各個階段的關(guān)鍵組成部分，使新藥開發(fā)階段由于藥動學(xué)原因?qū)е碌氖÷蕪慕?0%降至10%左右，提高了新藥研發(fā)的成功率，并降低了成本[1]。在探討藥物代謝特征、確定藥物代謝物結(jié)構(gòu)及代謝途徑、藥物及代謝物的藥理作用及毒副作用等藥物代謝研究方面，靈敏、準(zhǔn)確的檢測技術(shù)是必不可少的。本文以國內(nèi)外大量有代表性的文獻為依據(jù)進行分析、整理和歸納，綜述了藥物代謝檢測技術(shù)的國內(nèi)外研究進展。

1 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

商品化氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用儀出現(xiàn)于20世紀(jì)70年代，此后隨著衍生化GC方法及MS技術(shù)的發(fā)展，其在藥物代謝產(chǎn)物研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。但GC法對樣品的極性和熱穩(wěn)定性有一定的要求，而代謝物一般均具有極性基團，熔點高、揮發(fā)性差，因此需要先進行衍生化，再用GC-MS分析。此外，對于Ⅱ相代謝產(chǎn)物，由于其與葡萄糖醛酸、硫酸、谷胱甘肽、半胱氨酸等結(jié)合后不易完全衍生化或制成衍生物后結(jié)構(gòu)太大仍不易氣化，故其一般需先經(jīng)水解，然后進行衍生化，再用GC-MS分析[2]。

黃克建等[3]利用固相萃取/氣質(zhì)聯(lián)用(SPE/GC-MS)法對服用硝基安定的大鼠的尿液進行研究，檢出7-氨基硝基安定、7-乙酰氨基硝基安定以及硝基安定的雜環(huán)開環(huán)代謝物2-氨基-5硝基苯基苯甲酮；確定硝基安定在大鼠體內(nèi)至少存在2種代謝途徑：一是硝基安定7位硝基被還原為氨基，氨基再被乙?；?，二是硝基安定的雜環(huán)開環(huán)生成2-氨基-5硝基苯基苯甲酮。該課題組還采用GC-MS研究氯硝安定的代謝情況[4]，結(jié)果在大鼠尿液和志愿者尿液中均檢出7-乙酰氨基氯硝安定和7-氨基氯硝基安定；在大鼠血液中，主要檢出氯硝安定和7-氨基氯硝基安定；在大鼠肝組織中，主要檢出7-乙酰氨基氯硝安定，還有少量7-氨基氯硝安定和氯硝安定。張思敏等[5]通過對Wistar大鼠進行灌胃服用氯丙嗪后收集24 h內(nèi)尿樣，經(jīng)固相萃取凈化提取后，采用GC-MS(EI、PCI)檢測，對比空白尿液與陽性尿液萃取液的質(zhì)譜圖，并根據(jù)質(zhì)譜裂解規(guī)律鑒定其結(jié)構(gòu)，結(jié)果共檢測出16種代謝產(chǎn)物，其中2-氯吩噻嗪、丙嗪、去甲基氯丙嗪、7-羥基氯丙嗪和氯丙嗪亞砜為主要代謝產(chǎn)物。

2 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

雖然GC-MS是一種比較成熟的技術(shù)，在我國已有30多年的應(yīng)用歷史，但在醫(yī)藥研究領(lǐng)域中，由于大量藥物是極性較大的化合物，僅有約20%的藥物可用GC分析，其中多數(shù)還必須經(jīng)過衍生化步驟，因此局限性很大。為了彌補GC-MS難以分析強極性和難揮發(fā)性樣品這一不足，人們一直致力于其他色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的研究，其中最重要的就是液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)聯(lián)用技術(shù)。該技術(shù)以色譜進行分離，以MS為檢測手段，它集LC的高分離能力與MS的高靈敏度、強定性、專屬性于一體，可獲得復(fù)雜混合物中單一成分的質(zhì)譜圖。特別是近年來應(yīng)用愈加廣泛的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)聯(lián)用技術(shù)，其具有比MS/MS和LC-MS更優(yōu)越的性能。LC-MS/MS可在一級質(zhì)譜MS條件下獲得很強的待測組分的準(zhǔn)分子離子峰，幾乎不產(chǎn)生碎片離子，并可對準(zhǔn)分子離子進行多級裂解，進而獲得豐富的化合物碎片信息，可用來推斷化合物結(jié)構(gòu)、確認(rèn)目標(biāo)化合物、辨認(rèn)重疊色譜峰以及在高背景或干擾物存在的情況下對目標(biāo)化合物定量。因此LC-MS和LC-MS/MS技術(shù)已成為藥物代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定以及藥物代謝產(chǎn)物痕量分析中強有力的工具[6]。

在藥物代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定方面，Zhang Xia等[7]以人肝微粒體、人源HepG2細(xì)胞核人重組酶作為藥物代謝模型，研究狼毒乙素和新狼毒素A的代謝特性，推斷了狼毒乙素和新狼毒素A在人體的可能代謝途徑及代謝酶。王瑞等[8]應(yīng)用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(UPLC-QTOF-MS/MS)并輔以代謝數(shù)據(jù)采集和處理軟件，快速篩查了兩類新型非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑先導(dǎo)物DAPA-7012 和DAAN-4442 在大鼠肝微粒體的代謝產(chǎn)物，并分析結(jié)構(gòu)中的代謝軟點。

在藥物代謝產(chǎn)物痕量分析方面，周宛虹等[9]以氘代尼古丁、氘代可的寧、3-OH-氘代可的寧、氘代尼古丁葡萄糖醛酸復(fù)合物、氘代可的寧葡萄糖醛酸復(fù)合物、3-OH-氘代可的寧葡萄糖醛酸復(fù)合物作內(nèi)標(biāo)，在LC-MS/MS的大氣壓化學(xué)電離(APCI)離子化模式下,建立了快速檢測吸煙者尿液中尼古丁及其9種代謝物的方法，并對19個實際樣品進行了測試和判別分析。金經(jīng)等[10]采用柱前衍生化LC-MS/MS法同時測定人血漿中厄多司坦及其含巰基活性代謝物，并將該方法應(yīng)用于厄多司坦片人體藥動學(xué)研究，為合理制訂給藥方案提供了藥動學(xué)依據(jù)。

3 核磁共振及其聯(lián)用技術(shù)

雖然LC-MS和LC-MS/MS在藥物代謝的研究中已經(jīng)有廣泛的應(yīng)用，但LC-MS卻不能明確地鑒定具有光學(xué)和幾何異構(gòu)體以及同分異構(gòu)體的化合物結(jié)構(gòu)，一些不易離子化的極性化合物MS響應(yīng)很低，生物基質(zhì)也可能抑制化合物的離子化[11]，這些因素增加結(jié)構(gòu)鑒定的難度。因此，在某些研究中需要利用核磁共振(NMR)來研究化合物的結(jié)構(gòu)信息。特別是近年來隨著核磁共振儀在靈敏度、分辨率、動態(tài)范圍等方面技術(shù)的提高，以及計算機技術(shù)在NMR測定中的應(yīng)用，NMR技術(shù)已經(jīng)成為測定分子結(jié)構(gòu)的最有效工具，利用NMR技術(shù)對代謝組分進行檢測，研究這些組分的NMR圖譜，可得到相應(yīng)的代謝物信息，綜合分析這些信息所反映的生物學(xué)意義，可以了解生物體代謝的規(guī)律。但如果單用NMR分析生物樣品時,氫譜中會出現(xiàn)大量的包括內(nèi)源性雜質(zhì)在內(nèi)的信息，很難分辨出哪些是代謝物的信號。所以有必要將色譜分離技術(shù)與NMR技術(shù)以及其他技術(shù)進行在線的聯(lián)用，使色譜分離與光譜鑒定成為一個連續(xù)的過程，成為代謝物結(jié)構(gòu)鑒定的針對性工具。目前，正處于快速發(fā)展階段的NMR聯(lián)用技術(shù)主要包括固相萃取-核磁共振聯(lián)用(SPE-NMR)、液相色譜-核磁共振聯(lián)用(LC-NMR)、液相色譜-核磁共振-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-NMR-MS)、毛細(xì)管電泳-核磁共振聯(lián)用(CE-NMR)、毛細(xì)管電色譜-核磁共振聯(lián)用(CEC-NMR)、毛細(xì)管電泳-核磁共振-質(zhì)譜聯(lián)用(CE-NMR-MS)、液相色譜-紅外光譜-核磁共振-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-FT/IR-NMR-MS)、超臨界色譜-核磁共振聯(lián)用(SFC-NMR)等[12]。

3.1 固相萃取-核磁共振聯(lián)用

固相萃取(SPE)的原理是利用樣品在固定相和流動相之間的分配系數(shù)不同以達到分離不同組分的目的。由于生物樣品中存在大量內(nèi)源性物質(zhì)，往往對藥物及其代謝產(chǎn)物產(chǎn)生干擾，使得核磁共振儀難以直接檢測出生物樣品，用SPE技術(shù)可以方便的分離掉生物樣品中的內(nèi)源性物質(zhì)。SPE的一個突出特點是可以富集樣品，這種方法花費便宜，不要求HPLC等色譜法中優(yōu)化分離的條件，并且由于大部分內(nèi)源性物質(zhì)可被除去，使圖譜的解析變得容易。實驗中200 MHz和300 MHz NMR就可以用來進行檢測，因此20世紀(jì)80年代以來很多藥物代謝的研究都采用這種方法。

楊春等[12]利用SPE-NMR技術(shù)在未將代謝產(chǎn)物完全分離的情況下，通過代謝物與原藥不同特點的特征峰，推斷出代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)或代謝片段。從大鼠尿液中檢測出乙哌立松ω-1位羥基化、羰基還原成羥基、氮脫烷基并氧化脫羧和氮脫烷基及再脫水等3個主要代謝產(chǎn)物和一個代謝片段，其中氮脫烷基并氧化脫羧形成烷烴片段和末端羥基化代謝產(chǎn)物為新發(fā)現(xiàn)的代謝產(chǎn)物。

3.2 液相色譜-核磁共振聯(lián)用

LC-NMR聯(lián)用技術(shù)是由液相色譜提供分離技術(shù)，核磁共振儀提供結(jié)構(gòu)解析技術(shù)，從復(fù)雜的藥物代謝產(chǎn)物獲得單一組分的圖譜進行結(jié)構(gòu)推測。解決了固相萃取對于結(jié)構(gòu)復(fù)雜的藥物代謝產(chǎn)物的鑒定困難的問題。隨著核磁共振儀磁場強度的增強，靈敏度有了很大的提高，溶劑峰抑制技術(shù)的不斷完善，促進了LC-NMR 聯(lián)用技術(shù)在藥物代謝研究中的發(fā)展。并且與常規(guī)的代謝物分離鑒定方法相比，LC-NMR法省時,尤其適用于不穩(wěn)定化合物，無需復(fù)雜的預(yù)處理，可避免使用放射性標(biāo)記物質(zhì)。

Cloarec等[13]使用LC-Cryprobes(低溫探頭)-NMR聯(lián)用進行生物樣品中代謝物和代謝組學(xué)研究。Vita等[14]采用LC-UV-NMR進行大鼠注射嘌呤類藥物Roscovitine后組織中的3個代謝物結(jié)構(gòu)鑒定、分布，并對代謝物進行動態(tài)研究。

3.3 液相色譜-核磁共振-質(zhì)譜聯(lián)用

當(dāng)使用LC-NMR確定未知物結(jié)構(gòu)時,常需要用其他方法進一步證實。目前最新的技術(shù)是將LC、NMR和MS三種儀器在線聯(lián)合使用，形成LC-NMR-MS在線系統(tǒng)，它是進行藥物代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)等方面的研究的有力工具。這種聯(lián)用技術(shù)實際上是兩種檢測手段(NMR和MS)的相互補充，具有以下優(yōu)點[15]：(1)它同時能得到化合物的UV、NMR和MS信息,為解析復(fù)雜的藥物代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)提供了全面的信息；(2)硫酸鹽等結(jié)合而生成的代謝產(chǎn)物只有通過NMR和MS信息才能共同確定它的結(jié)構(gòu)；(3)許多通過其他方法無法測定的內(nèi)源性代謝物也能用此聯(lián)用技術(shù)檢測出來。

Godejohann等[16]利用LC-SPE-NMR-MS和低溫探頭技術(shù)研究了人尿中對乙酰氨基酚的代謝物，并鑒定了一種微量的新代謝產(chǎn)物ether glucuronide of 3-methoxy-paracetamol。Kammerer等[17]利用LC-Qq-TOF-MS和600 MHz LC-SPE-cryprobes-NMR-MS研究了小鼠肝微粒體中選擇性p38MAP激酶抑制劑ML3403的代謝物的結(jié)構(gòu)，共鑒定出了8個代謝物，并研究了它們在小鼠體內(nèi)的代謝過程。

4 毛細(xì)管電泳技術(shù)

毛細(xì)管電泳(CE)技術(shù)是近年來發(fā)展較快的一種檢測方法，它是一類以毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流電場為驅(qū)動力的新型液相分離分析技術(shù)。與傳統(tǒng)的分離分析方法相比，CE由于其分離效率高、分析速度快、樣品消耗少及操作成本低等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用在生物化學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、環(huán)境科學(xué)等多種領(lǐng)域[18]。

王秀中等[19-20]采用兩步固相萃取法結(jié)合無膠篩分毛細(xì)管電泳技術(shù)測定單次和多次給藥后獼猴血漿中的反義寡核苷酸藥物癌泰得及其代謝產(chǎn)物M1和M2的血藥濃度，揭示癌泰得及其代謝產(chǎn)物在獼猴體內(nèi)的代謝清除過程，為將來的臨床試驗提供參考。李旭菲等[21]建立了同時檢測家犬尿樣中氯丙嗪、異丙嗪及其主要代謝物氯丙嗪亞砜、異丙嗪亞砜的毛細(xì)管電泳電致化學(xué)發(fā)光的方法，該方法簡便、快速、靈敏、進樣量少，不受共存物干擾，可在不必預(yù)分離的情況下直接同時連續(xù)測定。

5 展 望

對藥物代謝產(chǎn)物的檢測、結(jié)構(gòu)鑒定和定量已經(jīng)成為新藥研發(fā)過程中一個重要組成部分，隨著人們對藥物代謝的深入研究，如代謝機制的推測以及痕量代謝產(chǎn)物的測定等，對檢測技術(shù)的要求也越來越高。各種檢測技術(shù)的不斷發(fā)展以及各種聯(lián)用技術(shù)的產(chǎn)生，使藥物代謝檢測技術(shù)朝著更快、更靈敏、更準(zhǔn)確的方向發(fā)展，這種發(fā)展將會使藥物代謝與結(jié)構(gòu)鑒定方面取得更大的突破，進而大大加速新型藥物的研究與開發(fā)。

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1673-2995(2014)01-0058-04

關(guān) 皎(1983-)，女(漢族)，講師，在讀博士.

朱鶴云(1982-)，男(漢族)，講師，在讀博士.

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2013-09-06)